Постановка ртга на грипп

Обновлено: 27.03.2024

Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину гриппозную инактивированную (вакцину цельновирионную, которая представляет собой цельный вирус; вакцину расщепленную (сплит-вакцину), которая состоит преимущественно из разрушенных вирусных частиц; вакцину субъединичную, которая содержит в основном поверхностные антигены вируса гриппа: гемагглютинин и нейраминидазу). Антигены получают из очищенного вируса или очищенных вирусов гриппа типов А и В, одного, двух, трех или четырех штаммов, выращенных раздельно в развивающихся куриных эмбрионах.

Вакцина может содержать адъювант и консервант.

Производство

Производство вакцины включает ряд последовательных стадий с обязательным внутрипроизводственным контролем: получение главного и рабочего посевных материалов; накопление вируса; очистку и концентрацию; расщепление вируса (при необходимости); производство препарата; маркировку; фасовку. На каждой стадии должны быть предусмотрены: система и схема анализа показателей качества в ходе технологического процесса и испытания конечного продукта; соблюдение условий и сроков хранения промежуточных и конечного продукта, обеспечивающее стабильность качества в течение срока годности продукта.

Штаммовый состав вакцин ежегодно рекомендуется ВОЗ и национальной Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам. Для каждого нового штамма необходима валидация процесса расщепления вируса в моновалентном препарате сплит-вакцины и подтверждение наличия преимущественного содержания гемагглютинина и нейраминидазы в субъединичных моновакцинах. Производственные штаммы должны соответствовать по антигенной структуре вирусов гриппа подтипов и и типа В на текущий эпидемический сезон, с известной историей пассажей и источника выделения.

В случае использования в производстве в течение более одного эпидемического сезона производственные штаммы должны контролироваться не реже 1 раза в год.

Куриные эмбрионы должны быть получены из птицеводческих хозяйств, благополучных по возбудителям, патогенным для человека. Качество поставляемых эмбрионов должно быть подтверждено ветеринарными свидетельствами, должно соответствовать требованиям ОФС "Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов" и ОФС "Вирусная безопасность".

Все производственные процессы, технологическое оборудование и методы контроля должны быть валидированы и должны осуществляться с соблюдением установленных требований к правилам организации производства и контроля качества лекарственного препарата, гарантирующих его качество и безопасность для человека. Производство вакцины должно проводиться в помещениях, исключающих работу с другими патогенными микроорганизмами и антибиотиками. Не допускается производство препарата на территории, на которой расположены производственные здания по производству антибиотиков, если не соблюдены требования к защитным зонам, согласно действующим санитарным правилам. Обязательным условием технологического процесса производства вакцины является соблюдение поточности, исключающей возможность перекреста промежуточных продуктов и полуфабрикатов, получаемых на разных стадиях производства, и их контаминацию посторонними веществами, в первую очередь посторонней микрофлорой.

Работа с живым и инактивированным вирусом должна проводиться в разных помещениях. Качество исходного сырья и материалов, используемых в производстве, должно быть подтверждено соответствующими документами (допустимо использование компонентов только фармакопейного качества). В состав вакцины должны входить вспомогательные компоненты, разрешенные к медицинскому применению и в дозах, не вызывающих токсические, аллергические или иные нежелательные реакции у человека.

Из главного посевного материала готовят рабочий посевной материал (посевной вирус), который должен быть представлен не более чем 15 пассажем от соответствующего производственного штамма. Финальный сбор представляет собой первый пассаж от рабочего посевного вируса.

Пенициллин или стрептомицин нельзя использовать ни на одной из стадий производства.

Испытания

Описание. Бесцветная или опалесцирующая желтоватая жидкость. Определение проводят визуально.

Подлинность. Каждый подтип и тип антигена должен нейтрализоваться гомологичной сывороткой. Титр с гетерологичной сывороткой должен быть ниже титра с гомологичной сывороткой не менее, чем в 4 раза. Определение проводят на стадиях получения полуфабрикатов: объединенного вирусного концентрата или моновакцины в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Метод постановки РТГА с вирусом гриппа (макрометод). РТГА применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител. Постановка РТГА включает следующие этапы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в реакции гемагглютинации (РГА) и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции. Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

- исследуемый антиген (субъединичная моновакцина, вируссодержащая жидкость - аллантоисная или культуральная);

- иммунные/диагностические сыворотки к различным типам (А и В) и подтипам типа А вируса гриппа;

- фосфатный буферный раствор рН 7,20,2 (ФБР);

- суспензия куриных эритроцитов, 1%.

1. Приготовление взвеси куриных эритроцитов. Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцевой вены.

Свежеполученную кровь от 3-5 петухов помещают во флакон со стеклянными бусами или с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5%-й раствор натрия цитрата). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона со стеклянными бусами в течение 5-7 мин при температуре (205)°С до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают ФБР путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 5 мин или 800200 об/мин в течение (155) мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100%, готовят 1% суспензию куриных эритроцитов по объему.

2. Определение гемагглютинирующего титра антигена. В лунках агглютинационного планшета готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,4 мл на фосфатном буферном растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1% суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшета и оставляют при температуре (205)°С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в отрицательном контроле).

Реакцию оценивают по "четырехкрестовой" системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (+++ или ++++).

Определение титра антигена сопровождается отрицательным контролем на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. С этой целью в контрольную лунку того же агглютинационного планшета вносят 0,4 мл фосфатного буферного раствора и 0,4 мл 1% суспензии эритроцитов. При отсутствии спонтанной агглютинации на дне лунки выпадает гомогенный с ровными краями осадок эритроцитов (отрицательная реакция).

3. Приготовление рабочей дозы антигена. В РТГА рабочей дозой антигена является то разведение антигена, в 0,2 мл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (4 АЕ). Для вычисления ее следует установленную величину титра антигена разделить на 8. Полученная цифра указывает во сколько раз нужно развести антиген, чтобы в 0,2 мл его содержалось 4 АЕ (рабочая доза).

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (4 АЕ). Для этого в пять лунок горизонтального ряда агглютинационного планшета, начиная со второй, вносят по 0,2 мл фосфатного буферного раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 0,2 мл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания переносят 0,2 мл смеси из лунки в лунку, начиная со 2-й по 5-ю лунку, из 5-й лунки 0,2 мл удаляют. Затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл фосфатного буферного раствора и по 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. В 6-й лунке ставят контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре (205)°С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле).

При правильном выборе рабочей дозы полная (++++) агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в первых трех лунках. В 4-й и 5-й лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного выше, разведение антигена должно быть изменено путем добавления соответствующего количества антигена или фосфатного буферного раствора для получения необходимой рабочей дозы. При этом необходимо повторно проверить правильность приготовления рабочей дозы.

4. Постановка реакции торможения гемагглютинации. Готовят двукратные разведения сывороток в лунках агглютинационного планшета, начиная с 1:10 до 1:640 и выше в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл рабочей дозы антигена (4 АЕ). Смесь встряхивают и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре (205)°С в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают, оставляют при температуре (205)°С в течение 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции.

При наличии в сыворотке специфических антител наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр сыворотки принимают предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Задержка гемагглютинации указывает на соответствие типа антигена и взятой сыворотки; отсутствие задержки гемагглютинации свидетельствует о несоответствии типа взятой сыворотки антигену.

* При исследовании сывороток привитых в РТГА (изучение иммуногенности вакцины) следует учитывать, что сыворотки людей содержат различные полисахариды, которые могут связывать гемагглютинин вируса гриппа и затруднять связывание специфических гриппозных гемагглютинирующих антител. Для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации образцы сыворотки обрабатывают при помощи нейраминидазы холерных вибрионов или ферментом RDE (receptor destroying enzyme).

При наличии готового реактива необходимо следовать требованиям, изложенным в инструкции по применению.

При необходимости длительного хранения обработанную сыворотку (разведение 1:10) хранят при температуре не выше минус 20°С.

Приготовление 0,1 М раствора фосфатного буферного (рН 7,20,2).


Раствор 1. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 17,8 г натрия фосфата двузамещенного 2-водного (), растворяют в 500 мл воды очищенной, доводят объём раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.


Раствор 2. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 15,6 г натрия фосфата однозамещённого 2-водного (), растворяют в 500 мл воды очищенной, доводят объём раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 720 мл раствора 1, прибавляют 280 мл раствора 2 и перемешивают. Затем в мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 100 мл приготовленного 0,1 М фосфатного буферного раствора доводят объём раствора водой очищенной до метки, перемешивают, прибавляют 8,5 г натрия хлорида и вновь перемешивают. рН полученного раствора должен быть 7,20,02. Если показатель рН выше или ниже требуемого, его соответственно доводят 1 М раствором хлористоводородной кислоты или 1 М раствором натрия гидроксида.

Приготовление раствора Альсевера

- 0,42% натрия хлорида;

- 0,8% натрия цитрата;

- 100,0 мл воды очищенной.

рН раствора доводят с помощью 5% раствора лимонной кислоты до рН 5,6 (примерно 10 мл 5% раствора лимонной кислоты на 1 л раствора Альсевера). Раствор стерилизуют фильтрацией или автоклавированием в течение 3 последовательных дней при температуре 100°С и давлении 0,7 атм. Для консервирования добавляют на 1 мл крови 1,2 мл раствора Альсевера. В данном растворе эритроциты могут храниться при температуре (42)°С в течение 1-2 нед. Перед использованием эритроциты необходимо трехкратно отмыть фосфатным буферным раствором с помощью центрифугирования при (800200) об/мин в течение 10 мин.

Приготовление консервирующего 5% раствора натрия цитрата.

5% раствор натрия цитрата перед использованием разводят в 2 раза 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,20,2). К одной части полученного раствора натрия цитрата добавляют 2 части крови петухов. В данном растворе эритроциты могут храниться при температуре (42)°С в течение 3-5 сут.

Метод постановки РТГА с вирусом гриппа (микрометод). Принцип метода, его учет и ингредиенты, те же, что и для проведения РТГА макрометодом. Отличие методов заключается в изменении концентрации и объемов ингредиентов.

Реакцию ставят в микропланшетах с "V"-образными лунками.

1. Приготовление 0,5% взвеси куриных эритроцитов. Взвесь готовят из 1%-й суспензии эритроцитов (см. макрометод) разведением ее в 2 раза фосфатным буферным раствором.

2. Определение гемагглютинирующего титра антигена. В каждую лунку микропланшета одного ряда вносят фосфатный буферный раствор в объеме 50 мкл. Затем в первую лунку вносят 50 мкл антигена в разведении 1:10 и далее проводят титрование по принципу двукратного разведения. Из последней лунки удаляют 50 мкл. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5%-й суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и оставляют при температуре (205)°С на 40-45 мин до оседания эритроцитов в контроле.

Реакцию оценивают по "четырехкрестовой" системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (+++ или ++++).

Определение титра антигена сопровождается постановкой отрицательного контроля на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов.

3. Приготовление рабочей дозы антигена. Рабочая доза антигена при постановке РТГА микрометодом равна 8 АЕ. Для её расчета и последующего приготовления гемагглютинирующий титр делят на 16. Полученное значение указывает, во сколько раз необходимо развести антиген.

Пример: титр антигена равен 160. Разделив 160 на 16, получаем цифру 10, указывающую на то, что антиген необходимо развести в 10 раз.

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (8 АЕ). Для этого в шесть лунок микропланшета, начиная со второй, вносят по 25 мкл фосфатного буферного раствора. В 1 и 2 лунки добавляют по 25 мкл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания 25 мкл смеси переносят из 2 лунки в 3, из 3 - в 4 и т.д. Из последней лунки панели 25 мкл удаляют. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл фосфатного буферного раствора и по 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре (205)°С на 40-45 мин до оседания эритроцитов в контроле.

При правильном выборе рабочей дозы агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в четырех лунках микропланшета. В остальных лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного результата добавляют антиген или фосфатный буферный раствор для получения необходимой рабочей дозы.

4. Постановка реакции торможения гемагглютинации. Метод постановки реакции микрометодом соответствует таковому, описанному для макрометода, за исключением объемов используемых ингредиентов реакции.

Готовят двукратные разведения сыворотки в объеме 25 мкл, вносят рабочую дозу антигена (8 АЕ) в объеме 25 мкл и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре (205)°С в каждую лунку панели вносят по 50 мкл 0,5% взвеси эритроцитов. После оседания эритроцитов в контроле (как правило, через 40-45 мин) проводят учет результатов.

Выявление противовирусных антител ( AT ) в сыворотке крови. РТГА. РСК. РИФ. Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител.

Более простой и доступный подход — выявление противовирусных антител ( AT ) в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2~3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период рекон-валесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.

Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать антитела ( AT ), образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую — в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.

РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные антитела ( AT ) в сыворотке больного.

Выявление противовирусных антител ( AT ) в сыворотке крови. РТГА. РСК. РИФ

РСК — основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.

РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.

Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител

Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации несвязавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наи- большее распространение нашёл метод иммуноблотннга.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Диагностика гриппа. Лечение гриппа. Профилактика гриппа.

Материалы для исследования при гриппе — смывы и мазки из носоглотки, мазки-отпечатки из носовой полости и кровь.

Основные методы диагностики гриппа — вирусоскопические, вирусологические и серологические. К методом экспресс-диагностики гриппа относят определение Аг вируса в мазках-отпечатках из носа и смывов носоглотки в РИФ и ИФА.

Выделение возбудителя гриппа проводят заражением 10-11-суточных куриных эмбрионов или, реже, различных клеточных культур. Вирусы гриппа проявляют слабый цитопатический эффект и чаще определяют феномен гемадсорбции. Типовую принадлежность вирусов идентифицируют в РСК; подтип гемагглютинина — в РТГА (вирусы гриппа агглютинируют эритроциты человека и различных животных); подтип нейраминидазы — в реакции ингибирования активности фермента.

Диагностика гриппа. Лечение гриппа. Профилактика гриппа

Лечение гриппа

Препараты выбора при лечении гриппа —- амантадин или ремантадин, ИФН и его индукторы, противогриппозный у-глобулин. Терапевтические мероприятия следует начинать как можно раньше.

Профилактика гриппа. Иммунопрофилактика гриппа.

Разработаны методы активной и пассивной иммунопрофилактики гриппа. Для пассивной иммунизации применяют противогриппозный иммуноглобулин человека, приготовленный из крови доноров, иммунизированных гриппозными вакцинами.

Для активной иммунизации против гриппа применяют живые и инактивированные вакцины. Живые аттенуироеанные вакцины проявляют большую иммуногенность. Инактивированные вакцины включают вирионные (приготовлены из высоко-очищенных культур вирусов), субвирионные или расщеплённые (получают обработкой высоко-очищенных культур вирусов детергентами), субъединичные (содержат только гемагглютинин и нейраминидазу) препараты. Вакцинацию осуществляют в периоды наибольшего риска развития эпидемий. Она в большей степени показана лицам младшего и преклонного возраста, страдающим обструктивными лёгочными и сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также сотрудникам ЛПУ.

Применение убитых вакцин от гриппа требует ежегодной ревакцинации; их эффективность не превышает 60-70%. Поскольку антигенные вариации возбудителя наблюдают часто, то набор Аг соответствующего вируса для иммунизации может быть определён только после начала вспышки заболевания.

3.3.2. МЕДИЦИНСКИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов
для профилактики и диагностики гриппа

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ: Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (Т.А.Бектимиров, Н.И.Лонская, Л.В.Агафонова, Н.Кастрикина, Н.А.Озерецковский, Н.В.Медуницын, А.А.Мовсесянц); Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (Г.Ф.Лазикова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации (протокол N 19 от 19 сентября 2003 г.).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 28.09.03.

4. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН "Методических указаний по проведению контроля противогриппозных препаратов" от 16.11.84, утв. начальником Главного управления карантинных инфекций МЗ СССР В.П.Сергиевым.

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа с целью установления их эффективности и безопасности.

Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и организаций, осуществляющих определение показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа.

2. Общие положения

Целью введения настоящих методических указаний является регламентация методов определения показателей качества противогриппозных препаратов на их соответствие требованиям нормативных документов.

Методические указания содержат описание общих методов определения показателей качества противогриппозных препаратов. Особенности методов оценки качества противогриппозных препаратов, не охватываемые настоящим документом, описаны в документах на эти препараты.

Задачей проведения контроля является установление эффективности и безопасности противогриппозных препаратов.

3. Метод постановки реакции торможения гемагглютинации с вирусом гриппа


3.1. Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
с вирусом гриппа (макрометод)

Реакцию торможения гемагглютинации применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител.

Постановка РТГА включает следующие этапы работы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции.

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

- антиген (вакцина, вируссодержащая жидкость - аллантоисная или культуральная);

- иммунные сыворотки к различным вирусам гриппа;

- буферно-солевой раствор рН 7,2±0,2 (Na-фосфатный буфер 0,01 M c 0,16 M NaCl);

- взвесь куриных эритроцитов, 1%.

3.1.1. Приготовление взвеси куриных эритроцитов

Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцовой вены.

Свежеполученную от 3-5 петухов кровь помещают во флакон со стеклянными бусами или же с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5%-ный раствор лимонно-кислого натрия). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона в течение 5-7 мин при температуре (20±2) °С до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают буферно-солевым раствором (на 1 объем крови - 4 объема буферно-солевого р-ра) путем центрифугирования при (800±200) об./мин в течение (15±5) мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100%, готовят 1%-ную суспензию куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования на ФЭК-56.

3.1.2. Приготовление 1%-ной суспензии куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования

Для получения стандартных концентраций эритроцитарных суспензий рекомендуется использовать фотометрический метод, позволяющий определять их концентрацию по величине оптической плотности. Основанием для этого служит наличие линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией эритроцитов в определенном интервале концентраций - от 0,15 до 1,00%.

Величину оптической плотности для 1%-ной суспензии куриных эритроцитов определяют экспериментально, в ряду нескольких (~20) параллельных проб с последующим вычислением среднеарифметической величины, принимаемой за исходный показатель оптической плотности.

3.1.3. Определение показателя оптической плотности 1%-ной суспензии куриных эритроцитов


Для приготовления одной пробы отбирают градуированной пипеткой 0,2 мл осадка эритроцитов в емкость, содержащую 19,8 мл буферно-солевого раствора; содержимое тщательно перемешивают, заполняют им объем прямоугольной кюветы фотоколориметра (толщина слоя =1 мм) и немедленно измеряют оптическую плотность суспензии при длине волны нм.

В качестве контрольного раствора используют дистиллированную воду, предварительно заполняя ею объем второй такой же кюветы ФЭК.

3.1.4. Приготовление 1%-ной суспензии куриных эритроцитов по показателю оптической плотности

Готовят требуемое количество суспензии куриных эритроцитов несколько большей, чем 1%-ной концентрации. Добавлением буферно-солевого раствора рН 7,2±0,2 к полученной суспензии и измерением оптической плотности ее на ФЭК доводят концентрацию суспензии до такой, показатель оптической плотности которой равен величине, определенной ранее (п.3.1.2).

Примечание. Поскольку значение оптической плотности суспензии эритроцитов может изменяться в зависимости от качества эритроцитов (на что влияет сезон года, климатические условия, состояние и возраст животных и т.п.), а также зависит от технических характеристик измерительного прибора (ФЭК), величину оптической плотности 1%-ной суспензии куриных эритроцитов следует определять периодически (1 раз в 3-4 месяца) и на одном и том же приборе.

3.1.5. Определение гемагглютинирующего титра антигена

В лунках плексигласовой планшеты готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,4 мл на буферно-солевом растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1%-ной суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшеты и оставляют при температуре (20±2) °С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле, см. ниже).

Реакцию оценивают по четырехкрестовой системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (1АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (3 или 4 креста).

Определение титра антигена сопровождается отрицательным контролем на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. С этой целью в контрольную лунку той же плексигласовой доски вносят 0,4 мл буферно-солевого раствора и 0,4 мл 1%-ной суспензии эритроцитов. При отсутствии спонтанной агглютинации на дне лунки выпадает гомогенный с ровными краями осадок эритроцитов (отрицательная реакция).

3.1.6. Приготовление рабочей дозы антигена

В РТГА рабочей дозой антигена является то разведение антигена, в 0,2 мл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (4 АЕ). Для вычисления ее следует установленную величину титра антигена разделить на 8. Полученная от деления цифра указывает, во сколько раз нужно развести антиген, чтобы в 0,2 мл его содержалось 4 АЕ (рабочая доза).

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (4 АЕ). Для этого в пять лунок горизонтального ряда плексигласовой доски, начиная со второй, вносят по 0,2 мл буферно-солевого раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 0,2 мл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания переносят 0,2 мл смеси из 2-й лунки в 3-ю, из 3-й - в 4-ю, из 4-й - в 5-ю, из 5-й лунки 0,2 мл удаляют. Затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл буферно-солевого раствора и по 0,4 мл 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. В 6-й лунке ставят контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов (см. выше). После встряхивания смесь оставляют при температуре (20±2) °С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле).

При правильном выборе рабочей дозы полная (++++) агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в первых трех лунках. В 4-й и 5-й лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного выше разведение антигена должно быть изменено путем добавления соответствующего количества антигена или буферно-солевого раствора для получения необходимой рабочей дозы. При этом необходимо повторно проверить правильность приготовления рабочей дозы.

3.1.7. Постановка реакции торможения гемагглютинации

Сыворотки, используемые в РТГА, могут содержать неспецифические ингибиторы гемагглютинации. Поэтому для их удаления перед постановкой РТГА сыворотки необходимо обработать нейраминидазой холерных вибрионов (см. примеч.).

После удаления неспецифических ингибиторов готовят двукратные разведения сывороток в лунках плексигласовой доски, начиная с 1:10 до 1:640 и выше в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл рабочей дозы антигена (4 АЕ). Смесь встряхивают, оставляют при температуре (20±2) °С на 30 мин, затем в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают, оставляют при температуре (20±2) °С в течение 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции (п.4.1.6).

При наличии специфических антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр сыворотки принимают предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Задержка гемагглютинации указывает на соответствие типа антигена и взятой сыворотки; отсутствие задержки гемагглютинации свидетельствует о несоответствии типа взятой сыворотки.

Препарат считают специфичным, если он не реагирует в РТГА с гетерологичной сывороткой.

Примечание. Удаление неспецифических ингибиторов гемагглютинации из иммунных сывороток с помощью нейраминидазы холерных вибрионов.

При наличии инструкции по применению нейраминидазы необходимо следовать требованиям, изложенным в данном документе.

Метод основан на способности нейраминидазы холерных вибрионов, не действуя на специфические антитела, разрушать ингибиторы гемагглютинации к вирусам гриппа А и В в сыворотках крови человека, кур, крыс, кролика.

Содержимое ампулы (1 мл лиофилизированного препарата нейраминидазы холерных вибрионов) растворяют в 1 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Готовят рабочее разведение препарата в буферно-солевом растворе, равное 1:50. В разведенном виде препарат хранят в холодильнике при температуре (4±20*) °С не более 3 суток.

* Соответствует оригиналу. - Примечание "КОДЕКС".

К 0,1 мл цельной сыворотки добавляют 0,5 мл нейраминидазы в рабочем разведении 1:50.

Смесь ставят на 18 ч в термостат при (36±0,5) °С.

Смесь прогревают при (56±10) °С в водяной бане в течение 1 ч.

К смеси (сыворотка плюс нейраминидаза) добавляют 0,4 мл буферно-солевого раствора, чтобы получить разведение сыворотки 1:10.

Сыворотка, обработанная нейраминидазой, может быть использована для РТГА в течение 2 недель при условии хранения ее при температуре (5±1) °С.

3.1.8. Приготовление растворов

Приготовление буферно-солевого раствора рН 7,2±0,2
(0,01 М Na-фосфатный буфер, содержащий 0,15 M NaCI):

- 26,8 г двузамещенного натрия NaHPO·7HO растворяют в дистиллированной воде и объем в мерной колбе доводят до 1 л (0,1 М NaHPO);

- 13,8 г однозамещенного натрия NaHPO·HO растворяют в дистиллированной воде и объем в мерной колбе доводят до 1 л (0,1 М NaHPO);

- к 720 мл 0,1 М раствора NaHPO добавляют 280 мл 0,1 М раствора NaHPO; рН такого раствора должен быть равным 7,2±0,05;

- 100 мл полученного 0,1 М Na-фосфатного буфера разбавляют дистиллированной водой до 1 л и добавляют 8,5 г хлористого натрия (NaCl); рН полученного раствора - 7,2±0,05. Если рН выше или ниже требуемого, добавляют 1 N раствор HCl или 1 N раствор NaOH, соответственно.

Приготовление раствора Альсевера

- 0,42% натрия хлорида;

- 0,8% натрия цитрата;

- 100,0 мл бидистиллированной воды.

Реакцию среды раствора доводят с помощью 5%-ной лимонной кислоты до рН от 6,15 до 5,6 (примерно 10 мл кислоты на 1 л раствора). Стерилизуют фильтрацией или автоклавированием в течение 3 последовательных дней при 100 °С и 0,7 атм. Для консервирования добавляют на 1 мл крови 1,2 мл раствора Альсевера.

В этом виде эритроциты можно хранить при (4±2) °С в течение 1-2 недель. Перед употреблением их необходимо трехкратно отмыть буферно-солевым раствором с помощью центрифугирования при (800±200) об./мин в течение 10 мин.


3.1. Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
с вирусом гриппа (макрометод)

Реакцию торможения гемагглютинации применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител.

Постановка РТГА включает следующие этапы работы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции.

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

- антиген (вакцина, вируссодержащая жидкость - аллантоисная или культуральная);

- иммунные сыворотки к различным вирусам гриппа;

- буферно-солевой раствор рН 7,2±0,2 (Na-фосфатный буфер 0,01 M c 0,16 M NaCl);

- взвесь куриных эритроцитов, 1%.

3.1.1. Приготовление взвеси куриных эритроцитов

Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцовой вены.

Свежеполученную от 3-5 петухов кровь помещают во флакон со стеклянными бусами или же с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5%-ный раствор лимонно-кислого натрия). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона в течение 5-7 мин при температуре (20±2) °С до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают буферно-солевым раствором (на 1 объем крови - 4 объема буферно-солевого р-ра) путем центрифугирования при (800±200) об./мин в течение (15±5) мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100%, готовят 1%-ную суспензию куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования на ФЭК-56.

3.1.2. Приготовление 1%-ной суспензии куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования

Для получения стандартных концентраций эритроцитарных суспензий рекомендуется использовать фотометрический метод, позволяющий определять их концентрацию по величине оптической плотности. Основанием для этого служит наличие линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией эритроцитов в определенном интервале концентраций - от 0,15 до 1,00%.

Величину оптической плотности для 1%-ной суспензии куриных эритроцитов определяют экспериментально, в ряду нескольких (~20) параллельных проб с последующим вычислением среднеарифметической величины, принимаемой за исходный показатель оптической плотности.

3.1.3. Определение показателя оптической плотности 1%-ной суспензии куриных эритроцитов


Для приготовления одной пробы отбирают градуированной пипеткой 0,2 мл осадка эритроцитов в емкость, содержащую 19,8 мл буферно-солевого раствора; содержимое тщательно перемешивают, заполняют им объем прямоугольной кюветы фотоколориметра (толщина слоя =1 мм) и немедленно измеряют оптическую плотность суспензии при длине волны нм.

В качестве контрольного раствора используют дистиллированную воду, предварительно заполняя ею объем второй такой же кюветы ФЭК.

3.1.4. Приготовление 1%-ной суспензии куриных эритроцитов по показателю оптической плотности

Готовят требуемое количество суспензии куриных эритроцитов несколько большей, чем 1%-ной концентрации. Добавлением буферно-солевого раствора рН 7,2±0,2 к полученной суспензии и измерением оптической плотности ее на ФЭК доводят концентрацию суспензии до такой, показатель оптической плотности которой равен величине, определенной ранее (п.3.1.2).

Примечание. Поскольку значение оптической плотности суспензии эритроцитов может изменяться в зависимости от качества эритроцитов (на что влияет сезон года, климатические условия, состояние и возраст животных и т.п.), а также зависит от технических характеристик измерительного прибора (ФЭК), величину оптической плотности 1%-ной суспензии куриных эритроцитов следует определять периодически (1 раз в 3-4 месяца) и на одном и том же приборе.

3.1.5. Определение гемагглютинирующего титра антигена

В лунках плексигласовой планшеты готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,4 мл на буферно-солевом растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1%-ной суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшеты и оставляют при температуре (20±2) °С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле, см. ниже).

Реакцию оценивают по четырехкрестовой системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (1АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (3 или 4 креста).

Читайте также: