Серодиагностика вирусных гепатитов а в с

Обновлено: 28.03.2024

Поверхностный антиген гепатита В в сыворотке крови в норме отсутствует.
Обнаружение поверхностного антигена (HBsAg) гепатита В в сыворотке подтверждает острое или хроническое инфицирование вирусом гепатита В.

При остром заболевании HBsAg выявляется в сыворотке крови в последние 1-2 недели инкубационного периода и первые 2-3 недели клинического периода. Циркуляция HBsAg в крови может ограничиваться несколькими днями, поэтому следует стремиться к раннему первичному обследованию больных. Метод ИФА позволяет выявить HBsAg более чем у 90% больных. Почти у 5% больных самые чувствительные методы исследования не обнаруживают HBsAg, в таких случаях этиология вирусного гепатита В подтверждается наличием анти-HBсAg JgM или ПЦР.

Концентрация HBsAg в сыворотке крови при всех формах тяжести гепатита В в разгар заболевания имеет значительный диапазон колебаний, вместе с тем имеется определенная закономерность: в остром периоде существует обратная связь между концентрацией HBsAg в сыворотке и тяжестью болезни.

Высокая концентрация HBsAg чаще наблюдается при легких и среднетяжелых формах болезни. При тяжелых и злокачественных формах концентрация HBsAg в крови чаще низкая, причем у 20% больных с тяжелой формой и у 30% со злокачественной антиген в крови может вообще не обнаруживаться. Появление на этом фоне у больных антител к HBsAg расценивается как неблагоприятный диагностический признак; он определяется при злокачественных формах гепатита В.

При остром течении гепатита В концентрация HBsAg в крови постепенно снижается вплоть до полного исчезновения этого антигена. HBsAg исчезает у большинства больных в течение 3 месяцев от начала острой инфекции.

Снижение концентрации HBsAg более чем на 50% к концу 3-й недели острого периода, как правило, свидетельствует о близком завершении инфекционного процесса. Обычно у больных с высокой концентрацией HBsAg в разгар болезни он обнаруживается в крови в течение нескольких месяцев.
У больных с низкой концентрацией HBsAg исчезает значительно раньше (иногда через несколько дней после начала заболевания). В целом срок обнаружения HBsAg колеблется от нескольких дней до 4-5 мес. Максимальный срок обнаружения HBsAg при гладком течении острого гепатита В не превышает 6 месяцев от начала заболевания.

HBsAg может быть обнаружен у практически здоровых людей, как правило, при профилактических или случайных исследованиях. В таких случаях исследуют другие маркеры вирусного гепатита В – анти HBсAg JgM, анти- HBсAg JgG, анти HBеAg и изучают функцию печени.

При отрицательных результатах необходимы повторные исследования на HBsAg.
Если повторные исследования крови в течение более 3 месяцев выявляют HBsAg, такого пациента относят к хроническим больным вирусным гепатитом В.
Наличие HBsAg – довольно распространенное явление. В мире насчитывается более 300 млн. носителей, а у нас в стране – около 10 млн. носителей.
Прекращение циркуляции HBsAg с последующей сероконверсией (образование анти-HBs) всегда свидетельствует о выздоровлении - санации организма.

Исследование крови на наличие HBsAg применяется в следующих целях:

для диагностики острого гепатита В:

  • инкубационный период;
  • острый период заболевания;
  • ранняя стадия реконвалесценции;

для диагностики хронического вирусного гепатита В;

  • персистирующем хроническом гепатите;
  • циррозе печени;

для скрининга и выявления больных в группах риска:

  • больные с частыми гемотрансфузиями;
  • больные с хронической почечной недостаточностью;
  • больные с множественным гемодиализом;
  • больные с иммунодефицитными состояниями, в том числе СПИДом.

Оценка результатов исследования

Результаты исследования выражаются качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие HBsAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление HBsAg свидетельствует об инкубационном или остром периоде острого вирусного гепатита В, а также при хроническом вирусном гепатите В.

Антитела к ядерному антигену вируса гепатита В JgG (анти- HBcAg JgG )

В норме анти-HBcAg JgG в сыворотке отсутствует.
У больных анти-HBcAg JgG появляются в острый период вирусного гепатита В и сохраняются на протяжении всей жизни. Анти-HBcAg JgG – ведущий маркер перенесенного ВГВ.

Исследование крови на наличие анти-HBcAg JgG применяются для диагностики:

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие анти-HBcAg JgG в сыворотке крови. Положительный результат – выявление анти-HBcAg JgG свидетельствует об острой инфекции, реконвалесценции или ранее перенесенном вирусном гепатите В.

В норме HBeAg в сыворотке крови отсутствует.
HBeAg можно обнаружить в сыворотке крови большинства больных острым вирусным гепатитом В. Он обычно исчезает в крови раньше HBs-антигена. Высокий уровень HBeAg в первые недели заболевания или обнаружение его на протяжении более 8 недель дает основание заподозрить хроническую инфекцию.

Этот антиген часто обнаруживается при хроническом активном гепатите вирусной этиологии. Особый интерес к определению HBeAg связан с тем, что его обнаружение характеризует активную репликативную фазу инфекционного процесса . Установлено, что высокие концентрации HBeAg соответствуют высокой ДНК-полимеразной активности и характеризуют активную репликацию вируса.

Наличие HBeAg в крови свидетельствует о высокой ее инфекциозности, т.е. присутствии в организме обследуемого активной инфекции гепатита В, и обнаруживается только в случае присутствия в крови HBs-антигена. У больных хроническим активным гепатитом противовирусные препараты применяются только при обнаружении в крови HBeAg. HBeAg – антиген – маркер острой фазы и репликации вируса гепатита В.

Исследование крови на наличие HBe-антигена применяется для диагностики:

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие HBeAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление HBeAg свидетельствует об инкубационном или остром периоде острого вирусного гепатита В или продолжающейся репликации вируса и инфекциозности больного.

Анти-HBeAg в сыворотке в норме отсутствует. Появление анти-НВeAg антител указывает обычно на интенсивное выведение из организма вируса гепатита В и незначительное инфицирование больного.

Эти антитела появляются в острый период и сохраняются до 5 лет после перенесенной инфекции. При хроническом персистирующем гепатите анти-НВeAg обнаруживаются в крови больного вместе с НВsAg. Сероконверсия, т.е. переход HBeAg в анти-НВeAg, при хроническом активном гепатите, чаще прогностически благоприятна, но такая же сероконверсия при выраженной цирротической трансформации печени прогноза не улучшает.

Исследование крови на наличие анти-НВeAg применяются в следующих случаях при диагностике вирусного гепатита В:

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к HBeAg в сыворотке крови. Положительный результат – выявление антител к HBeAg, которые могут свидетельствовать о начальной стадии острого вирусного гепатита В, остром периоде инфекции, ранней стадии реконвалесценции, реконвалесценции, перенесенном недавно вирусном гепатите В или персистирующем вирусном гепатите В.

Критериями наличия хронического гепатита В являются:

Обнаружение вируса гепатита В методом ПЦР (качественно)

Вирус гепатита В в крови в норме отсутствует.
Качественное определение вируса гепатита В методом ПЦР в крови позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает этиологию заболевания.

Данное исследование дает полезную информацию для диагностики острого вирусного гепатита В в инкубационном и раннем периоде развития заболевания, когда основные серологические маркеры в крови у пациента могут отсутствовать. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Аналитическая чувствительность метода ПЦР составляет не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл, прошедшей выявление ДНК пробы, специфичность – 98%.

Этот метод имеет важное значение для диагностики и мониторинга течения хронического ВГВ. Примерно 5-10% случаев цирроза и других хронических заболеваний печени обусловлены хроническим носительством вируса гепатита В. Маркерами активности таких заболеваний является наличие HBeAg и ДНК вируса гепатита В в крови.

Метод ПЦР позволяет определять в крови ДНК вируса гепатита В как качественно, так и количественно. Определяемым фрагментом в обоих случаях служит уникальная последовательность ДНК гена структурного белка вируса гепатита В.

Обнаружение ДНК вируса гепатита В в биоматериале с помощью ПЦР необходимо для:

Исчезновение ДНК вируса гепатита В из крови – признак эффективности терапии

Обнаружение вируса гепатита В методом ПЦР (количественно)

Этот метод дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, об эффективности лечения и о развитии резистентности к активным препаратам.
Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови применяются тест-системы, чувствительность которых составляет 50-100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5 Х 10^3 -10^4 копий/мл. ПЦР при вирусном гепатите В безусловно необходима для суждения о вирусной репликации.

Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК вируса гепатита В могут служить сыворотка крови, лимфоциты, гепатобиоптаты.

  • Оценку уровня виремии осуществляют следующим образом:
  • менее 2.10^5 копий/мл (менее 2.10^5 МЕ/мл) – низкая виремия ;
  • от 2.10^5 копий/мл (2.10^5 МЕ/мл) до 2.10^6 копий/мл (8.10^5 МЕ/мл) – средняя виремия;
  • более 2.10^6 копий/мл – высокая виремия.

Существует зависимость между исходом острого вирусного гепатита В и концентрацией ДНК ВГВ в крови больного. При низком уровне виремии процесс хронизации инфекции близок к нулю, при средней – хронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии острый вирусный гепатит В чаще всего переходит в хронический.

Показаниями для лечения хронического ВГВ интерфероном-альфа следует считать наличие маркеров активной репликации вируса (выявление HBsAg, HBeAg и ДНК ВГВ в сыворотке крови в течение предшествующих 6 месяцев.).

Критериями оценки эффективности лечения служат исчезновение HBeAg и ДНК ВГВ в крови, что обычно сопровождается нормализацией уровня трансаминаз и долговременной ремиссией заболевания, ДНК ВГВ исчезает из крови к 5-му месяцу лечения у 60%, к 9-му месяцу – у 80% больных. Снижение уровня виремии на 85% и более к третьему дню от начала лечения по сравнению с исходным служит быстрым и достаточно точным критерием для прогнозирования эффективности терапии.

Вирусы гепатитов - характеристика, особенности поражения печени

Печень может страдать от различных вирусных инфекций, однако некоторые вирусы выделяют в особую группу гепатотропных из-за их способности избирательно поражать ткань этого органа. В настоящее время в нее входят пять возбудителей (от вируса гепатита А до вируса гепатита Е). Кроме того, растет количество данных в пользу существования других вирусов, вызывающих поражение печени. Большинство форм гепатитов не диагностируют, потому что они протекают субклинически.

Вирус гепатита А содержит РНК и вызывает острое течение гепатита с низкой смертностью и без длительных остаточных явлений.

Напротив, возбудитель гепатита В (HBV) — ДНК-содержащий вирус, вызывающий более тяжелое течение заболевания (особенно в раннем детском возрасте) с преобразованием в хроническую форму, сопровождающуюся постоянной циркуляцией вируса в крови. Заболевание прогрессирует и переходит в хронический гепатит с последующим перерождением в цирроз печени.

Электронная микрофотография: вирусные частицы гепатита А (27-32 нм в диаметре) с антителами на их поверхности. Электронная микрофотография вируса гепатита В.
На срезе видны мелкие сферические частицы с диаметром 28 нм (HBsAg); более крупные сферические двумембранные частицы Дейна (42 нм), продолговатые филаментозные частицы.

Вирус гепатита С (HCV) — РНК-содержащий. Подобно вирусу гепатита В передается парентеральным путем. Гепатит С представляет собой наиболее распространенное хроническое заболевание печени: им в мире поражены около 200 млн человек. Диаметр вируса составляет 30—60 нм. Геном возбудителя состоит из одноцепочечной молекулы РНК. Строение вируса показано на рисунке. Структурные и неструктурные белки закодированы на 5' и 3'-концах открытой рамки считывания. Нетранслируемые области располагаются как на 3', так и на 5'-конце рамки считывания и необходимы для процессов трансляции белков и репликации вируса.

Вирус гепатита С

Вирус гепатита С (схема). Структурные и неструктурные компоненты с некоторыми антигенами используют при диагностике с помощью антител.

Вирус гепатита D (дельта-антиген) имеет небольшой размер и содержит РНК. Сам по себе он не патогенен, но при одновременном инфицировании с вирусом гепатита В приводит к более тяжелому течению болезни, прогрессированию и развитию скоротечной формы.

Вирус гепатита Е передается фекально-оральным путем, он вызывает эпидемии в Азии, Африке, Латинской Америке, при которых заражение происходит через воду. Течение заболевания обычно доброкачественное, по типу гепатита А, однако достаточно высока смертность среди беременных.

Вирус гепатита Е

Электронная микрофотография вирусных телец гепатита Е (100 нм).

Дифференциальная диагностика различных типов острых гепатитов клинически затруднена, и поэтому ее проводят с помощью серологических тестов. В силу тех же причин гистологическая диагностика в большинстве случаев также невозможна. Классические гистологические признаки при неосложненном остром (лобулярном) гепатите — повреждение печеночных клеток и некроз в центре дольки. Наблюдают дистрофию гепатоцитов в виде гидропической вакуолизации и накопления дегенеративных ацидофильных телец. Активность клеток Купфера повышена вследствие поглощения ими поврежденных или отмерших гепатоцитов.

Наряду с этими изменениями внутри долек накапливается воспалительный инфильтрат преимущественно в виде лимфоцитов с небольшим количеством плазматических клеток. Также обычно обнаруживают небольшой отек, скопление мононуклеаров и макрофагов в стенках воротной вены. Пролиферация клеток желчных протоков минимальна. Возникающий при данной болезни холестаз выражен в различной степени. В некоторых случаях у пациентов с сильной желтухой изменения в системе воротной вены могут имитировать симптомы внепеченочной обструкции.

По мере уменьшения воспаления дольки в центре ее более выраженным становится спадение фибрилл ретикулина, и происходит деформация клетки, однако эти явления преходящи. Воспаление стенок сосудов системы воротной вены — процесс длительный, который может приводить к формированию фиброзных перегородок.

Острый гепатит

Гистологическая картина острого долькового гепатита (а) (видны апоптозные тельца: х 320, окраска гематоксилин-эозином).
Увеличенные вследствие баллонной дегенерации гепатоциты (б) (х 125, окраска гематоксилин-эозином).
Активированные клетки Купфера (в) с PAS-позитивным содержимым (х 320, окрашивание PAS):

В более тяжелых случаях острого гепатита возникают мостовидные некрозы между центральными венами и портальными трактами (подострые печеночные некрозы). Портальные тракты при этом расширены, наблюдают пролиферацию стенок желчных протоков и инфильтрацию их нейтрофилами, что можно ошибочно принять за внепеченочную обструкцию. Граница между печеночной долькой и портальным трактом (пограничная пластинка) обычно сохранена.

Ее разрушение может быть связано с развитием хронического гепатита (см. выше). Подострый печеночный некроз может приводить к печеночной недостаточности и летальному исходу, хотя также возможно полное выздоровление. Более острый и тяжелый гепатит приводит к скоротечной печеночной недостаточности, при которой остается незначительное количество жизнеспособных клеток паренхимы, печень сморщена и окрашена в желтый цвет (острая желтая атрофия).

Гистология острого гепатита

Гистологическая картина острого долькового гепатита: видно спадение фибрилл ретикулина в центре дольки.

Острые формы гепатитов В и С часто переходят в хронические. При этом в портальных трактах заметны основные гистологические изменения в виде скопления большого числа лимфоцитов и плазматических клеток. В процесс могут быть включены и прилежащие тракты. В некоторых случаях диагноз гепатита можно поставить на основании гистологической картины.

Видео лабораторная диагностика вирусных гепатитов

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

ИФА в диагностике вирусных гепатитов. Возможности иммуноферментного анализа

Специфическая лабораторная диагностика вирусных гепатитов основывается на применении иммунохимических и молекулярно-биологических методов исследований. Основными иммунохимическими методами являются радиоизотопный или радиоиммунный (РИА) и иммуноферментный (ИФА). В основе иммунохимических методов диагностики лежит специфическое взаимодействие антиген — антитело с последующим выявлением комплекса при помощи специальных меток. Наиболее распространенным является иммуноферментный анализ.

В результате инкубации иммуносорбента и испытуемой сыворотки при наличии определяемого агента происходит их связывание в комплекс антиген — антитело. После процедуры промывки, в ходе которой удаляются несвязанные антигены и антитела, проводится инкубация с конъюгатом. В качестве конъюгата при детекции HBsAg используют анти-HBs, при детекции антител к вирусу гепатита С —антитела к иммуноглобулинам человека (антивидовой конъюгат), меченные пероксидазой хрена. В итоге этой инкубации происходит присоединение к уже имеющимся комплексам антиген — антитело дополнительно внесенного конъюгата. После удаления несвязавшегося конъюгата (отмывки) в лунки вносится субстрат. При использовании пероксидазного конъюгата в качестве субстрата используют перекись водорода в сочетании с индикатором, в качестве которого наиболее часто применяют ортофенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ). Результат оценивается фотометрически.

Качество и надежность аналитических возможностей иммуноферментного метода характеризуются рядом критериев, к числу которых относятся чувствительность, специфичность, правильность и воспроизводимость.

ифа в диагностика гепатита

Чувствительность — то минимальное количество вещества, которое может быть обнаружено при помощи иммуноферментного анализа. При этом нижним пределом чувствительности данного метода является концентрация исследуемого вещества в образце, которая соответствует наименьшему положительному результату определения, статистически достоверно отличающемуся от показателей заведомо отрицательных образцов. Чувствительность ИФТС зависит от ряда обстоятельств, связанных как с конструкцией тест-системы (аффинность иммуносорбента, качества экстракционных и буферных систем), так и разрешающей способностью и точностью метода регистрации.

Специфичность — способность выявлять именно те компоненты, для определения которых предназначена данная иммуноферментная тест-система. Специфичность ИФА определяется во многом перекрестной реакцией антител или антигенов (то есть композиции, используемой в качестве иммуносорбента), с близкородственными соединениями, а также составом инкубационной среды (матрикс-эффект).

Правильность — соответствие среднего значения результатов повторных определений одного и того же контрольного образца с истинной величиной измеряемого параметра. Правильность определения в ИФА зависит от качества самой тест-системы и контрольного образца. Для хороших иммуноферментных тест-систем показатели правильности лежат в пределах 90-110 %. Особенностью медико-биологических исследований в ИФА является невозможность установления точной величины, и поэтому за истинную величину принимается средняя от нескольких экспертных лабораторий. Статистическим критерием правильности служит средняя арифметическая и степень ее отклонения от истинного значения, выраженная в процентах.

Воспроизводимость — способность тест-системы показывать одни и те же значения при повторных исследованиях одного и того же образца. Воспроизводимость зависит как от случайных погрешностей (ошибок) при проведении процедуры постановки реакции, так и от качества тест-систем и точности метода регистрации результатов. Считается, что воспроизводимость одних и тех же контрольных образцов одной фирмы в разных лабораториях не должна превышать величину коэффициента вариации в 15%.

Из молекулярно-биологических методов диагностики вирусных гепатитов чаще используются полимеразная цепная реакция и гибридизация. Эти методы, особенно ПЦР, позволяют выявлять очень малые количества специфической вирусной ДНК или РНК и, таким образом, судить о репликации, а в ряде случаев и об активности репликации.

Диагностика вирусных гепатитов. Диагностика гепатита А и В

Для выявления специфических (вирусных) нуклеиновых кислот и их фрагментов в сыворотке крови больных гепатитами, разработана (К. Миллис с соавт., 1985-1987) и широко применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). С высокой степенью разрешения она позволяет определить HBV-ДНК, HCV-PHK, а также генотипы HCV В последнее время с помощью ПЦР выявляют HGV-PHK и TTV-ДНК. Этот набор реакций позволяет осуществлять не только диагностику различных типов вирусного гепатита, но и использовать их для контроля проводимого противовирусного лечения (слежение за динамикой вирусемии).

Используется широкий арсенал методов серологической диагностики вирусных гепатитов1, позволяющий выделять вирусоспецифические антигены в различных биологических материалах, полученных от больных (кровь, фекалии, слюна, сперма, влагалищный секрет, материнское молоко; пунктаты печени; ткань печени и других органов, полученных посмертно, а также методы определения у больных антител различных классов).

Гепатит А. Среди разработанных и апробированных методов специфической диагностики в настоящее время подавляющее распространение получил иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий выявлять как вирусоспецифические антигены в материалах от больных (фекалии), так и антител различных классов IgM и IgG в сыворотке крови. Наиболее информативным является тест определения анти-ВГА класса IgM, поскольку эти антитела синтезируются у всех больных уже в инкубационном периоде вслед за репродукцией вируса. Определение анти-ВГА класса IgG имеет значение в эпидемиологических исследованиях при изучении иммуноструктуры населения, титровании иммуноглобулинов и т.д.

гепатит В

Что касается определения самого возбудителя или его фрагментов в настоящее время, при необходимости, трудоемкий метод иммунной электронной микроскопии может быть заменен ИФА, а также методом молекулярной гибридизации, позволяющим выявлять вирусную РНК в биологических объектах. Тест-системы для диагностики ГА выпускаются многими фирмами из различных стран мира, включая Россию.

Гепатит В характеризуется наличием вируса и(или) его антигенов как в ткани печени, так и циркуляцией их в крови в определенных временных взаимоотношениях с соответствующими антителами. Антигены HBSAg, HBCAg, HBEAg; антитела: анти-HBS, анти-НВС, анти-НВЕ. Для выявления самого вируса может быть использован метод иммунной электронной микроскопии, однако в последнее время он вытеснен молекулярно-биологическими методами, позволяющими определить вирусоспецифическую ДНК в минимальных количествах, отражающих имеющуюся репродукцию вируса - молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот (дот-гибридизация, спот-гибридизация, полимеразная цепная реакция).

Определение ДНК гепатита В важно не столько для установления этиологии заболевания, сколько для оценки эффективности противовирусной терапии. Поверхностный антиген ВГВ (HBSAg) является основным маркером инфекции. Он выявляется у больных уже в инкубационном периоде за много недель до появления биохимических сдвигов в крови и исчезает в период реконвалесценции с сероконверсией на анти-HBS при благополучном исходе инфекции и сохраняется при ее хронизации. Аналогичная картина наблюдается и с HBEAg-свидетелем активной репродукции вируса и высокой инфекционности сыворотки. Другим информативным маркером инфекции являются анти-HBCAgM, которые присутствуют в высоких титрах в остром периоде и более низких - при хроническом гепатите. Для определения указанных маркеров в настоящее время, в подавляющем большинстве случаев, применяется ИФА с использованием коммерческих диагностикумов.

Что касается HBsAg, то используется реакция обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА), однако ее чувствительность значительно ниже ИФА (20-50 нг/мл и 0,5-3,0 нг/мл соответственно). В связи с этим РОПГА может быть применена при анализе сывороток крови больных, у которых концентрация HBsAg высокая и не рекомендуется в службе крови при выявлении возможных носителей HBsAg в низкой концентрации. При диагностике ГВ необходимо учитывать, что определение маркеров иногда не позволяет адекватно оценить активность и направленность патологического процесса у больных, что может быть связано с индивидуальными особенностями макроорганизма.

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела.

Метод обнаружения с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого .

В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, соответствующих применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (JgM и JgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеинов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется.

Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, т. е. одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например вирус гепатита С.

ПЦР — это трехступенчатый процесс , повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

    Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:
  • возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в том числе и в материале, получаемом при биопсии;
  • возможна диагностика инфекционных болезней на самых разных стадиях заболевания;
  • возможность количественной оценки результатов исследований ( сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
  • высокая чувствительность метода.

Исследования вирусов гепатита

В настоящее время выделяют следующие формы вирусных гепатитов: гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, гепатит G и гепатит ТТ. Для диагностики каждой из перечисленных форм вирусных гепатитов используется определенный перечень маркеров.

Вирусный гепатит А

Гепатит А — острая энтеровирусная инфекция. Возбудитель — вирус гепатита А (ВГА,HAV) — энтеровирус типа 72. Геном вируса представлен однонитчатой РНК. Вирус гепатита А содержит единственный антиген (HA-Ag). Удельный вес гепатита А в суммарной заболеваемости вирусными гепатитами составляет 70-80%. В структуре заболеваемости гепатитом А дети составляют до 80%, причем основная масса — дошкольники и школьники начальных классов.

Вирусный гепатит В

Гепатит В – вирусная антропонозная инфекция. Возбудитель вирус гепатита В (ВГВ, HBV) – относится к семейству гепаднавирусов, ДНК-содержащих вирусов, поражающих клетки печени. Вирионы ВГВ имеют наружную липопротеидную оболочку и нуклеокапсид, содержащий двунитчатую ДНК и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу.

В диагностике вирусного гепатита В ведущее значение имеет определение комплекса маркеров гепатита. Свыше 5% населения планеты охвачено этой инфекцией, а частота безжелтушных форм ВГВ составляет, по данным разных авторов, от 60 до 82%.

Вирус гепатита С, генотипы

Гепатит С (ВГС) – вирусное заболевание, наиболее часто протекающее в виде посттрансфузионного гепатита с преобладанием безжелтушных и легких форм и склонное к хронизации процесса.

Возбудитель - вирус гепатита С – имеет сходство с флавовирусами, содержит РНК. На основе филогенетического анализа выделено 6 генотипов ВГС и более 80 субтипов.

Генотип 1 - наиболее распространенный генотип во всем мире (от 40 до 80%). Генотип 1а является доминирующим для США, а 1b преобладает в Западной Европе и Южной Азии.

Генотип 2 распространен во всем мире, однако встречается с меньшей частотой, чем генотип 1 (от 10 до 40%).

ВГС тип 3 характерен для Индии, Пакистана, Австралии и Шотландии. Генотип 4 распространен преимущественно в Средней Азии и Египте, генотип 5 – в Южной Африке, а генотип 6 – в Гонконге и Мокао.

Примерно 90% всех случаев посттрансфузионных гепатитов связано с ВГС. Среди доноров антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) обнаруживают в 0,2-5% случаев.

У 40-75% пациентов регистрируется бессимптомная форма болезни, у 50-75% больных острым ВГС формируется хронический гепатит, у 20% из них развивается цирроз печени. Важная роль ВГС отводится и в этиологии гепатоклеточной карциномы.

Геном вируса гепатита С представлен одноцепочечной положительно заряженной РНК, которая кодирует 3 структурных и 5 неструктурных белков. К каждому из этих белков вырабатываются антитела, обнаруживаемые в крови больных гепатитом С.

Отличительной чертой ВГС является волнообразное течение заболевания, в котором разграничивают 3 фазы: острую, латентную и фазу реактивации.
Для острой фазы характерно повышение активности печеночных ферментов в сыворотке крови, уровня антител класса IgM и IgG к ВГС с нарастанием титров, а также РНК ВГС.

Латентная фаза характеризуется отсутствием клинических проявлений, наличием в крови антител класса IgG к ВГС в высоких титрах, отсутствием антител класса IgM и РНК ВГС либо их присутствием в низких концентрациях на фоне незначительного повышения активности печеночных ферментов в периоды обострения.
Для фазы реактивации характерно появление клинических признаков, повышение активности печеночных ферментов, наличие антител класса IgG (к нуклеокапсидному белку core и неструктурным белкам NS) в высоких титрах, присутствие РНК ВГС и нарастание титров антител класса IgM к ВГС в динамике.

Вирусный гепатит D

Гепатит D – вирусная инфекция, вследствие биологических особенностей вируса протекающая исключительно в виде ко- или суперифекции при гепатите В, характеризующаяся тяжелым течением,
часто неблагоприятным исходом.

Самостоятельно, без вируса В, вирус гепатита D не может попасть в организм человека

Возбудитель – вирус гепатита D (ВГD), по своим биологическим свойствам приближается к вироидам – обнаруженным молекулам нуклеиновых кислот. Печень человека – единственное место размножения (репликации) ВГD.

Известно существование двух вариантов инфекции: коинфекция (одновременное заражение ВГВ и ВГD) и суперинфекция (заражение HBsAg-позитивных пациентов). Сочетание ВГВ и ВГD сопровождается развитием более тяжелых форм патологического процесса, что определяется главным образом действием ВГD.

Летальность при суперинфекции достигает 15-20%. Инфицирование дельта-вирусом может вызывать острое заболевание, заканчивающееся выздоровлением, или формировать хроническое носительство ВГD.

При гепатите D могут отсутствовать в крови маркеры гепатита В – анти НВс и НВs-антиген – и наблюдается угнетение ДНК-полимеразной активности, так как ВГD ингибирует репликацию вируса гепатита В.

Читайте также: