Сыворотки для диагностики вирусных инфекций
Обновлено: 24.04.2024
Источник антигенов респираторно-синцитиального вируса - лизат BSC-клеток инфицированных линией респираторно-синцитиального вируса "Long".
Показатель текущей или имевшей место в прошлом инфекции респираторным синцитиальным вирусом.
Респираторный синцитиальный вирус (RSV) принадлежит к семейству парамиксовирусов. Вирусная частица содержит одноцепочечную РНК, окруженную спиральным капсидом и внешней оболочкой с шипами. Шипы образованы двумя поверхностными функционально важными гликопротеидами: белком слияния F и белком прикрепления G. Белок F обеспечивает проникновение вируса в клетку и слияние инфицированной клетки с соседними клетками, что приводит к образованию синцития. Белок G обеспечивает прикрепление вируса к клетке-мишени.
Респираторный синцитиальный вирус распространён повсеместно, вспышки инфекции наблюдаются в холодное время года. Инфекция передаётся воздушно-капельным путем.
Инкубационный период заболевания составляет 2 - 4 суток. Вирус больным человеком выделяется в течение 5 - 7 дней от начала болезни. RSV - наиболее частый возбудитель вирусных инфекций нижних дыхательных путей у детей первых двух лет жизни (характерное и клинически наиболее важное проявление инфекции RSV – бронхиолит). У более старших детей и взрослых RSV может вызывать гриппоподобный синдром, бронхопневмонию или обострение хронического бронхита. Характерно возникновение гипоксемии. Обычно инфекция RSV у взрослых людей носит лёгкий характер, хотя на фоне иммунодефицита и у пожилых людей она может приводить к тяжёлой пневмонии. Иммунитет после перенесённой инфекции слабый и нестойкий, часты повторные инфекции, но эти инфекции редко бывают тяжёлыми.
Вирусологические методы (выделение вируса из отделяемого носоглотки возможно на некоторых культурах клеток) требуют длительного времени выполнения (от 3 до 14 суток). К более оперативным методам диагностики данной инфекции относится выявление антигенов вируса в пробах, взятых из дыхательных путей, методами иммунофлюоресценции или ИФА. Определение вирусной РНК ПЦР-методом, в связи с присущей данному вирусу нестабильностью генома, не имеют широкого применения.
При использовании серологических тестов (исследовании крови для выявления антител к RSV) следует учитывать особенности иммунного ответа на RSV. При данной инфекции IgM-ответ иногда не регистрируется или является слишком слабым для клинической интерпретации результатов. Присутствие в однократно взятой пробе IgG антител не является свидетельством острой инфекции, поэтому для серологической диагностики острой инфекции респираторным синцитиальным вирусом рекомендуют исследование парных сывороток для оценки роста титров IgG .
Антитела класса IgG к респираторному синцитиальному вирусу появляются через 1 - 2 недели заболевания и сохраняются в течение длительного времени. Стойкого иммунитета к этой инфекции не обеспечивают, часто наблюдается повторное инфицирование. При реинфицировании наблюдается значительный прирост концентрации IgG. В отличие от IgM антител, IgG антитела способны проникать через плаценту из крови матери в кровь ребёнка. Такие пассивно переданные антитела могут выявляться в течение нескольких месяцев после рождения в крови ребёнка, обеспечивая некоторую защиту от вируса, не свидетельствуя о перенесённой инфекции. Поскольку респираторный синцитиальный вирус распространён повсеместно, и часто наблюдаются случаи первичного и повторного инфицирования этим возбудителем, большинство людей уже в раннем детском возрасте имеют в крови приобретённые в результате активного иммунного ответа организма на возбудитель IgG антитела. Поэтому выявление в однократно взятой пробе крови антител класса IgG к вирусу не является признаком острой инфекции. Подтвердить то, что RSV является возбудителем острого заболевания, позволяет рост титров IgG в 3 - 4 раза в парных сыворотках, взятых с интервалом в 10 - 14 дней.
Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи. С общими рекомендациями для подготовки к исследованиям можно ознакомиться здесь >>.
Иммуноглобулины D, Е, M при вирусной инфекции. Система комплемента во время вирусной инфекции.
Иммуноглобулины D и Е являются минорными иммуноглобулинами, составляющими менее 1 % от общего количества иммуноглобулинов. Их роль в иммунитете не выяснена или незначительна.
IgD, вероятно, служит рецептором В-клеток, а антитела класса IgE принимают участие в связывании антигена на слизистой оболочке. При внутривенном введении антиген задерживается в печени и селезенке, при подкожном — в регионарных лимфоузлах. В лимфоидных органах антиген реагирует с иммунокомпетентными клетками (макрофагами, лимфоцитами). При подкожном или внутрикожном введении антигена с адъювантом на месте инъекции развивается гранулема, в которой образуются сначала IgM-антитела, затем IgG. Попадание антигена на слизистые оболочки ведет к преимущественному образованию IgA.
Инфицирование или иммунизация через слизистые оболочки могут приводить и к местной выработке антител, которые способны эффективно предотвращать локальную колонизацию, например, кишечника полио- или ротавирусом, а дыхательного тракта — вирусами парагриппа. Местная выработка антител классов IgG и IgA при гриппе лучше всего стимулируется аэрозольной иммунизацией. У детей с тяжелой инфекцией, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом, обнаружена местная выработка вирусспецифических IgE-антител. При инфекциях, вызванных вирусами паротита и японского энцефалита, соотношение титра IgG и IgM в спинномозговой жидкости часто выше, чем в сыворотке, что, вероятно, свидетельствует о синтезе во время болезни антител в центральной нервной системе.
Многочисленные серологические маркеры одного и того же вируса дают возможность следить за состоянием хронической вирусной инфекции. При гепатите-В определение циркулирующих антигенов, таких как HBsAg и HBeAg, а также антител к различным компонентам вируса, например, анти-НВс, анти-НВе и анти-HBs, дает возможность различать острый гепатит, состояние персистирующего носительства, период выздоровления и полное излечивание.
Система комплемента представлена белками сыворотки (около 30), которые могут служить активаторами иммунного ответа. Классический путь активации проявляется при наличии комплексов антиген-антитело, а также может проявляться независимо от антител. Например, может усиливать разрушение вирио-нов, инфицированных вирусом клеток, а также воспаление. Вирионы разрушаются в результате опсонизации, усиления нейтрализации или лизисе вирионной оболочки. Активация комплемента ведет к взаимодействию с вирусным антигеном в тканях вскоре после начала инфекции, тогда как антитела проявляют активность в основном через 2—3 недели.
NK-клетки максимально активируются через 2 дня, а активность интерферона совпадает с пиком концентрации вируса.
Антитела в основном синтезируются в селезенке, в лимфоузлах, в лимфоидной ткани GALT и BALT систем. Лимфоидная ткань подслизистой пищеварительного и респираторного трактов, так же как миндалин и пейеровых бляшек, получающих антиген прямо от сверхлежащих эпителиальных клеток, производит антитела главным образом класса IgA.
Защитную функцию специфических антител связывают в первую очередь с вируснейтрализующими антителами и их концентрацией. Однако вакцинированные с неопределяемыми или низкими титрами нейтрализующих антител не обязательно восприимчивы к симптоматической инфекции.
В обеспечении устойчивости к вирусной инфекции могут участвовать не нейтрализующие антитела, хотя менее эффективно, чем нейтрализующие антитела.
Антитела, не обладающие нейтрализующей активностью, проявляют антивирусную активность непосредственно против вирусных антигенов на поверхности вирусных частиц или против вирионов или неструктурных белков, экспонированных на поверхности инфицированных клеток. In vivo не нейтрализующие антитела проявляют антивирусную активность с помощью разных механизмов. Во-первых, вирионы, покрытые такими антителами, могут легко уноситься кровотоком. Во-вторых, они, влияя на нейраминидазу вирусов гриппа или на гемагглютинирующий Е-белок коронавирусов могут снижать их репликацию в органах-мишенях, подавляя выделение вируса из клеток. В третьих, они могут лизировать клетки с помощью IgG Fc-зависимого механизма.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Сыворотки иммунные (син. антисыворотки) — препараты крови животных или человека, содержащие антитела; используются для диагностики, лечения и профилактики различных заболеваний.
Изучение иммунных сывороток тесно связано с развитием гуморального направления в иммунологии, разрабатываемого с середины 80-х гг. 19 в. В 1890 г. Э. Беринг и С. Китасато обнаружили в сыворотке крови кроликов, иммунизированных столбнячным токсином, антитоксины, нейтрализующие этот яд. В 1891 г. П. Эрлих открыл антитела (см.) к токсинам растительного происхождения. Благодаря работам Э. Ру и Г. Н. Габричевского противодифтерийная сыворотка получила широкое применение при лечении дифтерии (см.). В 1894 г. Р. Пфейффер и В. И. Исаев описали лизис холерных вибрионов в организме животного под действием специфической иммунной сыворотки (см. Исаева — Пфейффера феномен).
Ж. Борде, изучая в лаборатории И. И. Мечникова действие противохолерной сыворотки, установил, что холерный вибрион под ее влиянием теряет свою подвижность. В 189(5 г. Грубер и Дархем (M. Gruber, H. E. Durham) показали, что в результате иммунизации животных сыворотки их крови приобретали свойства агглютинировать соответствующие микробы. Так были открыты антитела — агглютинины. В 1897 г. Краус (R. Kraus) установил, что сыворотки крови иммунизированных животных действуют на фильтраты соответствующих бульонных культур: в прозрачном фильтрате выпадает осадок (преципитат). В 1899 г. Ф. Я. Чистович первым получил преципитины к белкам животного происхождения.
В 1898 г. Ж. Борде открыл у морских свинок, иммунизированных кроличьими эритроцитами, антитела — гемолизины и гемагглютинины. В 1900 г. И. И. Мечников, впрыскивая морским свинкам эмульсию селезенки или брыжеечных лимфатических узлов кролика, получил специфические сыворотки — антилейкоцитарные сыворотки. Вскоре были выделены сыворотки против других клеток организма. Т. о., получение иммунных сывороток основано на свойстве антигенов (см.) вызывать в организме образование антител (см.).
Иммунные сыворотки получают от иммунизированных животных или человека, а также от реконвалесцентов, в крови к-рых содержатся антитела после перенесенной инфекционной болезни (сыворотки реконвалесцентов). Сыворотки могут содержать так наз. нормальные антитела, напр. аллоантитела, или изоантитела, образующиеся у человека или животного в течение жизни и не зависящие от искусственной иммунизации (см.). В результате многократной иммунизации получают С., содержащие антитела в высоких титрах — гипериммунные сыворотки. Различают диагностические и лечебно-профилактические сыворотки.
Содержание
Диагностические сыворотки
Диагностические сыворотки, как правило, содержат антитела в более высоком титре, чем лечебно-профилактические. Их получают как от мелких лаб. животных (кроликов, морских свинок), иммунизированных убитыми микроорганизмами, антигенами, анатоксинами, так и от крупных (коз, лошадей, баранов), если необходимо большое количество сыворотки. Диагностические С. применяют в различных иммунологических реакциях для установления вида, подвида или серотипа (серовара) возбудителя инфекционной болезни, определения различных антигенов в биол. жидкостях. При этом используют Сыворотки, содержащие антитела, называемые в зависимости от характера иммунол. реакции. Так, в реакции агглютинации — агглютинины, в реакции преципитации — преципитины, в реакции связывания комплемента — комплементе вязывающпе антитела, в иммунофлюоресценции — флюоресцирующие антитела, в иммунорадиомет-рическом методе (см. Радиоиммунологический метод) — антитела, меченные радиоактивным изотопом, в иммуноферментном методе (см. Энзим-иммунологический метод) — антитела, меченные ферментом, в электронно-микроскопической иммуногистохимии — антитела, меченные ферментом или ферритином, и т. д. Поэтому в зависимости от характера иммунол. реакции различают агглютинирующие, преципитирующие, флюоресцирующие, гемолитические, меченные изотопами, ферментами, и другие диагностические сыворотки.
Среди диагностических С. различают антимикробные, к к-рым относятся антибактериальные и антивирусные, а также антитоксические С.
Антибактериальные сыворотки обычно используют как агглютинирующие. По степени специфичности их разделяют на неадсорбированные (нативные) и адсорбированные (поливалентные, содержащие антитела к нескольким антигенам или нескольким детерминантным группам антигена, и монорецепторные). Неадсорбированные сыворотки содержат перекрестно реагирующие антитела, т. к. различные микробы могут иметь сходные антигены. К ним относятся сыворотки, предназначенные для обнаружения нек-рых сальмонелл (напр., S. typhi, S. paratyphi, S. typhimurium, S. enteritidis, S. anatum, S. newport, S. choleraesuis), шигелл и эшерихий. Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки используют для постановки развернутой реакции агглютинации с целью идентификации микробов (см.). При этом для точной серологической идентификации возбудителя (см. Серологические исследования) важно учитывать, чтобы реакция шла до титра или половины титра сыворотки. Неадсорбированные сыворотки из-за своей относительно невысокой специфичности находят меньшее применение, чем адсорбированные.
Адсорбированные поливалентные сыворотки способны агглютинировать несколько родственных бактерий, имеющих общий антиген. Адсорбированные монорецепторные сыворотки содержат антитела только против определенного антигена, т. е. они обладают высокой специфичностью (диагностические типоспецифические сыворотки). Их получают избирательной адсорбцией антител (см. Кастеллани метод). Адсорбированные сыворотки используют в реакции агглютинации (см.) на предметном стекле, чаще для идентификации возбудителей, относящихся к сем. Enterobacteriaceae, напр, для идентификации энтеропатоген-ных эшерихий применяют поливалентные и типовые ОК-сыворотки, для определения принадлежности возбудителя к роду сальмонелл — агглютинирующую адсорбированную поливалентную сальмонеллезную О-сыворотку (групп А, В, С, Д, Е), для определения серол. группы и серотипа возбудителя — отдельные адсорбированные О-, а затем Н-сыворотки. Для определения в исследуемом материале антигенов, напр. ботулинических токсинов или
О-брюшнотифозного антигена, используют соответствующие антитела сыворотки, сорбированные на эритроцитах,— так наз. антительные эритроцитарные диагностикумы (см. О-агглютинация).
Антивирусные диагностические Сыворотки используют в различных реакциях иммунитета, напр, реакции торможения гемагглютинации (см. Гемагглютинация), реакции связывания комплемента (см.), реакции иммунофлюоресценции (см.) и др. К антивирусным сывороткам в зависимости от вида вируса предъявляются особые требования. Разнообразие источников антивирусных сывороток связано с наличием в них неспецифических ингибиторов, к-рые могут подавлять и маскировать рецепторы вирусов. Антивирусные сыворотки очищают от термолабильных ингибиторов прогреванием при t° 56° в течение 30 мин., а от термостабильных ингибиторов ферментированием, воздействием углекислотой и др. в зависимости от природы вируса. Кроме этого, определяют наличие неспецифических агглютининов. С целью подавления бактериофагов применяют антифаговые С. В лаб. практике их добавляют к питательным средам для освобождения бактерий от их бактериофагов.
Из антитоксических диагностических сывороток наиболее часто используют сыворотки для обнаружения ботулинических токсинов в реакции нейтрализации in vivo (см. Ботулизм, лабораторная диагностика) и идентификации токсина возбудителя дифтерии в реакции преципитации (см. Дифтерия).
Преципитирующие сыворотки используют в реакциях преципитации (см.) для определения растворимых антигенов микробного, растительного или животного происхождения, определения аутоантител, С-реактивного белка, для диагностики инф. болезней, выявления видовой принадлежности белка крови, обнаружения определенных веществ в продуктах при подозрении на фальсификацию.
Флюоресцирующие (люминесцирующие) сыворотки представляют собой глобулиновую фракцию иммунной сыворотки крови животных, меченную флюоресцирующими красителями — флюорохромами (см.). Их применяют для обнаружения микробов методом прямой иммунофлюоресценции (см.) в патологическом материале и при экспериментальных исследованиях. С аналогичной целью используют также меченные флюорохромами антиглобулиновые и антикомплементарные сыворотки при непрямой иммунофлюоресценции.
В клин, иммунологии широко применяют диагностические сыворотки для определения группы крови (см.), проведения тканевого типирования, для характеристики иммунол. статуса организма. Группы крови по системе AB0 определяют с помощью стандартных гемагглютинирующих сывороток, приготовленных из крови человека. Они специфичны, т. к. содержат определенные аллоантитела — альфа-, бета- или альфа + бета-антитела. Сыворотка крови группы АВ (IV) этих антител не содержит.
Для определения резус-принадлежности крови нек-рых больных, беременных и первично обследуемых доноров используют стандартную сыворотку анти- Bh0(D), а также сыворотку для пробы Кумбса (см. Кумбса реакция) ,приготовленную из крови животных (кроликов, коз, баранов), иммунизированных белком сыворотки крови человека. Для дополнительного исследования крови донора применяют сыворотки анти- rh'(C) и анти-гЬ"(Е), сыворотки, содержащие два антитела — анти-ВЬ0 (С -f- D) или анти-Rho (D -f- Е) или три антитела — анти-Rh^ (С + D + Е).
Для тканевого типирования при аллогенных трансплантациях и гемотрансфузиях (см. Иммунитет трансплантационный, антигены гистосовместимости) используют так наз. тестовые HLA- и NA-, NB-реактивы. HLA-реактив получают от лиц, сенсибилизированных соответствующим антигеном (напр., сыворотка крови женщин, сенсибилизированных в период беременности, или сыворотки крови иммунизированных доноров). Антитела определяют с помощью лимфоцитотоксической пробы (см. Лейкоцитарные тесты) или реакции лейкоагглютинации (см. Агглютинация).
В таблице 1 дан перечень основных диагностических иммунных сывороток, их получение, применение в клинической иммунологии, форма выпуска.
Лечебно-профилактические сыворотки
К ним относятся антитоксические, антибактериальные, антивирусные сыворотки, а также иммуноглобулины. Антитоксические сыворотки получают методом гипериммунизации крупных животных (обычно лошадей) путем парентерального введения нарастающих доз анатоксинов, затем соответствующих экзотоксинов (см. Антитоксины). Антитоксические сыворотки применяют для пассивной иммунизации (см.).
Антитоксические сыворотки используют для лечения и профилактики токсинемических инфекций, в основе к-рых лежит действие на организм экзотоксинов бактерий — возбудителей столбняка, ботулизма, дифтерии, газовой гангрены, стафилококковых инфекций. Антитоксическими сыворотками являются и сыворотки, содержащие антитела против ядов змей, пауков, ядов растительного происхождения. Антитела антитоксических сывороток нейтрализуют действие соответствующих токсинов, обеспечивая тем самым леч.-проф. эффект.
Антитоксические сыворотки, полученные от гипериммунизированных животных, очищают и концентрируют (с целью удаления неактивных балластных белков); контролируют их физические свойства, стерильность, апирогенность, безвредность, специфическую активность, количество белка, значение pH и наличие остаточного сульфата аммония. Специфическая активность антитоксических сывороток выражается в международных единицах (ME). За единицу принимают минимальное количество сыворотки, к-рое нейтрализует стандартную единицу токсина. Для сывороток, еще не имеющих международных стандартов, утверждены национальные стандарты — антитоксические единицы (АЕ).
Определение специфической активности антитоксических сывороток производят двухэтапным титрованием. На первом этапе устанавливают опытную дозу токсина с помощью стандартной антитоксической сыворотки. На втором этапе определяют активность испытуемой антитоксической сыворотки посредством опытной дозы токсина (см. Антитоксины).
Стандартные образцы антитоксических сывороток проходят контроль в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича и рассылаются производственным предприятиям, выпускающим сыворотки. Стандартные сыворотки соответствуют принятым международным стандартам, что облегчает возможность сопоставления свойств сывороток, изготовленных в разных странах.
Антибактериальные сыворотки получают из крови лошадей или волов, гипериммунизированных соответствующими убитыми бактериями или их антигенами. Они не нашли широкого применения с лечебными или профилактическими целями из-за наличия более эффективных антимикробных средств. Из антибактериальных сывороток иногда применяют гетерогенные иммуноглобулины (противосибиреязвенный гамма-глобулин и противолептоспирозный гамма-глобулин).
Антивирусные сыворотки (гетерогенные иммуноглобулины) получают из крови животных, иммунизированных вакцинными штаммами вирусов или соответствующими вирусами. Их очищают методом спиртового осаждения при низкой температуре. Наиболее широкое применение получил гамма-глобулин против клещевого энцефалита, антирабический гамма-глобулин и др. (см. Иммуноглобулины).
Иммуноглобулины, полученные из крови человека (гомологичные иммуноглобулины), являются, за исключением нормального иммуноглобулина, иммуноглобулинами направленного действия. Преимуществом гомологичных иммуноглобулинов перед гетерологичными является слабая реактогенность и более длительное циркулирование антител в организме (в течение 30— 40 дней). Получают гомологичные иммуноглобулины путем фракционирования этиловым спиртом при температуре ниже нуля (по методу Кона). Наибольшее значение в клин, практике имеют иммуноглобулины с максимально сниженной анти комплементарной активностью, к-рые используют для внутривенного введения. Таким препаратом является иммуноглобулин нормальный человеческий для внутривенного введения. В иммуноглобулиновых препаратах для внутривенного введения стремятся удалить способность Fc-области молекул иммуноглобулинов активировать систему комплемента, а также предотвратить агрегацию молекул иммуноглобулинов. Применяется при различных формах иммунологической недостаточности (см.).
Среди различных иммуноглобулинов направленного действия, или гамма-глобулинов направленного действия, выделяют антирезусный иммуноглобулин — aHTn-Rh0(D), к-рый используют для иммунопрофилактики гемолитической болезни новорожденных (см.). Его вводят первородящим резус-отрицательным женщинам в послеродовой период или после аборта; при повторных беременностях у таких женщин рождаются здоровые резус-положительные дети. Источником получения препарата может быть гипериммунная плазма доноров, а также плазма женщин, сенсибилизированных резус-антигеном естественным путем во время повторных беременностей.
Иммуноглобулином направленного действия является также анти-лимфоцитарный (гетерогенный) иммуноглобулин, входящий в состав антилимфоцитарной сыворотки (см.), содержащей различные антитела к лимфоидным клеткам, преимущественно к лимфоцитам. Наибольшей иммунодепрессивной активностью обладает антилимфоцитарная сыворотка, полученная путем иммунизации животных клетками тимуса и лимфоцитами грудного лимфатического протока. Она широко используется при трансплантации жизненно важных органов, в первую очередь почки.
Антиретикулярную цитотоксическую сыворотку (сыворотку Богомольца) получают из сыворотки крови лошади, иммунизированной тканью селезенки или костного мозга человека. Она содержит антитела-цитотоксины, активные по отношению к клеткам этих органов. Применение антиретикулярной цитотоксической сыворотки особенно целесообразно при длительно не заживающих язвах и ранах, а также при наличии медленно рассасывающихся воспалительных очагов.
В табл. 2 дан перечень основных препаратов иммуноглобулинов и антитоксических сывороток, источник их получения, применение и способ введения.
Получение иммунных сывороток включает: подготовку соответствующего иммуногена, т. е. вещества, стимулирующего продукцию антител; иммунизацию животных; контроль полученных сывороток. Для получения сывороток против таких гаптенов, как фармакол. препараты или низкомолекулярные гормоны, применяют в качестве иммуногена, или иммунизирующего препарата, конъюгат гаптен-носитель. Степень чистоты белковых иммуногенов проверяют с помощью иммунохимических и физико-химических исследований. Иммунизация является одним из наиболее вариабельных процессов при получении сывороток, т. к. доза иммуногена может влиять на свойства (напр., специфичность) образующихся антител. Малые дозы вводимого антигена позволяют экономить расход иммуногенных препаратов, индуцируют появление авидных антител в высоком титре. При небольших дозах антигена в организм вводятся и небольшие количества посторонних примесей, в результате чего не образуются побочные антитела. Для стимуляции антителообразования иммуногены смешивают с адъювантами (см.), напр. адъювантом Фрейнда. Помимо стимулирующей функции, адъюванты выполняют и депонирующую функцию в отношении иммуногена. Кроме дозы антигена, важно также учитывать степень его чистоты, способ, сроки и последовательность введения. Выбор животного зависит от предполагаемого количества сыворотки. Получение сыворотки от кроликов, являющихся хорошими продуцентами антител, требует содержания большого количества таких животных. В большом количестве сыворотку можно получить от лошадей или других крупных животных.
Для определения в сыворотках количества антител и для характеристики активности диагностических сывороток, напр, агглютинирующих иммунных сывороток, производят их титрование. Титр агглютинирующих иммунных сывороток определяют как предельное разведение сыворотки крови, при к-ром обнаруживается реакция агглютинации. Обычно готовят разведения сыворотки, возрастающие в геометрической прогрессии (двукратные). Для характеристики активности сыворотки крови, как правило, учитывают результат реакции в каждом разведении или суммарно во всех разведениях по количеству условных положительных единиц.
Таблица 1. Перечень основных диагностических иммунных сывороток, их получение, применений в клинической иммунологии и форма выпуска
Получение сыворотки и иммунологическая реакция, в которой она используется
Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.
Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.
- бактериологические;
- серологические;
- метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.
У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.
Бактериологические методы исследования
Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.
Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.
Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.
Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.
- микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
- выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
- идентификацию бактерий;
- определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.
Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.
Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, а также дают предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.
Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.
Микроскопия мазков, окрашенных по Граму
1 - стрептококки; 2 - стафилококки; 3 - диплобактерии Фридленда; 4 - пневмококки
Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.
Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.
Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов, имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.
Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 10 5 , свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.
Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.
Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.
Серологические методы исследования
В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.
2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.
Серологические исследования не обладают 100%-й чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.
В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.
Авидность - характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген.
Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях.
Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.
Метод полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.
Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы.
Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.
В ПЦР может быть использован различный биологический материал - сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.
Читайте также: