Про вирус лейкоза крс пцр
Обновлено: 24.04.2024
Цель исследования:
Тест предназначен для выявления в организме крупного рогатого скота антител к вирусу лейкоза КРС.
Преимущество данного теста в том, что есть возможность диагностировать антитела в сливных пробах молока от коров.
Результат оценивается в сравнении с пороговым коэффициентом = 1,0. Образцы считаются положительными (т.е. содержащими антитела к вирусу лейкоза) при значении оптической плотности больше величины порогового коэффициента
Диагностическая значимость:
Тест должен использоваться для подтверждения результатов, полученных экспресс методами, а также для верификации сомнительных результатов, полученных другими методами, не основанными на определении активности антител (например ПЦР).
Метод исследования:
Сендвич-вариант твердофазного иммуноферментного анализа;
Принцип непрямого варианта ИФА заключается в выявлении комплекса, образованного антигеном, иммобилизованным с помощью моноклональных антител на поверхности лунок полистиролового планшета и специфическими антителами, содержащимися в пробах сыворотки крови или молоке крупного рогатого скота. Специфический комплекс взаимодействует с антивидовым конъюгатом моноклональных антител к IgG крупного рогатого скота с пероксидазой и обнаруживается по изменению окраски раствора в результате химических превращений субстрата и хромогена. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе.
Подготовка к исследованию
Требования к взятию материала: 1. Сыворотка. Кровь в пробирке для биохимии (с активатором свертывания или гранулами) или пустой пробирке - мин. объем 1 мл. Сыворотка- мин.объем 150 мкл. Без признаков гемолиза и бактериальной контаминации. 2. Плазма. Кровь в пробирке с ЭДТА - мин.объем 1 мл, или плазма - мин. объем 150 мкл. Без признаков гемолиза и бактериальной контаминации 3. Молоко, индивидуальные пробы. Объем не менее 5 мл. Рекомендовано брать из обмытого вымени в чистую (по возможности стерильную) посуду 4. Молоко, сливные (пулированные) пробы – допустимо до 50 индивидуальных образцов в пуле, минимальный объем индивидуального образца – не менее 5мл. Пул формируется из РАВНЫХ объемов индивидуальных образцов. 5. Молозиво, индивидуальные пробы. Объем не менее 5 мл. 6. Секрет вымени сухостойных коров, индивидуальные пробы. Объем не менее 5 мл. Стабильность антител в пробах крови и молоке: Допускается хранение образцов при температуре +2-+8 ⁰С в течение 72 ч.
Требование к биоматериалу
Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, которая протекает бессимптомно или проявляется лимфоцитозом и злокачественными разрастаниями клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли. Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является РНК–содержащий вирус семейства Retroviridae, классифицированный по морфологическим признакам как онковирус типа С млекопитающих, местом обитания и размножения которого являются лимфоциты. Клинические признаки. В настоящее время нет пород крупного рогатого скота, абсолютно устойчивых к заражению вирусом лейкоза КРС и заболеванию лейкозом. Различают две формы клинического течения болезни: энзоотическую и спорадическую. Энзоотический лейкоз поражает взрослых (5—8 лет) животных и протекает с длительным латентным периодом (до нескольких лет), который характеризуется стойким лимфолейкозом без клинических признаков болезни. Терминальная стадия сопровождается снижением массы тела, молочной продуктивности, увеличением лимфоузлов и заканчивается смертью. Экономический ущерб очень высокий. Спорадический лейкоз встречается редко и в экономическом отношении малоактуален. Поражается молодняк до трех лет. Болезнь протекает в трех формах: ювенальной, тимусной и кожной. Локализация вируса. Вирус локализуется в лимфоидных клетках разных органов, где сохраняется пожизненно (персистирует). В инфицированных лимфоцитах в форме провируса (непродуктивное состояние) вирус защищен от действия вируснейтрализующих антител и может передаваться потомству во время деления клеток. Провирус может изменять экспрессию генов клетки, что приводит к ее трансформации и развитию опухолевой стадии лейкоза. Постоянным признаком инфекции служит продукция специфических антител. Источник инфекции — больные животные. Возбудитель передается со всеми секретами и экскретами, содержащими зараженные вирусом лейкоциты (кровь, молоко, молозиво, сперма, носовая и влагалищная слизь, слюна). Чаще всего вирус передается с кровью. Наибольшую опасность с точки зрения распространения инфекции представляют животные с персистентным лимфоцитозом, у которых доля инфицированных лимфоцитов в периферической крови значительно выше, чем у животных инфицированных, но не достигших гематологической стадии заболевания. Основной путь передачи инфекции в естественных условиях через контаминированные вирусом инъекционные иглы, хирургические инструменты и т. д. при проведении санитарно-ветеринарных мероприятий. Кроме того, вирус может передаваться трансплацентарно (хромосомная или экстрахромосомная трансмиссия) от матери к плоду, алиментарно через молоко и молозиво, а также половым путем через инфицированную сперму. Распространяться инфекция может и кровососущими насекомыми. Метод ИФА позволяет обнаружить специфические антитела у инфицированных животных, начиная с 6-месячного возраста и старше (телята, выпаиваемые молозивом и молоком инфицированных коров, могут получать материнские антитела, которые сохраняются до 6 мес, следовательно при применении серологических методов исследования в этом возрасте могут быть получены ложноположительные результаты). Используется для быстрого скрининга стада на наличие инфицированных животных (допускается исследование в группах со смешиванием сывороток максимум от 10 голов), а так же для подтверждения результатов ПЦР в периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален.
3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
3.4. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ "ЛЕЙКОЗ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (КРС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
УТВЕРЖДЕНА 19 мая 2009 г.
Тест-система "ЛЕЙКОЗ" для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в двух вариантах.
Вариант EPh - для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.
Вариант FRT - для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1. Тест-система выпускается в двух вариантах.
Вариант EPh
В состав тест-системы "ЛЕЙКОЗ", рассчитанной на проведение 50 анализов, включая контроли, входят:
- "ДНК-сорб-В" вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;
- "ПЦР-комплект" вариант 50R - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота;
- "ЭФ" вариант 200 - комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Вариант FRT
В состав тест-системы "ЛЕЙКОЗ", рассчитанной на проведение 50 анализов, включая контроли, входят:
- "ДНК-сорб-В" вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;
- "ПЦР-комплект" вариант FRT - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
1.1. Комплект реагентов "ДНК-сорб-В" вариант 50 состоит из следующих компонентов:
1 флакон, 15,0 см (мл)
Раствор для отмывки 1
1 флакон, 15,0 см (мл)
Раствор для отмывки 2
1 флакон, 50,0 см (мл)
1 пробирка, 1,25 см (мл)
ТЕ-буфер для элюции ДНК
1 пробирка, 5,0 см (мл)
Комплект реагентов рассчитан на выделение ДНК из 50 проб, включая контроли.
1.2. Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант 50R состоит из следующих компонентов:
ПЦР-смесь-1-R BLV-пpoвирус, раскапана под воск в пробирки объемом 0,5 или 0,2 мл
55 пробирок по 0,005 см (мл)
1 пробирка, 0,6 см (мл)
Минеральное масло для ПЦР
1 пробирка, 2,0 см (мл)
ПКО ДНК BLV
1 пробирка, 0,1 см (мл)
ДНК а-актина КРС
1 пробирка, 0,1 см (мл)
1 пробирка, 0,5 см (мл)
Комплект реагентов рассчитан на постановку 55 реакций амплификации, включая контроли.
Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:
1 пробирка, 1,2 см (мл)
1.3. Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант FRT состоит из следующих компонентов:
BLV-провирус
2 пробирки по 0,3 см (мл)
1 пробирка, 0,42 см (мл)
2 пробирки, 0,02 см (мл)
ПКО ДНК BLV
1 пробирка, 0,1 см (мл)
1 пробирка, 0,5 см (мл)
Комплект реагентов рассчитан на постановку 55 реакций амплификации, включая контроли.
Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:
1 пробирка, 1,2 см (мл)
1 пробирка, 1,0 см (мл)
Комплект реагентов "ЭФ" вариант 200 состоит из следующих компонентов:
Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с бромидом этидия
1 флакон, 50,0 см (мл)
Агароза для электрофореза ДНК
2 флакона по 1,7 г
Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета 100 мл геля - 5 рядов по 24 лунки).
2. Упаковка и маркировка
На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.
Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение СТО и надпись "Для животных". В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.
3. Транспортирование и хранение
Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8°С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения. Комплект реагентов "ДНК-сорб-В" хранить при температуре от 2 до 25°С.
Вариант EPh.
Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант 50R хранить при температуре от 2 до 8°С. Комплект реагентов "ЭФ" хранить при температуре от 18 до 25°С в защищенном от света месте.
Вариант FRT.
Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант FRT (кроме ПЦР-смеси-1-FRT BLV-провирус и полимеразы (TaqF)) хранить при температуре от 2 до 8°С. ПЦР-смесь-1-FRT BLV-провирус и полимеразу (TaqF) хранить при температуре не выше -16°С. Следует избегать длительного нахождения ПЦР-смеси-1-FRT BLV-провирус на свету.
4. Срок годности тест-системы - 12 мес. с даты изготовления.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА
5. Вариант EPh. В основе метода лежит амплификация специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (последовательности, интегрированной в ДНК лейкоцитов КРС) за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы. Для контроля качества проведения анализа вместе с последовательностью ДНК провируса (в одной пробирке) проводится амплификация эндогенного внутреннего контроля гена а-актина КРС.
Вариант FRT. В основе метода лежит амплификация специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (последовательности, интегрированной в ДНК лейкоцитов КРС) за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и зондов, меченных флуоресцентными красителями, и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы.
III. ОТБОР И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
6. Тест-система "ЛЕЙКОЗ" предназначена для выявления ДНК провируса лейкоза КРС в цельной крови КРС у животных старше 14-дневного возраста методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Вариант EPh. Продукты амплификации определяют путем электрофоретической детекции в агарозном геле.
Вариант FRT. Продукты амплификации определяют путем гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.
6.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.
6.2. Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.
6.3. Для исследования используют цельную кровь.
7. Отбор материала для исследования
7.1. Кровь для исследования отбирают из хвостовой вены в стерильные пробирки с 3%-ным раствором ЭДТА из расчета 10:1 (или с цитратом натрия в стандартной концентрации). Желательно использовать одноразовые системы взятия крови "Моноветт". Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. Пробы цельной крови используют для выделения ДНК без предварительной подготовки.
7.2. Материал доставляют в лабораторию не позднее чем через 3 дня от момента забора материала. Хранить материал следует при температуре от 2 до 8°С.
IV. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР
Вариант EPh. ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).
Вариант FRT. ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).
Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
8.1.* ЗОНА 1 - для выделения ДНК из исследуемого материала:
* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
- ламинарный бокс (например, "БАВп-01-"Ламинар-С"-1,2", "Ламинарные системы", Россия, класс биологической безопасности II, тип А);
- твердотельный термостат для пробирок типа "Эппендорф" от 25 до 100°С (например, "ТЕРМО 24-15", "Биоком", Россия);
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Руководитель Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В.Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130
1. Общие положения
1.1. Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Клинически болезнь проявляется чаще у животных в возрасте старше 4 лет.
Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и (или) образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.
После установления опухолевой природы лейкоза болезнь как у животных, так и у человека получила название гемобластозы, то есть опухолевые заболевания крови. По характеру и месту локализации опухолевых разрастаний, а также по морфологии и принадлежности пролиферирующих клеток к определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две группы:
лейкозы - системные поражения органов кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированную формы;
гематосаркомы - сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфосаркома, ретикулосаркома, лимфогрануломатоз и миеломная болезнь.
Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae.
Источник возбудителя инфекции - животное, зараженное ВЛКРС.
Факторами передачи являются кровь, молоко и другие секреты и экскреты, содержащие лимфоидные клетки, инфицированные ВЛКРС.
Заражение может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных.
1.2. Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическими, молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, методом биопробы.
1.3. Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования - реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД).
Из числа положительно реагирующих в РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью гематологического метода выявляют больных лейкозом.
2. Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота
2.1. Реакция иммунодиффузии (РИД).
2.1.1. Сущность метода.
Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2-8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно.
2.1.2. Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 месяцев и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 суток до отела или через 30 суток после него.
2.1.3. Получение сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.
Кровь (для получения сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1-2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживают в течение 20-24 ч при 4-10°С. Полученные пробы сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2-3 мл) и маркируют.
При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.
2.1.4. Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87), в состав которого входят: сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из гликопротеидного gр-51 и полипептидного р-24 антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС.
Оборудование и реактивы:
- чашки Петри диаметром 100 мм;
- стандартный штамп-пробойник для просечения лунок в агаре;
- пипетки пастеровские или автоматические со сменными наконечниками;
- хлорид натрия (х.ч.);
2.1.5. Постановка РИД.
Подготовку компонентов реакции к работе осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота". Антиген растворяют в 5 см разбавителя. Растворенный антиген хранят при температуре 4°С не более двух недель.
Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см, затем колбу помещают в водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50-70°С, разливают слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по четыре фигуры, каждая из которых состоит из семи лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенных с вакуумным насосом.
Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или автоматическими пипетками со сменными наконечниками.
Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки (1, 2, 3, 4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и инкубируют во влажной камере при температуре 22-27°С.
2.1.6. Учет и оценка результатов реакции.
2.1.6.1. Реакцию учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.
Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой.
Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.
2.1.6.2. Оценка результатов.
В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную.
Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то есть идентична ей (рис.1 - не приводится, поз.1):
- если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном (рис.1, поз.2), - слабоположительная сыворотка;
- если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном (рис.1, поз.2), - резко положительная сыворотка.
Положительно реагирующая сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой. Эта линия указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против второго антигена (р-24) ВЛКРС (рис.1, поз.3).
При образовании толстой, короткой, без загибов контрольной линии преципитации, не доходящей до лунки с испытуемой сывороткой, необходимо провести раститровку этой испытуемой сыворотки физраствором до получения результата, который можно будет оценить как отрицательный, положительный или неспецифический. Для этого необходимо физиологический раствор в объеме 100-500 мкл разлить в пробирки или в лунки стандартных пластиковых плат для постановки серологических реакций (количество пробирок или лунок соответствует числу необходимых разведений). В первую пробирку или лунку с физраствором внести такой же объем сыворотки, тщательно перемешать и перенести той же пипеткой в том же объеме в следующую пробирку или лунку, затем после перемешивания - в следующую и т.д. В результате в первой пробирке или лунке испытуемая сыворотка разведена в 2 раза, во второй - в 4 раза, в третьей - в 8 раз и т.д.
Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без загиба (рис.1, поз.4).
В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.
Сдвиг контрольной линии преципитации в сторону лунки с антигеном или с контрольной сывороткой указывает на нарушение соотношения антигена и антител в тест-системе. В этом случае необходимо использовать другую серию диагностического набора.
2.1.7. Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза, и их необходимо исследовать гематологическим методом.
2.2. Метод иммуноферментного анализа (ИФА).
2.2.1. Сущность метода. Иммуноферментный анализ основан на иммунохимической реакции взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или антигенов.
Существует две модификации иммуноферментного анализа: непрямой и конкурентный.
Метод непрямого иммуноферментного анализа основан на связывании специфических к вирусу лейкоза антител с антигеном ВЛКРС, адсорбированным на стенках лунок планшета для микротитрования. Связавшиеся антитела выявляют с помощью видоспецифических антител, меченых ферментом (пероксидазой), с последующим ферментативным превращением бесцветного субстрата пероксидазой в окрашенный продукт. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию антител к ВЛКРС в сыворотке крови.
В основе конкурентного иммуноферментного анализа лежит способность антител к ВЛКРС, содержащихся в испытуемой сыворотке, блокировать связывание антигена ВЛКРС с антителами к ВЛКРС, иммобилизованными (адсорбированными) на стенках лунок планшетов для микротитрования (МТП). Антиген ВЛКРС, связавшийся с иммобилизованными антителами, выявляют с помощью антител к ВЛКРС, меченных пероксидазой (конъюгатом антител с пероксидазой) и последующего ферментативного превращения бесцветного субстрата пероксидазы в окрашенный продукт. В том случае, если испытуемый материал не содержал антител к ВЛКРС, интенсивность окрашивания максимальна. Антитела к ВЛКРС в испытуемом материале снижают интенсивность окрашивания прямо пропорционально их содержанию.
2.2.2. Материалы и оборудование.
2.2.2.1. Материалом для исследования методом иммуноферментного анализа может служить сыворотка крови, секрет вымени сухостойных коров, молозиво и молоко.
При исследовании сывороток крови их получают, как изложено в п.2.1.3. Сыворотки пригодны для использования в течение 10 дней при температуре хранения +4°С. Срок годности сыворотки, хранящейся при температуре -20°С и ниже, не ограничен.
Бактериально загрязненные, разложившиеся или сильно гемолизированные сыворотки непригодны для исследования.
2.2.2.2. При постановке реакции используют стандартные коммерческие диагностические наборы согласно прилагаемому к ним наставлению по применению.
Для проведения исследования применяют:
- микропипетки одноканальные автоматические;
- фотометр одно- или многоканальный с автоматической регистрацией результатов. Рекомендуется использовать анализатор иммуноферментный фотоэлектрический АИФ-Ц-01С;
- микротитровальные пластмассовые (полистироловые) планшеты с 96 лунками;
- автоматическое или полуавтоматическое оборудование для промывания пластин;
- термостат, обеспечивающий температуру 37+/-0,5°С;
- пипетки градуированные вместимостью 1 и 10 см.
2.2.3. Непрямой иммуноферментный анализ для выявления антител к вирусу лейкоза.
2.2.3.1. В состав диагностического набора входят:
- антиген вируса лейкоза лиофилизированный и разбавитель антигена;
- конъюгат антител против иммуноглобулинов крупного рогатого скота с пероксидазой или другим ферментом, жидкий или лиофилизированный, и разбавитель конъюгата;
- сыворотки контрольные - отрицательная и положительная (слабоположительная), лиофилизированные или жидкие;
- разбавитель для сывороток и промывающий раствор, содержащий детергент и инертный белок;
Лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС) является широко распространенным заболеванием и наносит огромный ущерб, связанный с гибелью и преждевременной выбраковкой высокопродуктивных коров, снижением продуктивности, качества молока и рождением телят с иммунодефицитами [1].
ЛКРС — хроническая инфекционная болезнь, вызываемая РНК-содержащим вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС или BLV — bovine leukosis virus) из семейства Retroviridae. Лейкозом болеет крупный рогатый скот (КРС) всех возрастов, но в основном молочных пород. Вначале заболевание протекает бессимптомно, а затем переходит в персистентный лимфоцитоз (persistent lymphocytosis (PL)) и (или) образует опухолевидные разрастания в кроветворных и других органах и тканях. Клинически болезнь проявляется чаще у животных в возрасте старше 4 лет [2].
Источником возбудителя ВЛКРС является инфицированное животное, поэтому заражение может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных. В этой связи на первый план ставятся вопросы раннего выявления животных — носителей ВЛКРС.
Некоторые исследования подтверждают факт присутствия антител к ВЛКРС в сыворотке крови человека [3]. Установлено, что работники рынков, непосредственно контактирующие с инфицированным мясом КРС, подвергаются трехкратно повышенному риску заболевания миелоидной лейкемией и высокому риску заболевания раком легких по сравнению с контрольной интактной группой [4]. Последние исследования, проведенные в Южной Корее, показали, что инфекция животных не является причиной заболеваемости человеческой лейкемией и раком легких у корейцев [5].
Известно, что ВЛКРС присутствует в организме в виде ДНК-копий (провируса), встраиваясь в клеточный геном животного и при этом могут отсутствовать детектируемые антитела к ВЛКРС. Установлено, что транскрипция генома вируса ЛКРС в новых раковых клетках или лейкоцитах периферической крови у инфицированных животных плохо обнаруживается с помощью традиционных методов исследования [8]. Ее обнаружение становится возможным при применении современных молекулярно-биологических методов, в частности, метода ПЦР.
Как диагностический метод, ПЦР характеризуется высокой специфичностью, которая обусловлена выбором праймеров и чувствительностью. Метод ПЦР может использоваться для диагностики лейкоза крупного рогатого скота наряду с серологическими методами, а также в качестве подтверждающего теста.
Целью настоящей работы является разработка duplex-ПЦР для идентификации провируса лейкоза крупного рогатого скота.
Материалы и методы
Амплификацию гена провируса ВЛКРС проводили на приборе DNA Engine Tetrad 2 Cycler (Bio-Rad) с использованием подобранных олигонуклеотидных праймеров (5534 и 4932) (Синтол, Россия). В качестве внутреннего контроля (ВКО) использованы праймеры (alphafs4 и alphars4), специфичные к гену альфаглобина (a-globin) КРС (Синтол, Россия). Состав подобранной нами ПЦР реакционной смеси: dNTPs (2 mmol/l each) 2,5 pl, 10 х PCR buffer 2,5 pl, target DNA (0,05 pg/pl) 5 pl, Taq DNA polymerase 1U, 10 pmol primers 0,5 pl. Общий объем смеси доведен до 25 pl водой, свободной от нук-леаз. Температурные условия: преденатурация при 95 0C в течение 3 мин, а также 40 циклов: денатурация при 94 0C 30 сек, отжиг при 64 0C 30 сек и элонгация при 72 0C 40 сек. Последняя элонгация проводилась при 72 0C в течение 7 мин. Для визуализации ПЦР-продуктов проведен электрофорез в 2 %-ном агарозном геле при 120V с последующим окрашиванием в растворе этидиум бромида и гельдокументированием на приборе GelDoc (BioRad, США).
Результаты и их обсуждение
Результаты ПЦР представлены на электрофореграмме (рис. 1), где видно, что использование пары праймеров, специфичных к гену a-Globin, позволило генерировать ампликоны (длиной ~ 900 н.п.) из геномной ДНК, выделенной из крови серопозитивных (131, 140, 131d, 131 Pr, 140 Pr) и одного се-росомнительного (152 Pr) образцов КРС, а также у серонегативного образца (14 образец). В негативных контролях ЦК, VK, GlK), содержащих только реагенты, а также пару праймеров 4932 + 5534 (V), или alphafs4 + alphars4 (Gl), или смесь обеих пар (Mix), ПЦР-продуктов не выявлено. Кроме того, на данном рисунке видно, что при ПЦР с отдельно взятыми BLV-специфичными праймерами и в смеси с a-глобиновыми праймерами у всех серопозитивных ДНК образцов выявлен ампликон, по длине соответствующий 598 н.п. Следует заметить, что при использовании обеих пар праймеров в ПЦР-смеси не всегда образуются четко выраженные продукты (см. на рис.1 дорожки Mix с 140 Pr и 152 Pr образцами). Поэтому мы продолжили работу по оптимизации условий duplex-ПЦР с использованием смеси праймеров 4932 + 5534 и alphafs4 + alphars4, которые были лучшими парами праймеров для детекции провируса ЛКРС. Использование образцов ДНК, выделенных двумя различными методами (14, 131, 140, 131d и 140d образцы выделены по модифицированному методу, а 131 Pr, 140 Pr и 152 Pr — коммерческим набором) не показало различий при проведении duplex-ПЦР.
В целях подбора оптимальной концентрации каждой пары праймеров для duplex-ПЦР использованы следующие концентрации: 100 nM a-Globin + 100 nM BLV (Mix1), 100 nM a-Globin + 200 nM
BLV (Mix2), 200 nM a-Globin + 200 nM BLV (Mix3), а также Mix4 содержал ту же концентрацию праймеров, что и Mix2, но в ПЦР-смесь добавлена ДНК в концентрации 0,10 pg/pl.
Результаты ПЦР амплификации (рис. 2) образцов ДНК (131 Pr, 140 Pr,152 Pr, 60 и 12) показали, что увеличение концентрации BLV праймеров до 200 nM в смеси Mix2 позволило получить четко выраженные ПЦР-продукты обоих генов, в сравнении с Mix1, где имеется одинаковое (100 nM) содержание смеси данных праймеров. Что касается ПЦР-продуктов, полученных в смеси Mix3, то выявлено, что эквивалентное увеличение концентраций обеих пар праймеров в реакционной смеси все же приводит к большему получению ПЦР-продуктов, соответствующих контрольному гену a-Globin, чем ампликонов, по длине соответствующих гену провируса BLV (см. рис. 2, Mix3 с 131 Pr, 140 Pr,152 Pr). В негативном контроле (К) и серонегативном образце (14) ДНК продуктов амплификации прови-руса BLV не было обнаружено. При ПЦР с использованием праймеров в концентрации 100 nM a-Globin + 200 nM BLV (Mix2) и при увеличении концентрации ДНК в смеси (см. рис. 2, Mix4 с 131 Pr, 140 Pr,152 Pr) наблюдалась наработка визуально эквивалентного количества ампликонов, соответствующих генов. Это свидетельствует о существовании корреляции между исходными концентрациями ДНК и используемых праймеров и возможности улучшения ПЦР амплификации гена провирусной ЛКРС путем увеличения концентрации ДНК до 250-500 нг в ПЦР смеси.
В целях оценки воспроизводимости результатов оптимизации условий duplex-ПЦР проведена амплификация с использованием смеси праймеров в концентрации 100 nM a-Globin + 200 nM BLV (Mix2) и образцов ДНК, выделенных от 23 животных.
По результатам ИФА у 23 исследуемых животных были выявлены следующие 12 серопозитив-ных образцов: 42, 46, 52, 97, 102, 108, 109, 131, 138, 140, 144 и 158, а также 6 серосомнительных — 2, 12, 116, 146, 151, 152 и пять ИФА-негативных образцов — 56, 60, 83, 120 и 121. Результаты же электрофореза (рис. 3) демонстрируют, что у 11 из 12 исследуемых серопозитивных ДНК-образцов происходит амплификация ПЦР-продуктов длиной в 598 н.п., соответствующий провирусу ЛКРС. Все ИФА-серосомнительные образцы по результатам ИФА при ПЦР анализе показали наличие провируса лейкоза КРС, кроме 116-го образца (OD=0,409). После ПЦР анализа из 5 ИФА-негативных образцов выявлено наличие гена env провируса ЛКРС у 3 образцов (см. рис. 3 А и Б, 60, 83, 120 и 121). Причем количество амплифицированного гена провирусной ДНК у 121 образца было незначительным с соответствующим слабым свечением (см. рис. 3 Б, 121), что связано с низкокопийностью ДНК провируса, интегрированного в геном животного.
В предварительных экспериментах ИФА-позитивный (OD=0,593) образец 138 при ПЦР с отдельно взятой парой праймеров (4932f и 5534r), специфичных к гену провируса BLV, также показал негативный для лейкоза результат (данные не предоставлены), как и при duplex-ПЦР (см. рис.3 Б, 138). Это можно объяснить тем фактом, что при диагностировании зараженных телят можно обнаружить наличие антител ВЛКРС, которые передаются молозивом матери, и их невозможно отличить от антител, возникающих при инфекцировании животного. Кроме того, известно, что поли- и монокло-нальные антитела против поверхностного вирусного лейкозного белка gp51 обладают вируснейтра-лизующей активностью, подавляют синцитийобразующую активность вируса, препятствуют его выходу из клеток и вызывают лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента [10]. Недостатком ИФА-тест-систем является наличие перекрестной реакции с другими антигенными детермин-тами [7].
Результаты duplex-ПЦР позволили выявить наличие ампликонов, соответствующих провирусу ЛКРС у ИФА-неопределенных (сомнительных) 2, 12, 146, 151 и 152 образцов, а также у ИФА-негативных 60, 83, 120 и 121, что объясняется установленным фактом, когда провирус BLV может интегрироваться в рассеянные сайты генома хозяина и не транскрибироваться in vivo [11], т.е. наблюдается отсутствие детектируемых BLV антител. В сыворотке крови антитела против ВЛКРС появляются обычно через 3-8 недель после заражения [2].
Заключение
В настоящее время выделение антигенных компонентов вириона ЛКРС позволило разработать различные серологические и вирусологические методы диагностики лейкоза. При этом диагностика лейкоза КРС является обоснованной при исключении неспецифической реакции иммунного ответа на антигенную стимуляцию и гистохимической идентификации клеток крови [2].
Отрицательные результаты в серологических тест-системах для выявления ЛКРС могут быть связаны не только с индивидуальными особенностями взаимодействия животного организма и вируса, но и с наличием в геноме хозяина генов противовирусной защиты и наличием в геноме вируса вариантов генов, способных наиболее эффективно воздействовать на клеточные системы организма хозяина, т. е. для более эффективной стратегии выживания [6].
Метод ИФА разработан главным образом на основе использования частично очищенного прови-русного гликопротеина gp51 и моноклональных антител к эпитопам gp51 [7]. Установлено, что специфические антитела в крови способны проявлять не только цитотоксическое, но и блокирующее действие, оказывая тем самым эффект утомления опухолевого роста. Это подтверждает, что лейкоз ассоциирован с иммунологическим дефектом организма.
Таким образом, ПЦР тест-системы для выявления патогенов животных могут служить эффективным диагностическим средством и применяться для дополнения и контроля результатов традиционных методов микробиологического и иммунохимического анализов. Для улучшения ПЦР диагностики генетически вариабельных штаммов ВЛКРС может потребоваться более, чем одна пара прай-меров, которая позволит подтвердить результаты простого ПЦР и выявить позитивные образцы среди серонегативных и вероятных ложнопозитивных результатов ИФА и РИД [12].
Результаты наших исследований позволили подтвердить наличие гена env провируса лейкоза крупного рогатого скота (BLV) в серопозитивных образцах крови, а также довыявить животных-вирусоносителей среди серонеопределенных и негативных образцов при постановке duplex-ПЦР с целевыми праймерами и праймерами, специфичными к гену КРС a-Globin, использованного в качестве внутреннего контроля.
Для диагностики интегрированного в геном животных провируса BLV предоставляется реальная возможность использования разработанного нами метода duplex-ПЦР. Основываясь на том факте, что количество копий провируса BLV в периферических одноядерных клетках крови у различных серо-позитивных животных может быть различным, то, соответственно, для улучшения ПЦР амплификации возможно увеличение финальной концентрации матричной ДНК (до 250-500 нг) при duplex-ПЦР с двухкратно большей концентрацией праймеров, нацеленных на гены провируса, в сравнении с праймерами, специфичными к гену внутреннего контроля.
Комплексное исследование на лейкоз КРС включает в себя:
4206 Лейкоз КРС методом ПЦР (Определение наличия в образце провирусной ДНК вирусного лейкоза КРС.)
4208 Определение наличия антител к вирусу лейкоза КРС методом ИФА
Подготовка к исследованию
Материал: цельная кровь с К3ЭДТА не менее 1-2 мл, гемолиз ВЛИЯЕТ на результат. пробы молока, молозива и секрета вымени сухостойных коров не менее 5 мл Хранение пробы: Пробы крови допустимо хранить одни сутки в холодильнике, Сыворотку/плазму – до 3-х дней в холодильнике; Для более длительного хранения пробы сыворотки/плазмы замораживаются. Пробы молока, молозива и секрета вымени сухостойных коров допускается храненить при температуре +2-+8 ⁰С в течение 72 ч.
Требование к биоматериалу
Данный комплекс может быть использован для постановки диагноза, а так же , для оздоровления стада. 1) Постановка диагноза. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) выявляется продукция организмом специфических антител, в ответ на пожизненно персистирующего возбудителя в организме животного в виде провируса, интегрированного в геном лимфоцитов хозяина. Метод ПЦР. Реакция позволяет обнаружить провирусную ДНК в патологическом материале через две недели после заражения. Применение данного метода целесообразно для подтверждения положительных результатов серологических методов исследования, а так же для исследования животных в периоды, когда уровень специфических антител может оказаться неинформативным, а именно: у телят в возрасте от 15 дней до 5 месяцев, у коров в пред- и послеродовой период до 30 суток, у особей со вторичными иммунодефицитами, инфицированных некоторыми инфекционными и инвазивными заболеваниями, у всего поголовья после применения живых вакцин, у особей, подозреваемых в заражении вирусом за 1-1,5 месяца до времени серологического контроля. С помощью ПЦР выявляют непосредственно провирус, то есть результат анализа не зависит от возраста и состояния животного, поэтому ПЦР можно использовать для разделения телят на инфицированных и здоровых в возрасте от 15 дней до 5 месяцев (в этом возрасте применять РИД или ИФА не имеет смысла) 2) Для оздоровления стада: Для полного оздоровления стада от лейкоза целесообразно совместно с ИФА использовать метод ПЦР, выявляющий провирус у инфицированных животных. Система ИФА+ПЦР перспективна при лейкозе КРС, так как обладает рядом преимуществ перед РИД и позволяет с высокой достоверностью одномоментно выявлять максимальное количество инфицированных животных на самых ранних стадиях заболевания. Это существенно сокращает сроки оздоровительных противолейкозных мероприятий. Кроме того, ПЦР применима для обследования молодняка, начиная с 15-дневного возраста. Недостаток в чувствительности ИФА особенно очевиден, когда животные, заражаясь вирусом лейкоза за 1-1,5 месяцев до времени серологического контроля, и в ИФА реагируют отрицательно. Первое исследование согласно инструкции проводят в 6 месяцев. До этого всех телят содержат в одной группе, и вероятность перезаражения очевидна (вакцинация, лечения без замены игл, с нарушением целостности кожи, слизывание воспалительного экссудата). Однако если теленок заразился в 5 месяцев, то к моменту исследования (6 месяцев) титр антител еще не успевает достичь диагностического уровня и он как серонегативный поступает в группу здоровых. Аналогичная ситуация может сложиться и при дальнейшем исследовании в 12, 18 и 24 месяцев, а затем и взрослого поголовья коров. Если в одной группе находятся инфицированные и здоровые животные, о чем врач может и не знать, то вероятность заражения весьма велика.
Читайте также: