Среда для создания вирусов

Обновлено: 19.04.2024

Культивирование вирусов. Биотехнологии в вирусологии.

Массовое выращивание клеток в культуре является центральным звеном любого технологического процесса, основанного на использовании клеток животных, и, в первую очередь, производства вирусных препаратов. Эта стадия определяет массу и качество клеток и, тем самым, в целом технологию получения вирусного сырья. Выбор способа культивирования вируса в значительной мере определяется способностью клеток размножаться на поверхности плотного субстрата или в суспензионной культуре. Трудно определить верхние и нижние границы крупномасштабного или промышленного выращивания вирусов в клеточных культурах. Все зависит от масштабов производства вирусных препаратов. В одних случаях речь идет о получении сотен литров, в других — десятков и даже сотен тысяч литров культурального вируса в год. Это зависит от вида вакцин и масштабов их применения. Изготовление живых вакцин при прочих равных условиях всегда требует меньших объемов вирусного сырья, нежели приготовление инактивированных, в особенности концентрированных вакцин.

Отсутствие эффективных вакцин для профилактики некоторых заболеваний объясняется, прежде всего, отсутствием экономичного способа получения иммуногенного материала в достаточном количестве.

В отличие от инактивированных вакцин против ящура и полиомиелита, выпускаемых в больших количествах, при многих заболеваниях человека и животных применяют живые вакцины, для изготовления которых не требуется большого количества вирусного сырья. Это, прежде всего, относится к тем вакцинам, которые перед применением разводят. Ежегодно производство таких вакцин, связанное с получением сотен литров культурального вируса, удовлетворяется использованием статических или вращающихся культуральных сосудов. Однако такие методы культивирования вирусов не могут удовлетворить крупномасштабное производство ряда вирусных вакцин. Например, при изготовлении противоящурной вакцины перевиваемые клетки выращивают в суспензии в реакторах с рабочим объемом более 1000 л. Крупные научно-производственные центры Южной Америки ежегодно вырабатывали до 600 млн. доз моновалентной инактивированной противоящурной вакцины. Для этой цели необходимо еженедельно получать около 20 000 л суспензионной культуры клеток ВНК-21.

До недавнего времени производство большинства вирусных препаратов основывалось на использовании первичных культур клеток из нормальных тканей различных видов домашних и лабораторных животных. Кроме того, в качестве клеточных субстратов для производства вакцин, применяемых в медицине, использовали немногие линии диплоидных клеток с ограниченной жизненной потенцией. Широкое применение таких препаратов в медицине и ветеринарной практике дало возможность достичь больших успехов в борьбе со многими опасными вирусными болезнями человека и животных. Однако первичные культуры клеток во многих отношениях не являются перспективными клеточными субстратами. Их приготовление связано с периодическим убоем животных и необходимостью выделения клеток из тканей.

Первичные культуры отличаются нестандартностью, таят в себе опасность в отношении эндогенной контаминации различными вирусами и микроорганизмами. Наконец, их сложно выращивать в условиях крупносерийного производства. Отмеченные трудности значительно возрастают в связи с тенденцией постоянного увеличения масштабов изготовления противовирусных препаратов. Кроме того, в последнее время все более широкое развитие получает разработка концентрированных и субъединичных вакцин, при изготовлении которых требуется большое количество вирусного материала. Естественно, что стоящая задача может быть решена лишь путем использования постоянных (перевиваемых) линий клеток, отличающихся способностью к бесконечной пересеваемости вне организма, высокой стандартностью, низкой стоимостью, относительной простотой трансфекции рекомбинантной ДНК и последующего клонирования высокоэффективных продуцентов, высокой вероятностью правильного посттрансляционного процессинга вновь синтезируемых белков, кодируемых трансфецирующей ДНК.

Ветеринарная наука в течение последней четверти века накопила большой опыт в изготовлении вирусных вакцин с использованием в качестве субстрата для размножения вирусов культур постоянных линий клеток животных. Особый успех достигнут в изготовлении инактивированной противоящурной вакцины. Производство вакцин против ящура имеет наиболее цитируемую технологию. Она основана на использовании линии трансформированных клеток новорожденного хомяка, выращиваемых в суспензии. Эта технология достаточно экономична, ее выполняют в биореакторах большой емкости. Накоплены определенные доказательства безопасности некоторых постоянных клеточных линий, используемых в качестве субстрата в производстве ряда биологических препаратов. Например, инактивированную противоящурную вакцину готовят из вируса, выращенного в культуре постоянной линии клеток почки новорожденного хомяка (линия ВНК-21). Более чем за 20-летний период этой вакциной привито свыше 100 млн. голов крупного рогатого скота и не обнаружено каких-либо нарушений у привитых животных, по крайней мере, в течение 2—4 лет после введения вакцины. Имеется много других примеров безопасности применения инактивированных и даже живых вакцин против ряда болезней животных, приготовленных из вирусов, размноженных в культурах различных постоянных линий клеток. Применение биологических препаратов, полученных на основе перевиваемых клеточных линий, в медицине началось намного позже, чем в ветеринарной практике.

Несмотря на очевидные преимущества постоянных линий клеток, медицинская практика до недавнего времени воздерживалась от их применения в производстве вирусных вакцин. Причина заключалась в том, что, согласно существовавшему мнению, для изготовления медицинских вирусных вакцин можно было использовать клетки из тканей только клинически здоровых животных. Производство таких вакцин ограничивалось использованием первичных и диплоидных культур клеток. В диплоидных линиях клеток человека никогда не были обнаружены латентные вирусы или спонтанная трансформация клеток. Основное возражение против использования постоянных клеточных линий для репликации вирусов и векторных рекомбинатов в производстве вирусных вакцин медицинского назначения заключалось в их возможной онкогенности из-за контаминации вакцин клеточной ДНК или генными продуктами (регуляторными белками). Интеграция гетерогенной ДНК может привести к предзлокачественным изменениям в результате активации протоонкогенов, запуску онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии. В процессе репродукции вакцинных штаммов для живых вакцин с использованием клеточных линий, латентно контаминированных другими вирусами, могут появляться вирусные гибриды с неожиданными свойствами.

Этот вопрос рассматривался неоднократно на различных научных форумах в Европе и Северной Америке. Ценность постоянных клеточных линий в качестве субстратов стала особенно очевидной благодаря успехам, достигнутым в последнее время в области фундаментальных биологических исследований, а также в связи с перспективой их использования в рекомбинантной ДНК-технологии и получении генно-инженерных биопрепаратов. Общая тенденция к применению постоянных клеточных линий в производстве медицинских иммунобиологических препаратов наметилась на рубеже 70—80-х годов. Так, в 1978 г. в Лейк-Плесиде (США) было предложено использовать лимфобластоидные клетки человека для крупномасштабного производства альфа-интерферона. В 1981 г. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов одобрил применение неопухолевых и неконтаминированных вирусами постоянных клеточных линий для производства инактивированной полиомиелитной вакцины, а затем также для инактивированной вакцины против бешенства. Такое решение дало возможность в короткий срок разработать методы крупномасштабного выращивания вирусов с использованием микроносителей и создать высокоэффективные вирусные вакцины.

В истории создания биологических препаратов ключевая роль всегда принадлежала выбору приемлемо безопасных вариантов. Решение о применении людям биопрепаратов, полученных с использованием постоянных клеточных линий, основывалось на оценке различными комитетами выгод и риска, связанных с созданием новых препаратов, по сравнению с существующими. Важнейшие потенциальные факторы риска, связанные с биологическими препаратами, производимыми на постоянных клеточных линиях, можно разделить на три категории: примесь гетерогенной ДНК, вирусы и трансформирующие белки.

Одним из основных вопросов, требующих самого пристального внимания, является потенциальная долгосрочная опасность, связанная с присутствием в препаратах примесей гетерогенных ДНК, особенно в тех случаях, когда последние могли содержать потенциально онкогенные кодирующие или регуляторные последовательности.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Среды для выращивания вирусов. Клеточные субстраты в вирусологии.

В течение многих лет разрабатывались методы выращивания небольших количеств клеток животных в лабораторных условиях. Однако наладить массовое культивирование таких клеток оказалось не простой задачей. Способ выращивания, характер используемой среды, методы управления и контроля в значительной степени зависят от типа выращиваемых клеток. Все культивируемые клетки первоначально получают от животных путем механической или ферментативной дезагрегации нормальных или малигинизированных тканей либо с помощью перфузии in vivo.

Первичные культуры обычно получают трипсинизацией тканей куриных эмбрионов или тканей (чаще всего почек), взятых от других видов здоровых животных. Возраст используемых эмбрионов может значительно различаться и влиять на выход и жизнеспособность клеток. Для более полного контроля доноров ткани их следует брать из SPF-хозяйств.

Первичные культуры клеток почек зеленых мартышек обычно используют для приготовления полиовирусной вакцины. Поскольку обезьяны являются очень дорогим объектом для увеличения выхода клеток почки дезагрегируют методом перфузионной трипсинизации in vivo, а затем первичную культуру выращивают на микроносителях. Для изготовления других медицинских вакцин широко применяют первичную культуру клеток почки кроликов, телят и других животных. Для изготовления вакцин, используемых в ветеринарной медицине, чаще всего применяют первичные культуры клеток куриных эмбрионов и почек естественного хозяина или восприимчивых животных.

Первичные культуры в зависимости от типа ткани и условий выращивания значительно различаются. Некоторые из них погибают через несколько дней после посева, тогда как другие могут длительно сохраняться в культуре без заметных морфологических и биохимических изменений. С момента приготовления первичной культуры до остановки роста клеток и гибели культуры после серийных пересевов проходит от нескольких недель до нескольких месяцев. Клетки эмбрионального происхождения при культивировании обычно сохраняют жизнеспособность более продолжительное время.

Линия клеток - первичная культура, со времени получения субкультуры клеточные линии могут иметь ограниченный срок жизни in vitro (например, диплоидные фибробласты человека и животных), а могут размножаться in vitro неограниченно долго. В последнем случае их называют постоянными, стабильными или непрерывными клеточными линиями.

В связи с трудностями получения соответствующих количеств первичных культур клеток почки зеленой мартышки (по причине стоимости) и преимуществами использования предварительно изученных клеточных культур для производства вакцины против полиомиелита и других вакцин были лицензированы диплоидные линии клеток WI-38 и MRC-5. Существуют сомнения в том, что ростовые свойства и продуктивность диплоидных клеток варьируют. Даже хорошо охарактеризованные диплоидные линии клеток ведут себя неодинаково при работе с ними различных исследователей.

Штамм клеток — популяция однородных клеток (по одному или нескольким маркерам), сохраняющая специфические свойства в течение ограниченного периода культивирования. Штамм клеток может происходить из первичной культуры либо от линии клеток, получающих специфические свойства путем селекции или клонирования.

Линия гетероплоидных клеток. Этот термин означает, что клеточная линия имеет менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом. Этот термин не означает, что клетки являются злокачественными или способны расти до бесконечности.

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях путем заражения животных, культур клеток и тканей. Культивирование вирусов производят в диагностических целях (выделение от больных и носителей), при экспериментальной работе (изучение вирусов), для производства вирусных вакцин и диагностикумов.

Гальтье (V. Galtier) впервые осуществил в 1879 г. культивирование вируса бешенства, заразив кролика мозгом больной собаки. Левенштейн (A. Lowenstein, 1919) первый опубликовал данные об успешной передаче вируса герпеса от человека кролику. Грютер (W. Gruter, 1920) доказал возможность культивирования вируса герпеса на кроликах. Способность вируса вакцины (коровьей оспы) репродуцироваться в тканевой культуре была доказана Паркером и Наем (F. Parker, В. N. Nye) в 1925 г. В 1931 г. Вудрафф (А. М. Woodruff) и Э. Гудпасчер показали возможность К. в. на хорион-аллантоисной оболочке эмбрионов кур (вирус оспы птиц).

Вирусы репродуцируются только в живых клетках, поэтому для их накопления заражают вирусами животных или культуры клеток и тканей. При этом происходит адаптация вируса, полученного из организма больного или носителя, к новым условиям. Чем меньше отличается искусственная система от естественной, тем легче осуществляется адаптация вируса.

Для оптимальной репродукции вируса необходимо использовать наиболее чувствительную систему и проводить заражение сильно разведенным свежим материалом, поскольку инактивированные вирусные частицы могут тормозить размножение инфекционных вирионов. Система, в к-рой вирус проходит полный цикл репродукции, носит название пермиссивной (разрешающей). В непермиссивной (неразрешающей) системе происходит неполный цикл репродукции вируса либо он вообще не репродуцируется. Пермиссивная для данного вируса система может стать для него непермиссивной при изменении условий культивирования, напр, при изменении температуры.

На животных культивируют те вирусы, которые вызывают у них четкую клиническую или патологоанатомическую картину (напр., развитие у мышей параличей при заражении вирусом бешенства или пневмонии при гриппозной инфекции). Многие вирусы лучше растут в мало-дифференцированных тканях эмбрионов птиц и новорожденных млекопитающих, чем в организме взрослых особей.

Для Культивирования вирусов используют мышей, крыс, морских свинок, кроликов, сирийских хомячков, африканских хорьков, обезьян, кур и др. На взрослых мышах культивируют вирусы гриппа, бешенства, многие тогавирусы; мыши-сосунки незаменимы при выращивании ряда вирусов Коксаки и тогавирусов ряда ареновирусов — возбудителей вирусных геморрагических лихорадок.

Сосунков белых крыс и сирийских хомячков часто используют для культивирования онкогенных вирусов. Морские свинки служат для выращивания вирусов ящура, марбургской болезни и др. Из обезьян наиболее часто используют зеленых африканских мартышек и разные виды макаки. Так, изучение вирусов полиомиелита и желтой лихорадки стало возможным после их адаптации к организму макак. Культивирование возбудителей некоторых медленных инфекций (куру, болезни Крейтцфельдта—Якоба), а также вирусов гепатитов А и В впервые удалось при заражении шимпанзе. Чувствительными к вирусу гепатита А также оказались южноамериканские обезьяны мармозеты.

Для получения стандартных результатов животные, используемые для работы с вирусами, должны быть генетически однородными. Этой цели служит инбредное скрещивание лаб. животных — братьев и сестер или родителей и детей, чем достигается возрастающая степень гомозиготности.

Для успешного К. в., помимо вида и возраста животных, имеет значение путь введения материала, что обусловлено тропностью вируса. Поэтому в большинстве случаев для размножения вируса в организме животного необходима его инокуляция в чувствительную ткань. Лишь некоторые вирусы патогенны для животных при любых способах инокуляции (напр., вирус венесуэльского энцефалита лошадей для мышей).

Большинство нейротропных вирусов культивируют путем введения их в полушария головного мозга животных. Этим путем заражают мышей различными тогавирусами, буньявирусами и другими арбовирусами. Вирус бешенства вводят таким же образом мышам, кроликам, овцам и собакам, вирус лимфоцитарного хориоменингита — мышам и морским свинкам. При культивировании вируса полиомиелита на обезьянках его инокулируют в спинной мозг или таламус головного мозга. Часто при культивировании нейротропных вирусов их вводят животным в брюшную полость, однако этот путь инокуляции уступает по чувствительности внутримозговому. Респираторные вирусы культивируют обычно путем интраназального заражения — их закапывают в нос наркотизированным животным или вводят в виде аэрозоля в специальной камере.

Аденовирусы инокулируют сирийским хомячкам подкожно или в слизистую оболочку защечных мешков, вирус герпеса обезьян — кроликам внутрикожно, а оспенные вирусы — на скарифицированную кожу (кроликам, телятам, курам). Вирусы оспы и герпеса можно культивировать на скарифицированной роговице кролика. Введение вирусов в мышцу, внутривенно, через рот и per rectum применяют редко. Внутривенное заражение морских свинок, хомячков и хорьков технически сложно, вместо этого материал чаще вводят в полость сердца.

Культивирование вирусов на животных очень затрудняется наличием в их организме различных бактерий, микоплазм и вирусов, которые могут загрязнить культивируемый вирус. Иногда вирус, находящийся в организме животного, создает иммунитет к культивируемому вирусу, напр, возбудитель эктромелии у мышей к вирусу вакцины.

Для уменьшения риска загрязнения культивируемых вирусов посторонними возбудителями все чаще используют животных, выращенных в условиях изоляции. С этой целью получают животных, свободных от специфических для данного вида патогенных агентов,— SPF (specific pathogen free). У их матерей не должно быть инфекций, передающихся через плаценту. Детенышей извлекают при помощи кесарева сечения, вводят им в кишечник апатогенные бактерии, напр, молочнокислые, после чего они вскармливаются SPF самками. В дальнейшем эти животные размножаются обычным путем. Содержат их в закрытых помещениях, куда подается стерильный воздух, пища, вода и пр.

Животных, свободных от всяких возбудителей, содержат в специальных боксах в условиях еще более строгой изоляции (см. Стерильные животные).

Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Для получения оптимальных результатов имеет значение вид и возраст эмбрионов, путь заражения, введенная доза и температура инкубации. Чаще всего используют эмбрионы кур. Они наиболее чувствительны до 13-го дня инкубации. Инокулируют вирусы обычно на хорион-аллантоисную оболочку, в желточный мешок, аллантоисную и амниотическую полость; в мозг эмбрионов и внутривенно (в сосуды оболочек) вирусы вводят редко. В желточном мешке культивируют многие тогавирусы; вирусы гриппа и инфекционного паротита хорошо культивируются в амниотической полости 10 —11-дневных эмбрионов, при этом вирус гриппа размножается не только в клетках амниона, но также в трахее и легких эмбриона. Вирусы оспенной группы и др. культивируют на хорион-аллантоисной оболочке, заражая 10—13-дневные эмбрионы через естественный воздушный мешок или через отверстие на боковой поверхности яйца после создания искусственного воздушного мешка. При заражении любым путем эмбрионы могут быть травмированы, поэтому их гибель в первые 24 часа расценивается как неспецифическая. Оптимальное количество вируса при заражении — 1000 — 10 000 инфекционных доз. К. в. в эмбрионах обычно происходит при t° 36—37°. Некоторые вирусы, напр, вирус вакцины, могут размножаться при температуре выше 40°, в то время как возбудитель натуральной оспы необходимо культивировать при температуре не выше 38,5°. Температурно-чувствительные мутанты вирусов, обладающие, как правило, сниженной патогенностью, культивируют при t° 25—28°.

При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (многие арбовирусы, вирус энцефаломиокардита и др.), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.

Большинство известных вирусов можно выращивать в культурах клеток и тканей (см.). Чаще всего используют однослойные первичные или перевиваемые клеточные культуры на стекле, реже применяют суспензионные культуры. К первичным культурам клеток вирусы адаптируются легче, чем к перевиваемым. Вирусы человека лучше всего размножаются в культурах человеческих клеток и почечных клеток обезьян.

Оптимальная доза вируса при заражении — 0,1—0,001 50% тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. Объем инокулята должен быть небольшим. Адсорбцию вируса проводят в течение 1—2 час. при t° 37°, после чего инокулят удаляют, если он токсичен для клеток. Питательная среда должна иметь pH 6,9 — 7,2. Если к ней прибавлена сыворотка, последняя не должна содержать антител или неспецифических ингибиторов по отношению к культивируемому вирусу. Наиболее интенсивная репродукция большинства вирусов происходит при t 36 — 37°; при более низкой температуре (33°) культивируют риновирусы.

При К. в. с целью их выделения из инфицированных органов весьма эффективно культивирование клеток самой исследуемой ткани после ее трипсинизации (напр., ткани миндалин для выделения аденовирусов).

Размножение большинства вирусов сопровождается цитопатическими изменениями. Максимальное количество вируса в культуре обычно наблюдается при дегенерации 75% клеток. Размножение вирусов, не обладающих цитопатической активностью, можно установить с помощью реакции гемадсорбции (многие миксо- и тогавирусы), методом иммунофлюоресценции, путем исследования культуральной жидкости на наличие гемагглютининов (напр., миксовирусы) или комплементсвязывающего вирусного антигена, а также в опытах на животных (вирус бешенства). Некоторые вирусы можно выявить по их способности подавлять размножение цитопатогенного вируса, т. е. по феномену интерференции (напр., в культурах клеток эмбрионов кур, инфицированных вирусами лейкоза птиц, не размножается вирус саркомы Рауса). Некоторые вирусы образуют в клетках включения.

Большинство вирусов после размножения в клетках выходит в культуральную среду, ряд других остается связанным с клетками (вирусы оспы, аденовирусы), некоторые герпетические вирусы необходимо пересевать вместе с неповрежденными клетками, поскольку при разрушении клеток они инактивируются. Иногда при взаимодействии вируса и клетки развивается хроническая инфекция. Напр., инфицированные вирусом лимфоцитарного хориоменингита перевиваемые человеческие клетки могут продуцировать инф. вирус в продолжение многих поколений.

Для выращивания коронавирусов человека и некоторых других используют тканевые культуры, т. е. культивируемые вне организма тканевые фрагменты. Чаще всего используют ткань трахеи кролика. О размножении вируса в этом случае судят по прекращению движения ресничек культуры ткани.

Следует учитывать возможность присутствия в культурах клеток и тканей различных вирусов и микоплазм. Они могут быть внесены вместе с клетками, если последние взяты из инфицированного организма, попасть из трипсина или используемой в качестве ингредиента питательной среды сыворотки.

Адаптация вируса к искусственным условиям размножения требует проведения нескольких пассажей, быстро следующих друг за другом при заражении небольшой дозой вируса. Обычно интенсивность репродукции вируса при этом значительно возрастает. Иногда вирус после адаптации к одной системе приобретает способность размножаться также в других системах. Свежевыделенные вирусы более пластичны, чем долго культивировавшиеся в каких-либо одних условиях. К. в. в искусственных условиях нередко приводит к снижению их патогенности для естественных хозяев, чем пользуются для получения вакцинных штаммов. В неблагоприятных условиях культивирования (малочувствительных системах или при заражении слишком большой дозой) могут формироваться дефектные вирусные частицы, содержащие лишь часть генома или не имеющие нуклеиновой к-ты. Некоторые вирусы вообще не удается культивировать в искусственных условиях или их репродукция прекращается после нескольких пассажей.

Сохранять вирусы в течение нескольких дней можно при t° 4° в среде с pH ок. 7,0. Устойчивость их возрастает при удалении клеточных фрагментов и прибавлении сыворотки (10%), глицерина (50%) или обезжиренного молока (50%). Все вирусы хорошо сохраняются при t° —70° и ниже в герметически закрытых сосудах; многие остаются жизнеспособными месяцы и даже годы. Оспенные вирусы и энтеровирусы хорошо сохраняются при t° —20°. Замораживание вируса должно происходить быстро. Для повышения устойчивости вируса прибавляют к среде сывороточный белок, куриный желток, пептон, сахарозу или глюкозу. Влияние стабилизаторов на разные вирусы неодинаково. Вирусы могут оставаться жизнеспособными длительное время и после лиофилизации. В качестве стабилизаторов при этом используют пептон (10%), молоко (50%), сахарозу с желатиной или куриным желтком (по 10 %). Лиофилизированный вирус должен сохраняться в вакууме или нейтральном газе (напр., азоте) при t° 4° или —15°.

Библиография: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974; Соколов М. И., Синицкий А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Штарке Г. и др. Практическая вирусология, пер. с нем., М., 1970, библиогр.; Comparative diagnosis of viral diseases, ed. by E. Kurstak a. C. Kurstak, v. 1—2, N. Y. a. o., 1977.

Культивирование вирусов представляет собой их выращивание в искусственных условиях. Для этого культиваторы заражают животных, либо ткани и клетки. Такое мероприятие проводят в целях диагностики, при проведении экспериментов, с целью изготовления противовирусных вакцин.

Культивирование вируса впервые было совершено Гальтье в 1879 году. Он культивировал вирус бешенства, заразив мозг кролика вирусом бешенства, полученным у больной собаки. Ученым Левенштейном была обнародована информация о возможности передачи вируса герпеса от человека кролику.

Репродуцирование вирусом осуществляется исключительно в живых клетках. По этой причине для того, чтобы они накопились, их заражают вирусами. После заражения вирус адаптируется к новому организму. Адаптация вируса проходит тем легче, чем ближе новая среда.

Чтобы репродукция прошла на лучшем уровне используют чувствительную систему, а заражение проводят свежим, но разведенным материалом. Это объясняется тем, что инактивированный вирус может приостанавливать скорость размножения вирионов. Система, в которой осуществляется репродукция, называется пермиссивной. Но, однако для каждого вируса пермиссивная система может приобрести статус непермиссивной. Это будет возможно в случае изменения условий культивирования. К примеру, таким условием являются температурные скачки.

Культивирование вируса на животных осуществляется только в том случае, ели эти вирусы приводят к формированию ясной и понятной клинической картины, либо патологоанатомической картины. Например, во время заражения мышей вирусом бешенства у них случается паралич. Большое количество вирусов хорошо вырастают в птичьих эмбрионах либо теле новорожденных млекопитающих. Реже в организме половозрелых особей.

Культивируют вирус в организмах мышей, крыс, кроликов, кур. На взрослых особях мышей выращивают вирусы гриппа и бешенства.

На белых крысах и хомяках испытывают онкогенные вирусы. Вирус ящура и маргбурской болезни культивируют на морских свинках. Ученые смогли изучить вирусы полиомиелита и желтой лихорадки только после того, как изучили их рост на макаках.

Возбудителей некоторых инфекций ученые смогли определить только после заражения шимпанзе. К таковым относят вирусы гепатита А и В.

Чтобы ученые получили верные результаты все животные, в организме которых культивируют вирусы, должны быть генетически однородными. Для достижения этой цели осуществляют скрещивание лабораторных особей. Результатом такого действия становится растущая степень гомозиготности.

Чтобы культивирование прошло успешно, мало выбора правильного вида и возраста животного. Очень важно, какой будет использован путь для введения материала. Чаще всего вирусы вводят в чувствительные ткани. Лишь малая часть вирусов патогенна для животных независимо от способов введения.

Большая часть нейротропных вирусов выращивают путем введения их в левое и правое полушарие головного мозга животных. Так происходит дело с культивированием вируса у мышей. Кроликам, мышам, овцам, собакам и другим животным аналогичным образом вводят вирус бешенства. Очень часто для культивирования вирусов использую и другой путь: через брюшную полость. Но по чувствительности такой способ уступает введению в головной мозг. Респираторные вирусы чаще вводят в организм интраназальным путем, то есть закапывают в нос или распыляют в виде аэрозоля.

На сирийских хомячках культивируют аденовирус. Вводят его под кожу или в слизистую. В мышцу, через рот, в вену и через анальное отверстие вирусы вводят изредка. Внутривенное заражение произвести с грызунами и другими маленькими животными очень сложно. Вместо этого вирусы вводят прямо в сердечную мышцу.

Осложняется культивирование вирусов в организме животных наличием внутри иных вирусов и бактерий. Иногда случается такое, что вирус в организме животного вырабатывает иммунитет к новому культивируемому.

Чтобы снизить вероятность загрязнения культивируемых вирусов для введения материала используют выращенных в изоляции животных. Для этого выбирают животных, у матерей которых нет в организме инфекций, передающихся от матери к плоду. Новорожденных детенышей извлекают из тела матери, вводят в кишечник специальные молочнокислые бактерии. Для вскармливания таких малышей необходимы SPF самки. Затем уже между такими животными размножение осуществляется тем же путем. Содержатся малыши в закрытых помещениях, в которых осуществляется подача воздуха, свежей пищи и воды.

Животные, в организме которых не имеется никаких возбудителей, содержатся в специально отведенных боксах, в строгой изоляции.

Для культивирования вирусов подходят эмбрионы птиц. Для того, чтобы получить нужные результаты, необходимо правильно выбрать особь, ее вид и возраст, путь заражения и дозу. Температура инкубации играет также немаловажную роль. Из эмбрионов птиц чаще всего используют кур. Их организм до 13 дня отличается повышенной чувствительностью. Хорошо размножаются вирусы в желточном мешке, трахее и легких.

Независимо от пути заражения эмбрионы могут быть травмированы. По этой причине гибель эмбрионов в течение суток после заражения вирусов, ученые не расценивают, как особенную. Обычно для размножения вируса в эмбрионе необходима температура от 36 до 37 градусов. Но для некоторых вирусных клеток необходима температура 40 градусов и выше.

Размножаясь в организме эмбрионов вирусы могут приводить к гибели первых. Большую часть известных науке вирусов выращивают не только в организмах животных, но и в культурах клеток и тканей. В большинстве случаев для этих целей используют клеточные культуры на стекле. Суспензионные культуры используют очень редко. Адаптация вируса проходит легче к первичным культурам клеток, нежели к прививаемым. Для размножения человеческих вирусов лучше всего подходят клетки человека или почечные клетки обезьян.

Доза для вируса при заражении должна составлять от 0,1 до 0,001 пятидесяти процентов тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. При это объем вводимого материала должен быть невелик. Через пару часов адсорбируют вирус, только после этого в случае токсичности инокулят удаляют.

При размножении большинства вирусов наблюдаются цитопатические изменения. При дегенерации ¾ клеток в культуре наблюдают максимальное содержание вируса. Размножение вирусов, которые не обладают таким свойством, можно установить при помощи реакции гемадсорбции, путем проведения опытов на животных.

Большая часть вирусных клеток после размножения выходят в культуральную среду, другие же так и остаются связаны с клетками. Некоторые герпетические вирусы пересевают наравне с неповрежденными клетками. Это обусловлено тем, что при разрушении последних осуществляется их инактивация. В некоторых случаях взаимодействие вируса и клетки приводит к развитию хронической болезни.

Чтобы вырастить коронавирус человека, а также другие вирусы берут тканевые культуры. Чаще всего для этих целей используют ткани трахеи кролика. Понять о том, что вирус размножается можно по прекращению движения ресничек культуры ткани.

Нельзя забывать о том, что в культурах клеток и тканей могут быть вирусы и микоплазмы. Попасть туда они могут различным способом.

Для того, чтобы произошла адаптация вируса в искусственно созданных условиях, необходимо проведение нескольких пассажей. Чаще всего они последовательны при введении небольшого количества материала. Во время такой процедуры интенсивность культивирования вируса только растет. Адаптировавшись к одной системе, вирусы часто приобретают возможность размножаться в других системах. Те вирусы, которые выделены недавно, обладают повышенной пластичностью, нежели те, которые долго культивировались в других условиях.

Следствием культивирования вируса в искусственных условиях становится уменьшение их патогенности для естественных владельцев. Такое их свойство положено в основу вакцинации. Если условия культивирования неблагоприятны, то в результате процесса могут появляться дефектные вирусные частицы. В них может содержаться лишь некоторая часть генома. Существуют вирусы, которые в искусственной среде культивировать и вовсе нельзя. После нескольких пассажей их репродукция прекращается.

Вирусы сохраняют в особых условиях. Температура среды не должна быть меньше 4 градусов, а кислотность должна быть равна 7.0. При низкой температуре -70 и ниже вирусы сохраняются отлично. Для этого их помещают в плотно закрытые сосуды. При таких условиях хранения многие из них могут живут годами.

Вирус оспы и энтеровирус хорошо хранится при температуре -20 градусов. Замораживают их быстро. Для их сохранения к среде добавляют стабилизаторы, которые на каждый вирус действуют неоднозначно.

После лиофилизации вирусы могут жить на протяжении длительного промежутка времени. Стабилизаторы, которые применяют: молоко, пептон или куриный желток. Сохранение лиофилизированного вируса должно осуществляться в вакууме или нейтральном газе.

Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.

Читайте также: