Сольвент детергентный метод инактивации вирусов

Обновлено: 19.04.2024

Кондратенко И.В. * , Заплатников А.Л. ** , Бологов А.А. *
* РДКБ, Москва, Кондратенко Ирина Вадимовна, д.м.н., профессор
* РДКБ, Москва, Бологов Андрей Анатольевич, к.м.н., зам. главного врача по лечебной работе
** РМАПО, кафедра педиатрии, Заплатников Андрей Леонидович, д.м.н., профессор

Недостаточность иммуноглобулинов, и связанные с этим нарушения противоинфекционной резистентности возникают при первичных (генетически детерминированных) иммунодефицитах и вторичных иммунодефицитах, возникающих при воздействии неблагоприятных факторов на организм. Такими неблагоприятными факторами могут быть химио- и радиотерапия злокачественных новообразований, иммуносупрессивная терапия в трансплантологии, потеря белков плазмы и иммунокомпетентных клеток при кровопотерях, операциях, ожоговой болезни; воздействие эндотоксинов при некоторых инфекционных и паразитарных заболеваниях (4,5,6)

Другими областями применения ВВИГ являются лечение и профилактика определенных вирусных инфекций и лечение аутоиммунных заболеваний [7,8,9].

Существует много различных статей и монографий по применению иммуноглобулинов для внутривенного введения в различных областях медицины. Однако постоянно дискутируются три главных вопроса:

Когда применять иммуноглобулин?
Какая доза препарата должна вводиться?
Какой иммуноглобулин следует выбрать? Есть ли разница между ними?

Для того чтобы ответить на эти вопросы, необходимо определиться с классификацией иммуноглобулинов, представленных на Российском рынке. Для практических целей может быть использована классификация ИГВВ, в основу которой положена особенность антительного состава препаратов. Принято выделять следующие группы ИГВВ:

Стандартные иммуноглобулины для внутривенного введения - (Интратект,Интраглобин, Октагам, Гамунекс, иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения и др.).
Обогащенные иммуноглобулины для внутривенного введения –препараты ИГВВ, содержащие антитела класса IgG и обогащенные антителами класса IgМ и IgА (Пентаглобин).
Специфические или гипериммунные иммуноглобулины для внутривенного введения – препараты ИГВВ, содержащие антитела класса IgG, при этом против определенных возбудителей концентрация антител значительно выше, чем в стандартных иммуноглобулинах (Неоцитотект, Неогепатект и др.).

Разный способ производства
Разный состав
Разное содержание IgA и IgM
Разный состав подклассов IgG
Разные способы и количество стадий инактивации и элиминации вирусов

У иммунобиологических препаратов производственный процесс влияет на качество. Поэтому так важно определиться в выборе препарата при рассмотрении клинической ситуации и быть уверенным в его эффективности и безопасности.

Вирусная безопасность препарата ВВИГ обеспечивается вирусной безопасностью плазмы и совершенством технологии производства. Контроль плазмы осуществляется при обследовании доноров в донорских центрах, карантинизацией с обязательным контрольным обследованием доноров в этот период. В процессе производства обязательна вирусная очистка и вирусная инактивация. Вирусная очистка включает:

фракционирование этанолом по Кону (уменьшает концентрацию вирусного загрязнения, физически удаляя вирусные частицы);
методы фильтрации и ультрафильтрации (удаляют оболочечные - гепатиты В,С, ВИЧ и безоболочечные - гепатит А, парвовирус В19 вирусы);

Методы, используемые для вирусной инактивации варьируют у разных производителей: сольвент/детергентный метод, инкубация с низким рН , обработка бета-пропиолактоном, адсорбция на аэросиле, обработка октановой (каприловой) кислотой. Должно быть использовано не менее двух методов. Особое внимание необходимо обратить на гарантии элиминации парвовируса В19.

В противоположность здоровым людям, у которых парвовирусная инфекция манифестирует в виде инфекционной эритемы или полиартропатии, у пациентов группы риска парвовирус В19 может вызвать серьезные нарушения кровообразования, в особенности эритропоэза.

В группу риска входят также иммунокомпрометированные пациенты, так как вследствие нарушений гуморального иммунитета и недостаточной способности к элиминации вируса может возникнуть персистирующая инфекция с хронически протекающей парциальной красноклеточной аплазией костного мозга. Это касается пациентов с врожденным или приобретенным иммунодефицитом, пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями во время/после химиотерапии и пациентов с ятрогенной иммуносупрессией (например, после высокодозовой химиотерапии и трансплантации стволовых клеток, вследствие аутоиммунных заболеваний, после трансплантации органов). Специфической противовирусной терапии не существует. В этом случае приходится прерывать терапию иммунодепрессантами или цитостатиками. В качестве методов лечения следует применять иммуноглобулины, предварительно убедившись, что они сами не контаминированы парвовирусом (так как обычные методы вирусинактивации не являются эффективными) и имеют специфические антитела против парвовируса.

Помимо хронической анемии у пациентов после аллогенной и аутологичной ТКМ было отмечено поражение парвовирусом внутренних органов. Так, у нескольких пациентов с кожной экзантемой при помощи ПЦР вирус был обнаружен не только в крови, но и частично в коже, у пациента с кардимиопатией – в миокарде, у пациента с гепатитом – в печени, а у пациента с гемолитико-уремическим синдромом – в почке. Летальность, ассоциированная с парвовирусной инфекцией, в данной группе пациентов составила 7%. Поэтому у иммунокомпрометированных пациентов с невыясненной причиной органной недостаточности следует исключать паровирусную инфекцию при помощи ПЦР из биопсийного материала.

Исходя из вышеизложенного, в терапии иммуноглобулинами пациентов из группы риска следует использовать только препараты, абсолютно безопасные с точки зрения передачи парвовируса В19.

Эффективность и переносимость ВВИГ обеспечивается:

100% сохранностью Fс фрагментa
Общим содержание IgG (%): >95%
Содержанием мономеров и димеров (%): > 90%
Отсутствием фрагментов
Распределение подклассов IgG должно соответствовать распределению в нормальной плазме: IgG1-66%, IgG2-23%, IgG3-7%, IgG4-4%

Применение стандартных иммуноглобулинов - IgG.

Основные показания к применению стандартных иммуноглобулинов:

1. Профилактика или заместительная терапия.

Механизм действия заместительной терапии заключается в связывании и нейтрализация микробного антигена, блокировании присоединения вирусов и бактерий к клетке-мишени, опсонизации и инициация поглощения и переваривания вирусов и бактерий фагоцитами, наличием нейтрализующих антител против суперантигенов. Стандартными дозами ВВИГ для заместительной терапии являются 400-500 мг/кг массы тела пациента 1 раз в 3-4 недели (период полураспада IgG). Необходимо обратить внимание на то, чтобы претрансфузионный уровень сывороточного IgG был не менее 4-5 г/л. Хорошее состояние и нормальный претрансфузионный уровень IgG не являются показанием для уменьшения дозы вводимого ВВИГ и/или увеличения интервалов между трансфузиями. Для заместительной терапии используют только препараты стандартных иммуноглобулинов (11, 12). Применение Пентаглобина нерационально и может вызвать серьезные побочные реакции в связи активацией комплемента и образованием IgM содержащих иммунных комплексов (13, 14). Кому же применяется заместительная терапия?

Больным с первичными иммунодефицитами с нарушениями продукции антител (со сниженным или нормальным содержанием общего IgG),
При СПИДе у детей с повторяющимися инфекциями
При аллогенной трансплантация костного мозга
При развитии гипогаммаглобулинемии на фоне иммуносупрессии

2. Терапия аутоиммунных заболеваний.

Эффект высокодозовой терапии (1-2 г/кг массы тела пациента в течение последовательных 2-3 дней) обеспечивается следующими механизмами (15, 16, 17, 18):

предоставлением нейтрализующих антител к неизвестному до настоящего времени причинному инфекционному агенту
подавлением формирования аутоантител по принципу антиидиотипического действия
блокирование Fc рецепторов IgG на фагоцитирующих клетках
подавление пролиферации Т-клеток и продукции иммуноглобулинов
взаимодействие с системой комплемента
блокирование активации и действия цитокинов
блокирование экспресс молекул адгезии на эндотелиальных клетках

Препаратами первой линии терапии ВВИГ являются при:

Синдроме Кавасаки
Идиопатической тромбоцитопенической пурпуре
Синдроме Гийена-Барре
Аутоиммунных полинейропатиях
Энтеровирусных энцефалитах у пациентов с агаммаглобулинемией

Высокодозовая терапия ВВИГ используется также при:

Рассеянном склерозе, миастении гравис, воспалительных миозитах, системных васкулитах, аутоиммунных цитопениях при системной красной волчанке, аутоиммунных дерматитах, в профилактике спонтанных абортов (лечение антифосфолипидного синдрома), аутоиммунных цитопениях (аутоиммунная нейтропения, аутоиммунная гемолитическая анемия, аллоиммунной неонатальной тромбоцитопении и гемолитической анемии) (19, 20).

За 30 лет применения ВВИГ проведено много рандомизированных, контролируемых исследований, которые достоверно доказали снижение частоты и интенсивности инфекционных осложнений при проведении ежемесячной терапии иммуноглобулином IgG в дозе 250-500 мкг/кг массы тела (21, 22, 23).

Вторая группа – поликлональных ВВИГ, обогащенных IgM и IgA, представлена единственным препаратом, не имеющим аналогов, под торговым названием Пентаглобин. Состав препарата: Ig G = 76%, Ig M = 12% и Ig А=12 %.

Все положительные эффекты данного препарата связаны именно с наличием в их структуре иммуноглобулина М и иммуноглобулина А.

Пентаглобин разработан для лечения распространенных тяжелых бактериальных инфекций за счет специфических функций, которыми обладают иммуноглобулины классов А и М.

Основным показанием к клиническому применению Пентаглобина является адъювантная терапия бактериальных инфекций. Преимущество Пентаглобина перед стандартными ВВИГ в терапии сепсиса доказано многочисленными клиническими исследованиями. Вначале проводились оригинальные, рандомизированные клинические исследования, а с 2001 года начали проводиться мета-анализы для получения более достоверных с точки зрения статистики данных, которые объединяют качественные клинические исследования и оценивают эффективность адъювантной терапии иммуноглобулинами. Все они показали преимущества Пентаглобина и подтверждены международными экспертами 29. Один из ведущих специалистов в области интенсивной терапии профессор Werdan K в 2007 году провел мультицентровое исследование SBITS (30) с целью доказательства эффективности применения стандартных иммуноглобулинов (IgG) в лечении сепсиса у взрослых больных. Протокол был опубликован до начала исследования и послужил основой для последующей дискуссии о методологии клинических исследований по сепсису. Результаты работы были опубликованы в одном из самых авторитетных журналов по интенсивной терапии Critical Care Medicine. В группу IgG было включено 321 пациент, в контрольной группе (плацебо альбумин) было 303 больных.

Летальность в группе IgG составила 39,3%, а группе альбумина 37,3%.

Ожидания исследователей не оправдались: у взрослых пациентов с сепсисом не произошло статистически достоверного снижения летальности. Авторы сделали вывод, что стандартные иммуноглобулины IgG не должны использоваться в качестве адъювантной терапии сепсиса.

По мнению международных экспертов, это исследование превосходит все проведенные прежде исследования как по качеству, так и по числу включенных пациентов, и должно рассматриваться как знаковое в этой области.

Таким образом, пентаглобин является первым и единственным препаратом, который воплощает естественные, природные принципы физиологической защиты организма человека:

Содержит широкий спектр антител против клинически релевантных микроорганизмов комплемент - опосредованного уничтожения микроорганизмов и повышения фагоцитарной активности моноцитов/макрофагов и гранулоцитов.
Модулирует cиcтемные чрезмерные реакции воспаления и результате ингибирования провоспалительно действующих цитокинов и стимуляции высвобождения их антагонистов
Модулирует воспалительное действие комплемента за счет нейтрализации факторов комплемента С3b и C4b, и тем самым комплемент - опосредованного разрушения клеток

Третья группа – специфические гипериммунные иммуноглобулины. К ним относятся антицитомегаловирусный ВВИГ - Неоцитотект (цитотект) и иммуноглобулин, обогащенный антителами к HBs – Неогепатект. Оба этих иммуноглобулина готовятся из плазмы специально отобранных доноров, с исходно более высоким, чем общепопуляционный, титром специфических антител.

Распространенность инфицирования ЦМВ в развитых странах составляет 50 – 80% у взрослых и 65% у детей школьного возраста. Риск манифестации симптоматической инфекции возрастает во время беременности, у новорожденных и при иммунной недостаточности (врожденных иммунодефицитах, после транплантации органов и костного мозга. Показания к применению Неоцитотекта - лечение активной цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) у иммунокомпрометированных пациентов, у беременных женщин с целью снижения риска антенатальной передачи вируса и поражения плода (31), для лечения активной ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста (12, 32), для профилактики манифестации заболевания у инфицированных больных в трансплантологии.

Режим дозирования: лечение активной инфекции 1 – 2 мл на кг массы тела каждые 48 часов 3 – 5 введений или до исчезновения клинических симптомов; профилактика реактивации – 1 мл/кг массы тела 1 раз в триместр у беременных или 6 раз с интервалом 3-4 недели после трансплантации. Необходимо отметить, что использование иммуноглобулинов совместно с виростатическими препаратами дает лучшие результаты (33).

Применение Неоцитотекта предотвращает развитие вирус-индуцированной лимфопролиферации (34). Результаты ретроспективного анализа более чем 26000 пациентов с трансплантированной почкой выявили стандартизированную частота развития опухоли в 1-й год после операции:

Пациенты после трансплантации почки без профилактики ЦМВ 26,4
Пациенты после трансплантации почки с противовирусной терапией 24,2
Пациенты после трансплантации почки с терапией анти-ЦМВ IgG 0

Неогепатект применятся для профилактики заражения гепатитом В одновременно с вакцинацией у новорожденных, родившихся от матерей вирусоносителей, пациентов, получающих терапию гемодиализом, пациентов, получающих множественные гемотрансфузии; у невакцинированных лиц, при контакте с кровью больного (35, 36, 37, 38, 39, 40). Также Неогепатект вводится лицам, не ответившим на предшествующую вакцинацию при риске заражения. Режим дозирования:

Kudasheva E.Y. 1 Borisevich I.V. 1 Ivanov V.B. 1 Klimov V.I. 1 Kornilova O.G. 1 Lebedinskaya E.V. 1 Bunyatyan N.D. 1

The analysis of modern technological approaches to ensuring the viral safety of human immunoglobulin preparations has been performed. The main viral contaminants associated with human immunoglobulin preparations are human immunodeficiency virus types 1 and 2, hepatitis B, C, A viruses, parvovirus B19. However the contamination of these preparations with prions-infectious pathogens (Creutzfeldt-Jakob disease or variant Creutzfeldt-Jakob disease), West Nile virus, SARS coronavirus (the causative agent of severe acute respiratory syndrome), influenza virus H5N1, hepatitis E is theoretically possible. The article provides with the recommendations of the World Health Organization with regard to ensuring of the viral safety of human immunoglobulin preparations. It describes modern systems of ensuring viral safety of immunoglobulin preparations in manufacturing technology both in Russia and abroad. It specifies the schemes of inactivation/elimination of enveloped and non-enveloped viruses when obtaining human immunoglobulins. However, there is no complete guarantee of human immunoglobulin preparations safety. The authors have made a conclusion about the need to further improve the inactivation/elimination methods for known viruses as well as to develop new diagnostic products for the detection of unknown blood-borne viruses and to search for new ways of preventing the contamination of human immunoglobulin preparations with the mentioned viruses.

Иммуноглобулины человека – группа иммунобиологических препаратов крови, потребность в которой неуклонно растет во всем мире. Препараты иммуноглобулинов человека представляют собой выделенную промышленным способом иммунологически активную белковую фракцию плазмы крови здоровых доноров, несущую антительную активность различной специфичности. Несмотря на то, что препараты иммуноглобулинов содержат преимущественно иммуноглобулины класса G – антитела против различных возбудителей бактериальных и вирусных инфекций и/или их токсинов, спектр их применения не ограничивается традиционной заместительной и иммуномодулирующей терапией при первичных гуморальных иммунодефицитах, а также проведением специфической профилактики и лечения бактериальных и вирусных инфекций. Уже сейчас в применении препаратов иммуноглобулинов человека неврологические показания составляют 42 %, первичные иммунодефициты – 33 %, гематоонкология – 18 % мирового потребления [31]. Приблизительно в 33 % случаев препараты иммуноглобулинов человека применяются не по показаниям (off-label) при более чем 50 заболеваниях, например, при лечении дерматомиозитов/полимиозитов, хронического идиопатического и комплексного регионального болевого синдрома, тяжелой диабетической полинейропатии, глиобластомы, нейробластомы, аутоиммунной вегетативной ганглиопатии, педиатрических аутоиммунных нейропсихиатрических нарушений, ассоциированных со стрептококковой инфекцией, и других [13].

Из них 46 % наименований, представлены препаратами иммуноглобулинов человека нормальными, специфическими и специального назначения для внутривенного и внутримышечного введения. Современный прогресс препаратов иммуноглобулинов человека обусловлен не только улучшением их эффективности и расширением показаний к их применению в клинической практике, но и достижениями, связанными с обеспечением их качества и безопасности. Вопрос безопасности препаратов иммуноглобулинов человека, прежде всего, рассматривается в аспекте обеспечения вирусной безопасности, так как для их производства используется биологический материал, потенциально содержащий возбудители гемотрансмиссивных инфекций. Не все возбудители гемотрансмиссивных инфекций, которые могут присутствовать в донорской крови, могут передаваться при применении препаратов иммуноглобулинов человека. Основными вирусными контаминантами, ассоциированными с препаратами иммуноглобулинов человека, являются вирус иммунодефицита человека 1 и 2 типов, вирусы гепатита В, С, А, парвовирус В19 [12].

Отбор доноров осуществляется в соответствии с Международной программой качества плазмы (IQPP) [21]. В соответствии с этой программой потенциальный донор должен получить статус квалифицированного, обязывающий его пройти два отдельных медицинских обследования и лабораторный контроль на отсутствие антител к основным гемотрансмиссивным инфекциям (вирусу иммунодефицита человека, вирусу гепатитов В и С). Если донор не появляется в учреждении по заготовке плазмы в течение 6 месяцев, то он теряет статус квалифицированного донора. Плазма от первичного донора не может быть использована для получения препаратов крови даже при отрицательном результате лабораторных исследований. Информация о донорах вносится в национальный регистр с целью недопущения к сдаче плазмы крови донора, не прошедшего квалификацию. Для снижения возможного риска передачи болезни Крейцфельда-Якоба (CJD) и вариантной болезни Крейцфельда-Якоба (vCJD) введены критерии исключения для доноров, гарантирующие безопасность: отсранение лиц, у которых были диагностированы CJD и vCJD, доноров, которые перенесли трансплантацию твердой мозговой оболочки или роговицы, или получали гипофизарный гормон роста, доноров, у которых есть один или несколько родственников с болезнью Крейцфельда-Якоба. Доноры, постоянно пребывающие в Соединенном Королевстве и подвергающиеся риску развития вариантной болезни Крейцфельда-Якоба, а также доноры, которые суммарно провели в Соединенном Королевстве с 1980 по 1996 гг. три месяца или более (для доноров США) или двенадцать месяцев или более, отстраняются от донорства бессрочно [18].

Для производства препаратов иммуноглобулинов человека используют плазму человека для фракционирования [41], полученную из крови не менее чем от 1000 здоровых доноров. Качество и безопасность плазмы для фракционирования является фундаментом производства современных препаратов иммуноглобулинов человека. Передача плазмы для фракционирования в производство включает тестирование индивидуальных донаций, мини-пулов и производственного пула на маркеры вирусных инфекций [3, 22]. Тестирование индивидуальных донаций осуществляют иммуноферментным методом на содержание поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов, и антител к вирусу гепатита С. Национальные органы контроля могут принять решение о необходимости выполнения дополнительного теста на содержание аланинаминотрансферазы. Тестирование индивидуальных донаций в Российской Федерации на предприятиях по фракционированию проводится по такой же схеме, с обязательным определением отсутствия содержания антител к возбудителю сифилиса. Тестирование мини-пулов проводят и иммуноферментным методом и методом ПЦР. Обязательным является определение отсутствия содержания антител к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов, поверхностного антигена вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С иммуноферментным методом. Далее с использованием ПЦР технологии исследуют мини-пулы на отсутствие содержания маркеров РНК-содержащих вирусов: иммунодефицита человека 1 и 2 типов, вируса гепатита С и ДНК-содержащего парвовируса В19. Выявление РНК вируса гепатита А и ДНК вируса гепатита В методом ПЦР проводится на усмотрение производителя. В Российской Федерации определение ДНК парвовируса В19 и РНК вируса гепатита А не предусмотрено. Для формирования производственного пула допускаются только мини-пулы плазмы, содержащие не более 104 МЕ/мл ДНК парвовируса В19 и отрицательные в отношении маркеров вирусных инфекций [22]. Тестирование производственного пула осуществляют иммуноферментным методом на содержание поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и к вирусу гепатита С и методом ПЦР на содержание маркеров РНК-содержащих вирусов: иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), гепатита С и ДНК-содержащих парвовируса В19 и вируса гепатита В. Тестирование методом ПЦР на содержание РНК вируса гепатита А и ДНК парвовируса В19 в Российской Федерации является необязательным [3].

Современные технологии фракционирования белков плазмы крови человека сочетают очистку протеинов с инактивацией и удалением вирусов. Преципитация с помощью этанола – наиболее широко используемый метод фракционирования плазмы. Помимо того, что этанол выступает в качестве преципитанта, он также обладает дезинфицирующими свойствами, которые, однако, наиболее выражены при положительных температурах. Вирусы как большие структуры имеют тенденцию преципитировать в начале процесса фракционирования, когда концентрация этанола относительно низкая. В результате этой стадии преципитации происходит распределение вирусов между фазами, что, однако, не исключает возможность вирусной контаминации на стадиях получения готового продукта. Метод этанольного фракционирования доказал свою эффективность в обеспечении вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов [17]. Однако его необходимо дополнять более эффективными методами и инактивации и удаления вирусов. Поиск и совершенствование методов инактивации и удаления вирусов основывался на использовании как физических факторов, так и химических реагентов. Внедрение в производство таких методов, как пастеризация, энзимный протеолиз при низких значениях рН, обработка ß-пропиолактоном в сочетании с ультрафиолетовым облучением, значительно повысило вирусную безопасность препаратов иммуноглобулинов. В то же время, эти методы имели ряд технологических недостатков, оказывали влияние на качество и эффективность конечного продукта и требовали доработки. Поэтому дальнейшее совершенствование технологии производства препаратов иммуноглобулина было направлено на повышение вирусной безопасности препаратов при сохранении иммунобиологических свойств и соответственно высокой терапевтической эффективности. На сегодняшний день при производстве современных препаратов иммуноглобулинов человека используют такие методы инактивации и элиминации вирусов, как сольвент-детергентный метод, метод обработки октановой (каприловой) кислотой и ацетатом кальция, метод инкубирования при низких значениях рН, пастеризация и метод нанофильтрации [5].

Кудашева Э.Ю. 1 Борисевич И.В. 1 Иванов В.Б. 1 Климов В.И. 1 Корнилова О.Г. 1 Лебединская Е.В. 1 Бунятян Н.Д. 1

Проведен анализ современных технологических подходов, обеспечивающих вирусную безопасность препаратов иммуноглобулинов человека. Основными вирусными контаминантами, ассоциированными с препаратами иммуноглобулинов человека, являются вирус иммунодефицита человека 1 и 2 типов, вирусы гепатита В, С, А, парвовирус В19. Однако теоретически существует возможность контаминации данных препаратов возбудителями прионных инфекций (классической формы болезни Крейцфельдта-Якоба или вариантной болезни Крейцфельда-Якоба), вирусом лихорадки Западного Нила, коронавирусом SARS (возбудителем тяжелого острого респираторного синдрома), вирусом гриппа H5N1, вирусом гепатита Е. Приведены рекомендации Всемирной организацией здравоохранения по обеспечению вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов человека. Представлены современные системы обеспечения вирусной безо пасности препаратов иммуноглобулинов в технологии их производства как в РФ, так и за рубежом. Приведены схемы инактивации/элиминации оболочечных и безоболочечных вирусов в процессе получения иммуноглобулинов человека. Однако полная гарантия безопасности препаратов иммуноглобулинов человека отсутствует. Сделан вывод о необходимости дальнейшего совершенствования методов инактивации/элиминации известных вирусов, а также разработки новых диагностических препаратов для обнаружения неизвестных гемотрансмиссивных вирусов и поиск новых способов, препятствующих их попаданию в препараты иммуноглобулинов человека.

Конюхов А.В., Астахов А.В., Бартновскис Э., Русанов В.М. Качество и безопасность – основа эффективности производства препаратов крови. – М.: Медпрактика-М, 2010. – С. 125.

Baylis S.A., Koc Ő., Nick S., Blümel J. Widespread distribution of hepatit E virus in plasma fractionation pools // Vox Sang. – 2012. – Vol. 102, № 2. – P. 182–183.

Bertolini J., Goss N., Curling J. Production of plasma proteins for therapeutic use. – N.J.: John Wiley & Sons, – 2013. – P. 363–364.

Biersert L. Virus validation studies of immunoglobulin preparations // Clin. Exp. Rheumatolol. – 1996. – Vol. 14. – P. 47–52.

Bos O.J.M., Sunye D.G.J., Nieeuweboer C.E.F., van Engelenburg F.A.C., Schuitemaker H., Over J. Virus validation of pH 4-treated human immunoglobulin products produced by the Cohn fractionation process // Biologicals.– 1998. – Vol. 26. – P. 267–276.

Burnouf T., Radosevich M. Nanofiltration of plasma-derived biopharmaceutical products // Haemofilia. – 2003. – Vol. 9. – P. 24–37.

Burnof T., Radoshevich M. Reducing the risk of infectionfrom plasma products: specificpreventive strategies // Blood Rev. – 2000. – Vol. 14. – P. 94–100.

Chang C.E., Eо H.G., Lee Y.S., Chung S.K., Shin J.S., Lah Y.K., et al. Human intravenous immunoglobulin preparation and virus inactivation by pasterisation and solvent detergent treatment // Prep. Biochem. Biotechnol. – 2000. – Vol. 30. – P. 177–197.

CHMP/BWP/5180/03 Guidline on assessing the risk for virus transmission– new chapter 6 of the note for guidance on plasmaderived medical products (CPMP/BWP/269/95).

CPMP/BWP/268/95 Guidance on Virus Validation Studies: the design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses. Date for coming into operation: 14 August 1996. (CPMP/BWP/268/95) Version 2. February 1996.

Dichtelmüller H., Rudnick D., Kloft M. Inactivation of lipid enveloped viruses by octanoic Acid treatment of immunoglobulin solution // Biologicals. – 2002. – Vol. 30, № 2. – P. 135–142.

Dichtelmüller H.O., Biersert L., Fabrizzi F., Gajardo R, Grőner A. von Hoegen I., et al. Robustness of solvent/detergent trestment of plasma derivatuves: a data collection from Plasma Ptotein Theraputic Association member companies // Transfusion. – 2009. – Vol. 49. – P. 1931–1943.

Dichtelmüller H.O., Biersert L., Fabtizzi F., Falbo A., Flechsig E., Grőner A., et al. Contribution to safety of immunoglobulin and albumin from virus partitioning and inactivation by cold ethanol fractionation a data collection from PPTA member companies // Transfusion. – 2011. – Vol. 51. – P. 1412–1430.

EMEA/CPMP/BWP/2879/02, CPMP Position statement on Creutzfeldt-jakob disease and plasma-derived and urine-derived medical products, London, 20 February 2003.

Eun Kyo Jeong, Hark Mo Sung, In Seop Kim. Inactivation and removal of influenza A virus H1N1 during the manufacture of plsma derivates // Biologicals. – 2010. – Vol. 38. – P. 652–657.

Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products. WHO Technical Report, Series № 924, 2004.

Kang C.A., Grőner H.O. Prion removal capacity of plasma protein manufacturing processes // Dichtelmüller Transfusion. – 2013. – V. 53, № 9. – P. 1894–1905.

Kempf C., Jentsch P., Poirier B., Barre-Sinoussi F., Morgenthaler J.J., Morell A. Virus inactivation during production of intravenous immunoglobulin // Transfusion. – 1991. – Vol. 31. – P. 423–427.

Korneyeva M., Hotta J., Lebing W., Rosenthal R.S., Franks L., Petteway S.R., Jr. Enveloped virus inactivation by caprylate: a robust alternative to solvent-detergent treatment in plasma derived intermediates // Biologicals. – 2002. – Vol. 30, № 2. – P. 153–162.

Louie R.E., Galloway C.J., Dumas M.L., Wong M.F., Mitra G. Inactivation of hepatit C virus in low pH intravenous immunoglobulin // Biologicals. – 1994. – Vol. 22. – P. 13–19.

Lundblad J.L., Seng R.L., Inactivation of lipid-enveloped viruses in proteins by caprylate // Vox Sang. – 1991. – Vol. 60. – P. 75–81.

Omar A., Kempf C. Removal of neutralized model parvoviruses and enteroviruses in human IgG solutions by nanofiltration // Transfusion. – 2002. – Vol. 42. – P. 1005–1010.

Poelsler G., Berting A., Kindermann J., Spruth M., Hämmerle T., Schwarz H.P., Kreil T.R. A new liquid intravenous immunoglobulin with three dedicated virus reduction steps: virus and prion reduction capacity // Vox Sang. – 2008. – Vol. 94, № 3. – P. 184–192.

Rabenaau H.F., Biesert L., Schmidt T., Baeur G, Cinatl J., Doerr H.W. SARS-corona virus (SARS-CoV) and the safety of a solvent/detergent treated immunoglobulin preparation // Biologicals. – 2005. – Vol. 33. – P. 95–99.

Späth P.J., Kempf C. Challenges and achievements in pathogen safety of intravenous immunoglobulin // In: Intravenous immunoglobulins in the third millennium / Eds. M.C. Dalakas, P.J. Späth. – Boca Raton, London, New York, Washington: Parthenon Publishing Group, 2004.

Seitz H., Blümel J., Schmidt I., Willikommen H., Lőwer J. Comparable virus inactivation by bovine or vegetable derived tween 80 during solvent/detergent treatment // Biological. – 2002. – Vol. 30. – P. 197–205.

Sofer G., Lister D.C., Boose J.A. Inactivation methods grouped by virus // BioPharm Inter. Supplement S-37-42, part 6. – 2003.

Tateishi J., Kitamoto T., Mohri S., Satoh S., Sato T., Shepherd A., MscNaughton M.R. Scrapie removal using Planova virus filters // Biologicals. – 2001. – Vol. 29. – P. 17–25.

Thyer J., Unal A., Thomas P., Eaton B., Bhashyam R., Ortenburg J., et al. Prion-removal capacity of chromatographic and ethanol precipitation steps used in the production of albumin and immunoglobulins // Vox. Sang. – 2006. – Vol. 91. – P. 292–300.

Trejo S.R., Hotta J.A., Lebing W., Stenland C., Storms R.E., Lee D.C., et al. Evaluation of virus and prion education in a new intravenous immunoglobulin manufacturing process // Vox Sang. – 2003. – Vol. 84. – P. 176–187.

Troccoli N.M., McIver J., Losikoff A., Poiley J. Removal of viruses from human intravenous immune globulin by 35 nm nanofiltration // Biologicals. – 1998. – Vol. 26. – P. 321–329.

Uemura Y., Yang Y.H.J., Heldebrant C.M., Takechi K., Yokoyama K. Inactivation and elimination of viruses during preparation of human intravenous immunoglobulin // Vox. Sang. – 1994. – Vol. 67. – P. 246–254.

Van Holten R.W., Autenrieth S., Boose J.A., Hsieh W.-T., Dolan S. Removal of prion challenge from an immune globulin preparation by use of size-exclusion filter // Transfusion. – 2002. – Vol. 42. – P. 999–1004.

WHO recommendations for the production, control and regulation of human plasma for fractionation, annex 4, WHO Technical Report Series № 941, 2007.

41. WHO recommendations for the production, control and regulation of human plasma for fractionation, annex 4, WHO Technical Report Series no. 941, 2007.

Beriple x P/N: increasing the capacity of virus elim inat ion whil e main taini ng product quality. Beitr.

Recommendations

INTRAVENOUS ANTI-ALLERGIC IMMUNOGLOBULIN

Method for producing virus-inactivated immunoglobulin solutions low in residual caprylic acid.

UMAN IMMUNOGLOBULIN PREPARATION AGAINST CYTOMEGALOVIRUS

intravenous immunoglobulin

Сравнение качественных показателей внутривенного иммуноглобулина, отличающихся составом и способом п.

Stabilizers and osmolarity of intravenous immunoglobulin drugs. A necessity to evaluate a final ther.

Влияние препарата альбумина на генерацию активных форм кислорода in vitro.

Осмоляльность препарата Иммуновенин

Осмолярность относится к одному из наиболее важных показателей безопасности и качества препаратов вводимых внутривенно в большом объеме (трансфузионно-инфузионным). Европейская Фармакопея регламентирует только нижний предел показателя осмолярности препаратов внутривенного иммуноглобулина - не менее 240 мОсм/кг, в тоже время по мнению эксперта фирмы Биотест (Германия) Фридриха Шнепфа должен быть . [Show full abstract] установлен и верхний предел - не более 350 мОсм/кг, особенно, для пациентов с недостаточной функцией почек (новорожденных, старше 60 лет). Осмолярность (криоскопический метод) в 24 сериях препарата "Иммуновенин" составила от 313,4 до 324,6 мОсм/кг (95% доверительный интервал), что позволяет отнести препарат иммуноглобулин человека нормального для внутривенного введения "Иммуновенин" к категории физиологичных (нормоосмолярных) по показателю осмолярность (осмоляльность), и даже даже больше, идеальных по осмолярности.

Изобретение относится к области жидкостной хроматографии. Предложен способ хроматографического выделения иммуноглобулина, включающий растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону. Производят предварительную очистку полученного раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора. После сбора предварительно очищенной жидкой фракции, содержащей иммуноглобулин, ее направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию, а затем на хроматографическую очистку, осуществляемую в системе из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно. Проводят элюирование иммуноглобулина с колонки, заполненной катионитом, а колонки с анионитом и гидрофобным сорбентом направляют на регенерацию. Изобретение обеспечивает возможность выделения иммуноглобулина из необогащенного сырья - осадка А, полученного спиртовым фракционированием плазмы крови по Кону, с высоким выходом и чистотой целевого продукта. 7 з.п. ф-лы, 2 пр.

Формула изобретения

1. Способ хроматографического выделения иммуноглобулина, включающий растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, вирусную сольвент-детергентную инактивацию, хроматографическую очистку раствора, содержащего иммуноглобулин, путем его пропускания через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом соответственно, промывку системы колонок, элюирование иммуноглобулина с катионита буферным раствором, имеющим рН и концентрацию, достаточные для его эффективного выделения, и направление на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента, отличающийся тем, что в качестве исходной белковой фракции плазмы крови используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону, который после растворения подвергают предварительной очистке, осуществляемой в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора и сбором предварительно очищенной жидкой фракции, которую затем направляют на сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве осадка А используют необогащенную фракцию, содержащую около 10% иммуноглобулина, посторонние белки и липиды.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве анионита используют полимерный акриловый сорбент с диэтиламиноэтильными группами, в качестве катионита используют полимерный акриловый сорбент с сульфопропильными группами, а в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что вирусную сольвент-детергентную инактивацию осуществляют в растворе, содержащем твин-80 и трибутилфосфат.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе используют натрий-ацетатный буферный раствор, причем все колонки предварительно уравновешены этим раствором.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед элюированием катионит промывают последовательно раствором, содержащим 2% твин-80, затем раствором, содержащим 1% твин-80 и 20% этанола, а затем буферным раствором.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование иммуноглобулина с катионита осуществляют натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 5,65 и концентрацию 0,35 М.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование иммуноглобулина с катионита осуществляют натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 6,0, концентрацию 50 мМ и содержащим 300 мМ хлористого натрия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области выделения и очистки веществ методами хроматографии и может быть использовано для получения высокоочищенного иммуноглобулина.

Для разделения смеси белков используют различные физико-химические и химические методы. Общепринятым способом фракционирования белков плазмы крови человека является метод Кона, предусматривающий использование этанола при низкой температуре от -3 до -5°С. В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Для дальнейшего выделения и очистки индивидуальных компонентов из полученных фракций наибольшее распространение в последнее время получил метод хроматографии.

Известен способ очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию при комнатной температуре и хроматографическую очистку, при которой надосадочная жидкость, содержащая IgG, подвергается, по меньшей мере, одной операции обработки, например, в два этапа, но при необходимости и нескольким этапам анионообменной и катионообменной хроматографии для удаления значительной доли оставшихся загрязняющих примесей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения осветленная и, при необходимости, профильтрованная надосадочная жидкость, содержащая IgG, наносится на анионообменную смолу и затем на катионообменную смолу, которыми заполнены две последовательно установленные колонки, уравновешенные одним и тем же буферным раствором. После промывки колонку с анионитом отключают, а колонку с катионитом, на которой сорбирован иммуноглобулин, элюируют буферным раствором с рН и концентрацией, достаточными для эффективного выделения целевого продукта в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации и обрабатывают Tween-80 и трибутилфосфатом для разрушения вирусов. Полученный раствор снова пропускают через две последовательно соединенные колонки с анионитом и катеонитом аналогично описанному выше. Колонку с анионитом отсоединяют и элюируют фракцию с IgG в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG собирают в мальтозе и подвергают концентрированию (RU 2197500, 27.01.2003).

Недостатками способа являются его сложность, многостадийность и низкий выход целевого продукта (менее 73%). При этом в качестве сырья может быть использована только предварительно очищенная фракция, т.е. осадок В по методу Кона, содержащая около 30% иммуноглобулинов.

Однако вышеописанные способы не позволяют осуществить экономичную и эффективную очистку иммуноглобулина из необогащенной фракции - осадка А (по Кону) при обеспечении высокого выхода целевого продукта.

Наиболее близким по технической сущности и достигнутому результату является способ выделения и очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку, осуществляемую путем пропускания раствора через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно, с промывкой системы колонок, элюированием иммуноглобулина с катионита буферным раствором, и направлением на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента. Способ обеспечивает достижение высокого выхода и высокой чистоты иммуноглобулина, свободного от вирусов при использовании в качестве исходного сырья обогащенной фракции осадка В, содержащей примерно 30% иммуноглобулина (RU 2332247, 01.07.2007).

Однако способ, выбранный за прототип, не позволяет получить высокоочищенный иммуноглобулин из осадка А (по Кону), содержащего значительные количества других белковых примесей, примеси липидов и лишь около 10% иммуноглобулина. Если же предварительно осадок А перевести в осадок В осаждением органическими растворителями и центрифугированием, то эти операции приведут к 30%-ной потере иммуноглобулина. Например, из 170 л плазмы при фракционировании обычно получают около 9 кг осадка А с содержанием иммуноглобулина 1,4-1,5 кг, из этого количества получают около 3,5 кг осадка В с содержанием иммуноглобулина 1,0-1,1 кг, что соответствует выходу 72-73%. Стадия хроматографии обеспечивает выход на уровне 90%. Таким образом, общий выход иммуноглобулина из осадка А с использование способа-прототипа составит только около 65%.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокопроизводительного способа хроматографического выделения высокочистого иммуноглобулина из бедного исходного сырья, каким является, в частности, осадок А, получаемый при фракционировании белков плазмы крови по методу Кона.

Поставленная задача решается описываемым способом хроматографического выделения иммуноглобулина, который предусматривает растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону, осуществление предварительной очистки раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора и сбором предварительно очищенной жидкой фракции, которую затем направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку путем пропускания через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно, после чего проводят промывку системы колонок, элюирование иммуноглобулина с катионита буферным раствором, имеющим рН и концентрацию, достаточные для его эффективного выделения, и направление на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента.

Предпочтительно, в качестве осадка А используют необогащенную фракцию, содержащую около 10% иммуноглобулина, посторонние белки и липиды.

Предпочтительно, в качестве анионита используют полимерный акриловый сорбент с диэтиламиноэтильными группами, в качестве катионита используют полимерный акриловый сорбент с сульфопропильными группами, а в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм.

Вирусную сольвент-детергентную инактивацию, преимущественно, осуществляют в растворе, содержащем твин-80 и трибутилфосфат.

В заявленном способе, преимущественно, используют натрий-ацетатный буферный раствор, при этом все колонки предварительно уравновешены этим раствором.

Предпочтительно, перед элюированием катионит промывают вначале раствором, содержащим 2% твин-80, затем раствором, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола, а затем буферным раствором.

Возможно, элюирование иммуноглобулина с катеонита проводить натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 5,65 и концентрацию 0,35 М.

Возможно также, элюирование иммуноглобулина с катеонита проводить натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 6,0, концентрацию 50 мМ и содержащим 300 мМ хлористого натрия.

Ниже приведены конкретные примеры осуществления изобретения.

9,2 г осадка А растворяют в 250 мл буфера А (0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,65) при перемешивании в течение ночи при температуре +5°С, затем в течение 4 ч при комнатной температуре.

Полученный раствор пропускают последовательно через две соединенные хроматографические колонны: первую - объемом 50 мл (2,5×10,2 мм), заполненную гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 100-250 мкм, и вторую - объемом 35 мл (2,5×7,1 см), заполненную ДЕАЕ-сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 100-250 мкм. Колонны предварительно уравновешены буфером А. Скорость потока 2 мл/мин. Вслед за раствором иммуноглобулина пропускают буфер А до снижения оптической плотности до уровня базовой линии.

На гидрофобном и ДЕАЕ сорбентах сорбируются пирогены, альбумин, гидрофобные белки, липидная фракция и белковые агрегаты.

Объем предварительно очищенной фракции составляет 450 мл.

К 450 мл полученного раствора иммуноглобулина добавляют твин-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого и инкубируют 6 ч при перемешивании при комнатной температуре.

Подготовленный таким образом раствор иммуноглобулина пропускают последовательно через соединенные между собой три колонны. Первая - диаметром 2,5 и длиной 3,0 см - заполнена ДЕАЕ-полимерным сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 100-250 мкм, вторая колонна диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 100-250 мкм, третья колонна заполнена сульфокатионитом на основе акрилового полимера с размером частиц 100-250 мкм и имеет размеры: диаметр 2,5 см, длина 10 см. Все колонны предварительно уравновешены буфером А.

На первой колонне (анионит) происходит удаление пирогенов, ДНК-, РНК-примесей, белковых агрегатов.

На второй колонне (гидрофобный сорбент) происходит удаление пирогенов и связывание трибутилфосфата.

На третьей колонне (катионит) осуществляется сорбция иммуноглобулинов.

После окончания процесса сорбции для промывки через все колонны пропускают 100 мл буфера А. Затем колонки с анионитом и с гидрофобным сорбентом отключают и направляют на регенерацию. Колонку с катионитом промывают в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (300 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (350 мл), и на третьем колонку промывают 200 мл буфера А. Затем осуществляют элюирование иммуноглобулина 0,35 М натрий-ацетатным буфером с рН 5,65 (буфер Б). Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 2 мл/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 7 мл/мин.

В результате осуществления способа получено 1,2 г иммуноглобулина (50 мл раствора с концентрацией иммуноглобулина порядка 20 г/л).

Выход - 75%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - более 97,8%.

9,0 г осадка А растворяют в 250 мл буфера А (0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,75) при перемешивании в течение ночи в при температуре +5°С, затем в течение 4 ч при комнатной температуре.

Полученный раствор пропускают последовательно через две соединенные хроматографические колонны: первую - объемом 50 мл (2,5 х 10,2 мм), заполненную гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 63-200 мкм, и вторую - объемом 35 мл (2,5×7,1 см), заполненную ДЕАЕ-сорбентом на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 40-60 мкм. Колонны предварительно уравновешены буфером А. Скорость потока 2 мл/мин. Вслед за раствором иммуноглобулина пропускают буфер А до снижения оптической плотности до уровня базовой линии.

Объем предварительно очищенной фракции составляет 440 мл.

К 440 мл полученного раствора иммуноглобулина добавляют твин-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого и инкубируют 6 ч при перемешивании при комнатной температуре.

Подготовленный таким образом раствор иммуноглобулина далее пропускают последовательно через соединенные между собой три колонны. Первая - диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена ДЕАЕ-полимерным сорбентом на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 40-60 мкм, вторая колонна диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 63-200 мкм, третья колонна заполнена сульфокатионитом на основе агарозы с размером частиц 40-60 мкм и имеет размеры: диаметр 2,5 см, длина 10 см. Все колонны предварительно уравновешены буфером А.

После окончания процесса сорбции осуществляют промывку. Для промывки через все колонки пропускают 100 мл буфера А. Затем колонки с анионитом и с гидрофобным сорбентом отключают и подвергают регенерации.

Колонку с катионитом промывают в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (300 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (350 мл), а затем колонку промывают 200 мл буфера А.

Элюирование иммуноглобулина осуществляют 50 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 6,0, содержащим 300 мМ хлористого натрия (буфер Б).

Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 3 мл/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 7 мл/мин.

В результате получено 1,25 г иммуноглобулина (50 мл раствора с концентрацией иммуноглобулина порядка 20 г/л).

Выход -81%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - более 98,2%.

Заявленный способ был проведен также с другими анионообменниками и катионообменниками, обладающими достаточной емкостью и соответствующей присутствующим белкам пористой структурой. Наилучшим гидрофобным сорбентом для осуществления способа оказался сорбент с диаметром пор менее 10 нм. В способе были применены также другие не денатурирующие кислотные буферные растворы, однако, предпочтительно, оказалось использовать ацетатный буферный раствор с рН от 5 до 6 и концентрацией 0,01-0,5 М.

Таким образом, сущность настоящего изобретения сводится к использованию в голове процесса соединенных между собой двух колонок с гидрофобным сорбентом и ДЕАЕ-сорбентом, что позволяет очистить жидкую фазу, полученную растворением осадка А (по Кону), от липидных примесей и белковых агрегатов без применения органических растворителей и подготовить полученный раствор для эффективной инактивации. Далее использование для хроматографии системы из трех колонок позволяет получить высокоочищенный продукт без дополнительных рехроматографий. Изобретение позволяет использовать единый буферный раствор в качестве элюента для всех пяти колонок, что существенно упрощает процесс. Технический результат изобретения заключается в возможности выделения иммуноглобулина из бедного (необогащенного) сырья при обеспечении высокого выхода и чистота целевого продукта.

Читайте также: