Сыворотка от вируса эбола
Обновлено: 18.04.2024
Пока органы здравоохранения подсчитывают число жертв вируса Эбола, который собирает смертельный урожай в Африке и уже попал в США и Европу, ученые пытаются понять, почему он так опасен. Как ведет себя вирус Эбола в клетке, выяснили ученые с медицинского факультета Вашингтонского университета, медицинского колледжа Маунт-Синай в Нью-Йорке и Юго-Западного медицинского центра Техасского университета. В журнале Cell Host & Microbe они описали на молекулярном уровне, как вирус лишает клетку ее естественной защиты.
«Нам уже было известно, что вирус Эбола нейтрализует действие защитного вещества интерферона, — говорит руководитель научной группы Гай Амарасингх. — Теперь мы показали, как именно он это делает.
Интерферон — это вещество, которое клетка выделяет в ответ на вторжение вируса. Он запускает различные защитные механизмы. В частности, по сигналу интерферона в клетке активируется белок STAT1, который входит внутрь клеточного ядра. В случае опасности клетка открывает для него аварийный вход на ядерной мембране. Белок STAT1 — это фактор транскрипции. Оказавшись в ядре, он включает работу генов антивирусной защиты.
Как показали ученые, в разрушительной работе вируса Эбола главную роль играет белок оболочки VP24.
При этом вирусный белок не препятствует прочим транспортным потокам, в ядро продолжают поступать аминокислоты и прочие вещества. Это важно, потому что вирус использует их для своего собственного размножения.
Становится ясно, каким образом вирусу Эбола удается быстро и эффективно обезоружить клетку, чтобы размножаться без помех. Этот механизм поражения клеточной антивирусной защиты специфичен для Эболы.
Даже родственный ему вирус Марбурга, относящийся к тому же семейству филовирусов, действует по-другому. Ясно и то, что Эбола нечувствительна к действию интерферона, который используют, например, для борьбы с вирусом гриппа.
Исследователи надеются, что найденное в данной работе ключевое звено действия вируса Эбола — взаимодействие VP24 с транспортным белком — можно будет использовать как мишень для разработки лекарства. Ведь до сих пор лекарства от лихорадки Эбола не существует, и единственное, чем располагают медики, да и то в очень ограниченном количестве, — это экспериментальные вакцины, которые еще не прошли клинические исследования. Однако применять их уже приходится, чтобы спасти жизнь людям.
— Можно ли сегодня говорить о глобальной угрозе, которую несет вирус Эбола?
— Скорее нет, чем да, потому что вирус не распространяется на других континентах и ситуация остается под контролем. В Африке гораздо хуже санитарно-гигиенические условия, и с самого начала были допущены ошибки в контроле над вирусом. В Америке и Европе к безопасности относятся гораздо серьезнее.
— Почему у вируса такая высокая летальность?
— Есть несколько причин. Во-первых, это вирус не человеческий. Его природный резервуар до конца неизвестен, пока что самый вероятный кандидат — летучие мыши, у которых он не вызывает серьезных заболеваний. Но когда вирус попадает к другому виду, он становится гораздо более опасным.
Второе — вирус Эбола всегда попадает в кровь и поэтому вызывает системную инфекцию.
В отличие, например, от вируса кори, который размножается в дыхательных путях и выходит только наружу, поэтому не вызывает системных инфекций. Третье — структура вируса Эбола очень плохо узнается иммунной системой. Он одет в чехол из полисахаридов, которые неиммуногенны. Поэтому к нему очень трудно сделать вакцину.
— Но, например, ВИЧ тоже попадает в кровь и поражает иммунную систему. Но летальность от него меньше.
— Нет, она не меньше, она просто долго развивается. ВИЧ распространяется половым путем, поэтому он не может распространяться очень быстро. И кроме того, инфекция протекает длительно. А Эбола распространяется всеми возможными путями, и инфекция протекает остро.
Экспериментальная американская сыворотка от лихорадки Эбола будет использована для лечения заразившихся либерийских медиков. Препарат доставят в Либерию по просьбе президента этой страны. Это первый в новейшей истории случай официального применения не прошедшего клинических испытаний препарата на людях. Но, по мнению экспертов, вопрос об этической стороне такого лечения не стоит – терять все равно уже нечего.
Во вторник стало известно о том, что США одобрили запрос президента Либерии Элен Джонсон-Серлиф Бараку Обаме о предоставлении стране образцов экспериментальной сыворотки от распространяющейся в Африке лихорадки Эбола. На прошлой неделе в связи с эпидемией в Либерии на 90 дней было объявлено чрезвычайное положение. Ожидается, что сыворотка будет доставлена в страну представителем американского правительства до конца этой недели.
Препарат ZMapp решено использовать, несмотря на отсутствие клинических испытаний на людях. До сих пор он тестировался только на животных, и его безопасность для человека не подтверждена.
Как сообщается, сыворотку применят для лечения инфицированных врачей из Либерии. Случаи заражения врачей в ходе эпидемии исчисляются уже десятками. В июне в Либерии от лихорадки Эбола скончался работавший на эпидемии врач из Уганды. В конце июля погиб главный врач самой крупной больницы Либерии. Сообщалось, что вирус подхватил ведущий специалист по лихорадке Эбола в Сьерра-Леоне. Во вторник стало известно о госпитализации с симптомами лихорадки Эбола восьми китайских медиков, оказывавших помощь больным лихорадкой Эбола в Сьерра-Леоне. Кроме того, были госпитализированы 24 местные медсестры, работавшие в военном госпитале в столице Сьерра-Леоне Фритауне.
Были инфицированы и двое работавших в Либерии американских специалистов. Сообщается, что сыворотка ZMapp показала хорошие результаты при лечении этих медиков, а также заразившегося лихорадкой Эбола католического священника.
Впрочем, как сообщила во вторник испанская пресса, получавший экспериментальный препарат 75-летний священник Мигель Пахарес умер в Мадридской больнице, куда он был доставлен из Либерии 7 августа.
Накануне проблема использования экспериментальных лекарств на людях обсуждалась на организованной Всемирной организацией здравоохранения встрече в Женеве. Отмечалось, что речь идет о самой смертоносной вспышке лихорадки Эбола в истории. Хотя изначально возникшая в месте своего природного очага болезнь не была воспринята достаточно серьезно.
В настоящее время не существует ни универсальной вакцины от лихорадки Эбола, ни сыворотки для ее лечения.
По словам главврача столичного консультативно-диагностического центра по специфической иммунопрофилактике профессора Ивана Лешкевича, это первый в новейшей истории случай официального применения непроверенного препарата на людях. Хотя вся история иммунопрофилактики знает множество случаев испытания учеными вакцин на себе.
По словам министра, обе вакцины были произведены в НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Гамалеи, испытаны на доклиническом этапе в учреждениях Минобороны, а клинические исследования прошли совместно с Минздравом и Минобороны. Тем не менее
публикации российских ученых в рецензируемых международных научных журналах на тему разработки вакцины от лихорадки Эбола отсутствуют.
На создание вакцины требуется очень длительный срок — 10–15 лет, но активная разработка вакцин против лихорадки Эбола началась со вспышкой заболевания — осенью 2014 года министр здравоохранения России Вероника Скворцова заявила, что в течение полугода наша страна представит три вакцины от лихорадки.
С вирусом Эболы российские ученые действительно работают достаточно давно — с 1980-х годов, когда вирус еще рассматривался в качестве биологического оружия. По словам специалистов,
в то время работа шла весьма успешно, однако лаборатория особо опасных инфекций, где и велись исследования, была закрыта.
По словам профессора Михаила Щелканова, заведующего лабораторией экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, информация о том, как именно сделали вакцину и как она работает, предназначена для служебного пользования. «Ответы на подобные вопросы вправе давать лишь специально уполномоченные на то официальные лица — представители пресс-служб Минздрава и Роспотребнадзора, например. Вероника Игоревна, являясь не только министром здравоохранения, но и экспертом высокого уровня, безусловно, сказала именно то, что было можно и нужно сказать.
Впрочем, иностранные разработчики вакцин от лихорадки Эбола не стеснялись подробно рассказывать о своих успехах. Не далее как сегодня, 13 января, в престижном научном журнале Scientific Reports было опубликовано исследование американских молекулярных биологов. Ученые сообщили об успешном испытании первой многоцелевой вакцины от лихорадки Эбола, способной нейтрализовать два самых опасных штамма этого вируса.
Вирус лихорадки Эбола существует не в одном, а в пяти вариантах. Самыми опасными среди них считаются два подвида вируса — заирская Эбола, виновница эпидемии 2014 года, а также суданская Эбола, в прошлом вызывавшая крупные вспышки лихорадки. Три других штамма — Рестон, Тай-Форест и Бундибугио — не вызывали масштабных эпидемий и встречаются преимущественно среди шимпанзе и летучих мышей.
Исследовательская группа, возглавляемая учеными Джонатаном Лаем и Джоном Даем,
Исследователи, которые работают над созданием вакцины от лихорадки уже в течение нескольких лет, протестировали антитело сначала на мышах (их смертность значительно снизилась), а затем и на культурах клеток человека. Ученые планируют продолжать работу и создать новую версию антитела, которая справлялась бы с третьим штаммом вируса — Бундибугио, а также вирусом Марбургской лихорадки, который относится к семейству филовирусов — как и вирус Эболы.
Обзор
Фотография жизнерадостного молотоголового крылана, потенциального переносчика вируса Эбола.
Автор
Редакторы
Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.
Рисунок 1. Информационный плакат о вирусе Эбола.
Геморрагическая лихорадка Эбола — острая вирусная болезнь с высокой заразностью, которая характеризуется развитием тромбогеморрагического синдрома. Он выражается в снижении числа лейкоцитов (белых кровяных тел, частично отвечающих за иммунитет) у больного и, как следствие, — в уменьшении сопротивляемости организма инфекции; а затем и в снижении количества тромбоцитов, что приводит к нарушению свертываемости крови и, нередко, нарушению целостности сосудистой стенки и кровоизлияниям.
Вирус Эболы (рис. 1, 2) вызывает тяжелое заболевание с острым течением, которое обладает близкой к абсолютной летальностью в отсутствие лечения и средней — порядка 60% от всех заболевших — для пациентов, получающих симптоматическое лечение [1]. Распространяясь через физиологические жидкости больных или умерших людей и животных, а также через загрязненные биологическим материалом предметы, болезнь быстро поражает членов одной семьи или деревни после проявления симптомов инфекции. Низкая плотность населения в Африке — один из немногих естественных барьеров для передачи болезни, но представьте только потенциальную активность этого потрясающего патогена в городских условиях развитых стран! Вирус также разносится естественными носителями, обитателями влажных тропических лесов — крыланами (рис. 3), очаровательными летучими мышами, употребляемыми местными жителями в пищу.
Рисунок 2. Схема структуры вируса Эбола с изображением вирусной РНК и относительным расположением участков, кодирующих его элементы.
Рисунок 3. Крылан молотоголовый, естественный носитель вируса Эболы.
На первом этапе, наступающем через 6–10 дней после контакта с зараженным материалом [2], заболевшие (рис. 4) испытывают симптомы, схожие с другими распространенными в тропических странах заболеваниями, такими как малярия, тифоидная лихорадка (брюшной тиф) и менингит. А именно, у больного наблюдаются повышенная утомляемость, слабость, лихорадка с повышением температуры свыше 38 о С и боли в теле. Спустя еще некоторое время проявляются симптомы обыкновенных кишечных инфекций — тошнота, боли в животе, рвота и диарея.
Рисунок 4. Две медсестры около кровати с больным лихорадкой Эбола. Позднее пациент скончался.
Настоящий ад для заболевших начинается примерно через неделю после проявления первых характерных симптомов. До этого момента, без возможности сделать ПЦР-тест, геморрагическую лихорадку Эбола невозможно обнаружить.
Q-ПЦР (или количественная полимеразная цепная реакция ) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. Он применяется с целью увеличения количества РНК вирусных частиц в пробе и их последующего детектирования посредством взаимодействия с флуоресцентным красителем и регистрации излучения оптическими системами.
Через неделю после проявления первых симптомов лихорадки у больных начинается стадия обильных кровотечений. Вирус Эбола вызывает некоторое снижение свертываемости крови, что в условиях жизни африканских народов в естественном ареале распространения инфекции может провоцировать сильные кровотечения в желудочно-кишечном тракте из-за особенностей слизистых оболочек тонкого и толстого кишечника в десяти процентах случаев, а обильное кровотечение из прочих слизистых — практически в каждом втором. Это приводит к наличию крови в рвоте, кашле и стуле, что многократно повышает заразность заболевания [4].
Как же трактовать частоту появления кровоизлияний? С точки зрения чистой статистики, одна десятая численности — небольшое количество, однако это потенциальные три сотни человек при многотысячной вспышке, подобной той, что была последней в ДРК на текущий момент, которые могут истекать кровью на улице, загрязнять предметы зараженной кровью и разносить инфекцию по округе. Слоняясь в умирающих деревнях, они могут неумышленно распространить вирус на людей, остановившихся с целью помочь и облегчить страдания кажущегося раненным измученного африканца. Инкубационный период болезни вполне может позволить таким туристам покинуть очаг эпидемии.
Именно этот обзор привлек внимание и вызвал оправданное беспокойство нескольких групп эпидемиологов, в том числе американских, к опасности заболевания, возбудитель которого был быстро отнесен к первой группе патогенности.
Рисунок 5. Карта распространения вируса Эбола во время вспышки в 2013–2016 годах.
Текущая обстановка в регионах распространения заболевания остается напряженной: вспышка 2018–2019 годов окончилась при поддержке экспериментальных вакцин как на основе модифицированной ДНК, содержащей гены нуклеопротеинов и гликопротеинов вируса Эболы, так и посредством наиболее свежих на тот момент разработок — векторных вакцин на основе рекомбинантных вирусов .
Параллельно с этим больным оказывалась симптоматическая медицинская помощь в полевых госпиталях и предоставление гуманитарной помощи для находящихся на карантине пострадавших стран. К несчастью, испытания и лечение больных сопровождались вооруженными нападениями на госпитали из-за продолжающейся гражданской войны в ДРК, что неоднократно подрывало миссию медиков и поиск эффективного лечения заболевания и тестирования противовирусных препаратов [8].
Что же такое Инмазеб?
Данный трехкомпонентный препарат состоит из натуральных человеческих специфических антител, которые взаимодействует с гликопротеинами вируса Эбола и блокируют его внедрение в клетки человека, что способствует снижению скорости репликации вирусных частиц и уменьшает тяжесть течения заболевания [10]. В сочетании с имеющимися протоколами лечения болезни, вызываемой вирусом Эбола, это значительно увеличивает эффективность терапии.
Антитела — это крупные глобулярные белки плазмы крови, выделяемые плазматическими клетками иммунной системы и предназначенные для нейтрализации клеток патогенов (бактерий, грибов, многоклеточных паразитов) и вирусов, а также белковых ядов и некоторых других чужеродных веществ. Каждое антитело распознает уникальный элемент патогена, отсутствующий в самом организме, — антиген, а в пределах данного антигена — определенный его участок. Связываясь с антигенами на поверхности патогенов, антитела могут либо непосредственно нейтрализовать их, либо привлекать другие компоненты иммунной системы, чтобы уничтожить чужеродные клетки или вирусные частицы.
Для нейтрализации перечисленных выше патогенов организмом вырабатывается смесь антител, направленных на специфическое связывание с инородными веществами, однако в ряде случаев, а именно — при создании медицинских препаратов узкого спектра действия требуется выделить один компонент из настоящего сонма различных белков, продуцируемых клетками иммунной системы с весьма ограниченным сроком жизни.
Рисунок 6. Строение и типы антител с указанием структурно значимых участков.
О потенциально успешном применении моноклональных антител сообщалось во время ранних клинических препарата ZMapp для лечения лихорадки Эбола [16], и хотя его эффективность не была полностью подтверждена, именно усилия создателей данного лекарственного средства и несколько спасенных жизней показали один из возможных путей борьбы с данной инфекцией. Так начались поиски эффективного типа антител для подавления или ослабления вируса с целью облегчения течения болезни и ее лечения.
Впервые препарат REGN-EB3 был применен в качестве экспериментального лечения во время вспышки заирского эболавируса в 2018 году как на взрослых пациентах, так и на детях параллельно с проведением третьей части клинических испытаний препарата [17]. Согласно данным предварительных исследований, рекомендуемая дозировка для каждого компонента препарата составила 50 мг/кг, однако по завершении вспышки и сбора данных рекомендуемая дозировка была поднята до 100 мг/кг. Препарат разводят перед применением и однократно вводят пациенту внутривенно [18].
Научная сторона исследований
Препарат REGN-EB3, состоящий из антител атолтивимаб (REGN3470), мафтивимаб (REGN3479) и одесивимаб (REGN3471), показал высокое сродство к гликопротеинам вируса Эболы как in silico — при моделировании его активности путем молекулярного докинга, — так и in vivo — при испытании на животных и на людях. Данные электронной микроскопии показали, что при одновременном применении трех типов антител, их связывание с гликопротеином происходит на различных участках, что полностью изменяет свойства белка [18].
Антитела группы атолтивимабов и мафтивимабов успешно нейтрализовали псевдовирусные частицы (клетки, снабженные гликопротеинами вируса Эболы) при сравнительно небольших концентрациях в крови, однако применение одного одесивимаба имело несколько меньший эффект, несмотря на его наибольшее сродство к белковой структуре антигена. Одновременное применение препарата, содержащего все три группы антител, показало полную защиту подопытных животных от летального исхода на пятый, восьмой и одиннадцатый день течения болезни в сравнении с контрольной группой, которой препарат не вводили [18], [19]. Последовательное изучение влияния дозировок препарата на эффективность лечения показало, что минимальная эффективная доза в 100 мг/кг является наименьшей для лучшего контроля за симптомами инфекции [19].
В ходе клинических испытаний препарата, проведенных во время вспышки 2018–2019 годов в ДРК, было обнаружено снижение средней летальности с 50 до 27% и уменьшение общей вирулентности патогена в ходе мутаций в естественной среде обитания, что, несомненно, показывает эффективность препарата в лечении заболевания, однако все еще предполагает комбинированную терапию для достижения наилучшего результата с минимальным количеством летальных исходов.
Обнаруженные во время клинических испытаний побочные эффекты от применения препарата REGN-EB3 включали в себя лихорадку, озноб, тахикардию, учащенное дыхание и другие симптомы (рис. 6), характерные для геморрагической лихорадки Эбола средней тяжести. Полное описание свойств и особенностей представлено на странице 177 опубликованного отчета [9].
Дальнейшие планы
Согласно данным Национальной библиотеки медицины США, протокол клинических испытаний NCT03576690 был одобрен к проведению 14 октября 2020 года, и по настоящее время проводится проверка препарата для лечения болезни, вызываемой заирским эболавирусом, в рамках расширенных клинических испытаний. К исследованиям допускаются люди всех возрастов и полов, которые имеют положительный результат ПЦР-теста и не обладают противопоказаниями к применению представленного протокола лечения геморрагической лихорадки Эбола. Также стоит отметить разрешение от Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США на включение в перечень допущенных до тестирования субъектов беременных женщин, инфицированных вирусом Эбола.
Несмотря на наличие вакцины от болезни, вызываемой вирусом Эбола у многих стран мира, считается, что ей необходимы дополнительные клинические испытания на людях. Параллельно с этим проводятся расширенные клинические исследования препарата моноклональных антител для терапии больных людей. Всё вместе это отражает стремление ученых к созданию не только средств для предотвращения поражения людей этим смертельно опасным вирусом, но и способов лечения для лиц в зоне риска, а именно — жителей Западной Африки, находящихся далеко от пунктов медицинской помощи. Создание единого комплекса мер по противодействию лихорадке Эбола может стать одним из ключей, необходимых жителям африканских республик для дальнейшего развития в неблагоприятных условиях жизни.
Обзор
рисунок автора статьи
Автор
Редакторы
В начале февраля ТАСС опубликовал следующее заявление:
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора направил результаты клинических исследований вакцины фазы I–II в зарубежные научные рецензируемые журналы. Их публикация ожидается в ближайшее время. В Роспотребнадзоре подчеркнули, что до выхода международных публикаций обнародование результатов в русскоязычных научных изданиях не представляется “целесообразным” из-за “эксклюзивности и значимости для широкого круга потенциально заинтересованных лиц”.
Наблюдается противоречие между намерением разработчиков вакцины печататься в зарубежных изданиях в начале февраля и реальностью, в которой статья выходит в российском издании, аффилированном с Роспотребнадзором, во второй половине марта. Можно предположить, что рецензенты зарубежных изданий не пропустили статью в печать.
Как устроена вакцина
рисунок автора статьи
Химерный белок
В последовательности химерного белка, приведенной ниже, можно выделить часть, соответствующую бактериальному белку MBP (лиловым фоном), гис-тэг (темно-зеленым фоном) и часть, соответствующую вирусному нуклеокапсидному белку (синим фоном) (по патенту №2738081):
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRGGSG HHHHHH SGSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAA
Такая сложная конструкция химерного белка объясняется необходимостью его тщательной очистки из лизата кишечной палочки, в которой он производится для вакцинации. Одним из наиболее известных и эффективных способов добиться хорошего синтеза и очистки вирусного или другого нужного исследователям белка в микробах заключается в соединении вирусного белка с мальтозосвязывающим белком (MBP). Это соединение позволяет проводить одностадийную очистку химерного продукта с использованием амилозной смолы.
Функции улучшенной хроматографической очистки химерного белка из бактериального лизата служит и гис-тэг . Он представляет собой пептид из шести гистидинов, который особенно хорошо связывается с ионами металла при хроматографии. Это позволяет посадить на хроматографическую колонку, содержащую ионы металла, исключительно белок с гис-тэгом. Этот тэг работает как крючок. При этом другие белки и компоненты лизата кишечной палочки с колонки смываются. В определенных типах буфера связь гистидинов с ионами металлов разрушается, поэтому белок с гис-тэгом можно элюировать (смыть с колонки) такого рода растворами [5].
- 454 C RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS 477 — пептид расположен в участке рецептор-связывающего мотива в рецептор-связывающем домене шиповидного белка коронавируса SARS-CoV-2.
- 1181 C KEIDRLNEVA KNLNESLIDLQE 1201 — пептид расположен в участке гептаповтора 2 в шиповидном белке.
- 1191 C KNLNESLIDLQE LGKYEQYIK 1211 — пептид расположен в участке гептаповтора 2 в шиповидном белке.
Проблема выбора пептидов для вакцины
Экспериментальным поиском линейных B-клеточных эпитопов шиповидного белка, хорошо доступных для взаимодействия с антителами, занимались сразу несколько лабораторий [8–13]. Идея такого поиска в том, чтобы изучить антитела переболевших COVID-19 людей и найти те, которые способны связываться с пептидами, соответствующими последовательности шиповидного белка. Если такие пептиды найдутся, то, иммунизируя человека этими пептидами в составе вакцины, можно надеяться на получение антител, которые будут связываться с B-клеточными эпитопами шиповидного белка и выполнять протективную функцию.
Исследователи из разных стран независимо друг от друга провели скрининговое картирование почти всех пептидных фрагментов шиповидного белка и выявили пептиды, с которыми связываются антитела хотя бы 20% переболевших COVID-19 людей. Таким образом идентифицировали пептиды, которые соответствуют фрагментам белка, где располагаются B-клеточные эпитопы.
Эксперименты были построены так: на подложку последовательно, по принципу черепичной укладки, иммобилизовали пептиды шиповидного белка. Каждый последующий пептид перекрывался с предыдущим на половину своей длины или больше. Поэтому на подложке были представлены почти все линейные В-клеточные эпитопы шиповидного белка. Таких подложек готовилось много. Потом на каждую подложку наливалась плазма крови выздоровевших после COVID-19 людей. Далее методом иммуноферментного анализа (ИФА) [14] происходила идентификация пептидов, с которыми связались антитела.
После первичного картирования и выявления линейных фрагментов шиповидного белка, которые узнаются антителами, последовала вторая фаза исследования. В этой фазе экспериментально установили, какие пептиды способны помешать реакции нейтрализации вируса сывороткой переболевших. Фазу идентификации этих пептидов можно провести разными способами, например реакцией конкурентного вытеснения. Исследователи обогащают плазму переболевшего COVID-19 человека определенным антителом, которое способно связываться с изучаемым пептидом, а потом исследуют, может ли этот пептид помешать реакции нейтрализации живого вируса [9], [10], [13]. Если да, то это означает, что у данного пептида в составе пептидной вакцины больше шансов спровоцировать образование нейтрализующих антител. Хотя гарантий иммуногенности именно такого пептида в составе вакцины всё равно нет.
рисунок автора статьи
Тем не менее в вышеприведенных высказываниях разработчиков есть правильная логика; конечно, участки белка, соответствующие пептидам вакцины, должны быть консервативны в эволюции. Иначе пептидная вакцина станет хуже работать для мутантных вариантов вируса. Однако эти участки белка должны быть все же видны иммунной системе большинства людей и должны располагаться в доступном для антител месте. Существующие экспериментальные данные говорят нам о том, что этого не наблюдается; дополнительные доказательства приведены в таблице 1.
Если у людей очень редко образуются антитела, способные взаимодействовать с определенными фрагментами вирусного белка, то это означает, что при иммунизации соответствующими пептидами антитела на эти пептиды не смогут узнать и связать вирус у большинства людей. Нужны ли такие пептиды в вакцине для иммунизации?
Самые иммуногенные пептиды, антитела на которые лучше всего связывались с шиповидным белком и давали самый сильный ИФА-сигнал, отбирали для дальнейшей вакцинной разработки. Идея такого отбора в том, что если антитела, выработанные на пептид-антиген, хорошо связывают вирусный шиповидный белок, то этот же пептид в составе вакцины будет вызывать образование антител у человека, которые будут связывать вирусный белок у вириона и, возможно, выполнять протективную противовирусную функцию.
рисунок автора статьи
рисунок автора статьи
Неудивительно, что пептиды, найденные при скрининге и иммунизации кроликов, не совпадают с пептидами, которые узнаются антителами хотя бы у 20% переболевших COVID-19, согласно исследованиям независимых экспериментаторов [8–13].
Таким образом, из всего вышеперечисленного можно заключить, что способ выбора пептидов на основании вышеописанных экспериментов не свободен от возможности появления серьезных артефактов. На основании факта наличия взаимодействия антител с вирусным шиповидным белком на иммуносорбенте нельзя сделать вывод о том, что антитела на пептиды в вакцине могут провзаимодействовать с коронавирусом и защитить организм от вирусной инфекции.
Формирование антител после вакцинации
Итак, для определения уровня антител после вакцинации нужен спецтест. Этот спецтест не описан в открытых документах. Как он устроен — остается загадкой.
рисунок автора статьи
Эксперимент А.А. Чепурнова
Имеющиеся данные позволяют считать, что необходима официальная комиссионная проверка наличия нейтрализующих антител у людей, привитых этой вакциной. Это недорогое и быстро выполнимое исследование. По его результатам можно принять обоснованное решение о целесообразности использования вакцины в гражданском обороте и о продолжении разработки на данной платформе. Хочу отметить, что ряд крупнейших биотехнологических компаний мира (Sanofi, Merck), свернули свою работу над вакциной, убедившись в неэффективности выбранных ими платформ (ничего зазорного в этом нет).
Т-клеточный иммунитет
Проблема ИФА-тестов
Тестирование наличия, титра и характеристик антител у вакцинированных — это очень важная задача научной работы. Увы, эта задача выполнена создателями вакцины, судя по публикации [1], не на высоком уровне.
Второй ИФА-тест основан на использовании инактивированных вирионов SARS-CoV-2. Поскольку оболочка у части вирионов при инактивации и адсорбции на подложку может быть повреждена, этот тест, вероятно, способен выявлять как антитела к шиповидному, так и к нуклеокапсидному белкам коронавируса. Таким образом, в статье не доказано, что вакцина способна вызывать образование антител именно к шиповидному белку.
Но если нет антител к этому белку, нельзя объяснить наличие нейтрализующих антител в ответ на вакцину.
Тест на антитела, способные к нейтрализации вируса
Проблемы и нестыковки в представлении результатов
Отсутствуют положительные контроли
Рисунок 7. Вирус-нейтрализующие антитела (обратные титры) в сыворотках добровольцев-испытуемых на 35 и 42 дни после первой иммунизации
В эксперименте с вирус-нейтрализующими антителами (рис. 7) этот контроль также отсутствует. Показаны результаты анализа обратных титров вирус-нейтрализующих антител в сыворотке испытуемых на 35 и 42 дни после вакцинации.
Обнаружены антитела к антигенам вакцины в контрольной группе испытуемых
Вызывает сомнения статистическая достоверность полученных результатов
На рисунке 6 ошибки титров антител в группе вакцинированных и в группе плацебо перекрываются. В таблице 3 представлены очень большие стандартные отклонения титров антител на 35 и 42 сутки.
Вакцина продемонстрировала слабую иммуногенность
В эксперименте с титрами антител к антигенам SARS-CoV-2 (рис. 8) средние геометрические титры после вакцины на последней временной отметке более чем в 10 раз ниже титров антител переболевших. На панели а показаны титры антител к антигенам вируса в сыворотках испытуемых, которые определялись в разные сроки после вакцинации. Определение производилось для сывороток, полученных на 14, 21, 35 и 42 дни после вакцинации. На панели б показан титр антител у переболевших COVID-19. Значения титров показано в логарифмической шкале.
Рисунок 8. Специфические антитела к антигенам вируса SARS-CoV-2: а — в сыворотках испытуемых на 14, 21, 35 и 42 дни после иммунизации (логарифмическая шкала); б — в сыворотках реконвалесцентов (переболевших COVID-19) (логарифмическая шкала).
Проблема использования вакцины для пожилых
Тут еще стоит немного отвлечься от анализа статьи и рассказать, на основании каких испытаний вакцина была-таки рекомендована пожилым. Специалисты в разработке вакцин выделяют четыре фазы клинических испытаний вакцин, как и других лекарственных препаратов [19]. Первые две фазы нужны для получения первичных данных о побочных эффектах вакцины и ее иммунологических характеристиках. Кроме того, они помогают подобрать дозировки иммуногенного вакцинного материала при введении в организм, а также режим введения вакцины. В качестве иммунологических характеристик чаще всего оценивают выработку антител, хотя есть и другие параметры, такие как клеточный иммунитет. В первых двух фазах, как правило, участвует от нескольких десятков до нескольких сотен человек.
Исследования фазы III делаются уже на большой группе людей — как правило, много тысяч. Эти исследования обычно спланированы таким образом, чтобы получить надежные статистические результаты о способности вакцины предотвращать инфекцию. То есть сравнивают заболеваемость в группе вакцинированных с группой плацебо. На маленькой выборке людей такие исследования проводить невозможно. Ведь только небольшая часть из них заболеет, а надо получить надежную разницу в числе заболевших в группе вакцинированных и плацебо. При этом разница должна быть статистически значимой. Испытания третьей фазы изучают эпидемиологическую эффективность вакцины.
Испытания четвертой фазы проводятся для изучения того, как долго длится иммунитет и нет ли у вакцины долгосрочных побочных эффектов. В принципе, в России действуют примерно такие же правила изучения новых вакцин. Однако в связи с пандемией Минздрав РФ счел возможным регистрировать и даже разрешать выпускать в гражданский оборот вакцины после первых двух фаз, что, по сути, проблематично. В большинстве других стран вакцину выпускают в оборот и дают временное право использования на основании результатов третьей фазы, а именно клинических испытаний, показавших, что в группе вакцинированных заболеваний статистически значимо меньше, чем в контрольной группе. В пандемию эти общие правила не изменились, хотя процедура получения временного разрешения после третьей фазы клинических испытаний упростилась и ускорилась.
Случаи заражения COVID-19 во время клинических испытаний
Вывод в отношении опубликованной работы
Обсуждаемую работу [1] вряд ли можно назвать научной статьей, выполненной на хороших научном и методическом уровнях. С учетом перечисленных замечаний, касающихся контролей, расхождения данных, доверительных интервалов и статистической значимости, статья представляется сырой. Поэтому ее выводы пока не могут быть приняты в качестве подтверждения заявлений разработчиков.
Читайте также: