Тест-систем для диагностики вирусных инфекций

Обновлено: 24.04.2024

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.

Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

бактериологические;
серологические;
метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.

Бактериологические методы исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
идентификацию бактерий;
определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, а также дают предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

1 - стрептококки; 2 - стафилококки; 3 - диплобактерии Фридленда; 4 - пневмококки

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов, имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 10 5 , свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.

Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.

2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100%-й чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.

Авидность - характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген.

Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях.

Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.

Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы.

Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал - сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Для цитирования: Окнин В. НЕВРОЛОГИЯ. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ. РМЖ. 1998;13:14.

Диагностика вирусных инфекций центральной нервной системы (ЦНС) часто затруднительна, так как рутинные лабораторные методы (культивирование вирусов и серологические реакции) не дают удовлетворительных результатов. Данные методы являются ретроспективными и не влияют на лечение конкретного больного. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с ее скоростью и высокой чувствительностью обладает большим потенциалом для диагностики инфекций ЦНС. Однако клиническая оценка с помощью ПЦР затруднительна из-за отсутствия удовлетворительного теста сравнения – “золотого стандарта”.

Цель работы – определить точность ПЦР цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) при диагностике вирусных инфекций ЦНС.
Авторы исследовали с помощью ПЦР образцы ЦСЖ на наличие вирусов, связанных с инфекциями ЦНС в Великобритании: энтеровируса, вируса простого герпеса, ветряной оспы – опоясывающего лишая, цитомегаловируса, вируса Эпштейна – Барр, герпеса типа 6, эпидемического паротита, кори и аденовирусов. Наиболее часто выявлялись энтеровирус, вирус простого герпеса, вирус Эпштейна – Барр и ветряной оспы – опоясывающего лишая, поэтому после изучения первых 200 образцов ЦСЖ все последующие анализировали только на данные четыре вируса. Собраны клинические и лабораторные данные о 410 пациентах больниц Оксфорда, разделенных на четыре группы по степени вероятности наличия вирусной инфекции ЦНС: определенное (n = 12); вероятное (n = 51); возможное (n = 7); отсутствие вирусной инфекции ЦНС (n = 340). В оксфордской когорте вирусная ДНК или РНК выявлена методом ПЦР у 22 (5,4%) больных: у 8 – энтеровирус, у 3 – вирус простого герпеса типа 2, у 3 – вирус ветряной оспы – опоясывающего лишая, у 3 – вирус Эпштейна - Барр, у 2 – вирус простого герпеса типа 1, у 1 – цитомегаловирус, у 1 – JC-вирус. В подгруппе определенной вирусной инфекции ЦНС положительный результат ПЦР получен у 10 (83%) из 12 больных, во второй подгруппе – у 10 (20%) из 51, в третьей – ни у кого и в четвертой – у 2 из 340. Для идентификации клинических факторов, независимо связанных с положительным результатом ПЦР, применен регрессионный анализ, показавший, что лихорадка, вирусспецифическая сыпь и содержание лейкоцитов в ЦСЖ от 5 в 1 мкл независимо указывают на положительный результат ПЦР. С менингизмом, головной болью, спутанностью сознания, приступами эпилепсии, очаговой неврологической симптоматикой достоверной связи не выявлено.
Всего было исследовано 2233 образца ЦСЖ 2162 больных. Положительный результат ПЦР получен у 143 (6,6%) больных. У 77 больных выявлены энтеровирусы, у 20 – вирус простого герпеса типа 1, у 16 – вирус ветряной оспы – опоясывающего лишая, у 11 – вирус Эпштейна – Барр, у 7 – нетипичный вирус простого герпеса, у 6 – вирус простого герпеса типа 2, у 3 – цитомегаловирус.
Авторы делают вывод, что вероятность определенного диагноза вирусной инфекции ЦНС у больного с положительным результатом ПЦР в 88 раз выше, чем у больного с отрицательным результатом. Отрицательный результат ПЦР может быть использован с умеренной степенью доверия для исключения диагноза вирусной инфекции ЦНС. Авторы полагают, что ПЦР станет первичным тестом диагностики менингита и энцефалита вирусной этиологии.

Jeffery KJM, Read SJ, Peto TEA, Mayon-White RT, Bangham CRM. Diagnosis of viral infections of the central nervous system: clinical interpretation of PCR results. Lancet 1997; 349: 313–7

Цель исследования: изучение взаимосвязи иммунологических показателей с маркерами вируса герпеса человека 8 типа (ВГ-8) для выявления лабораторных вариантов состояния вирусной репродукции и иммунитета человека у пациентов с саркомой Капоши (СК) и выделения прогностических маркеров обострения заболевания.
Материал и методы: проведено комплексное обследование 22 пациентов с СК. Применялся метод иммуноферментного анализа для определения иммуноглобулинов класса G (IgG) к малому капсидному протеину (МКП) ВГ-8, метод полимеразной цепной реакции для определения ДНК ВГ-8 в мононуклеарах периферической крови человека (МПК) и в биоптате из очага СК. Оценивалась продукция интерферона α (ИФН-α), интерлейкинов: ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, рецепторного антагониста к ИЛ-1 (РА-ИЛ-1).
Результаты исследования: обнаружена корреляция между IgG к МКП ВГ-8 и пониженными значениями ИФН-α, а также между выявлением ДНК ВГ-8 и повышенным количеством РА-ИЛ-1. Самое высокое содержание ИФН-α у пациентов с СК отмечается при отсутствии антител к ВГ-8. Медиана количества РА-ИЛ-1 у пациентов с выявленной ДНК ВГ-8 составила 838 пг/мл, а у пациентов с невыявленной ДНК — 187,5 пг/мл (р=0,0015). Показано повышение уровня провоспалительного ИЛ-1β в сыворотке крови пациентов с наличием IgG к ВГ-8 (р=0,0016). Показано, что при обнаружении ДНК ВГ-8 в МПК выявляются более высокие значения ИЛ-6 и наименьшие значения ИЛ-8 в сыворотке крови пациентов с СК.
Заключение: выявлены прогностические маркеры обострения герпес-вирусной инфекции 8 типа и выделены 4 лабораторных варианта СК, что позволит повысить эффективность диагностики и проводить комплекс профилактических мер по предотвращению прогрессирования СК.

Ключевые слова: вирус герпеса человека 8 типа, саркома Капоши, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция, иммуноглобулины класса G, интерферон α, интерлейкин, рецепторный антагонист к ИЛ-1.

Для цитирования: Львов Н.Д., Панюкова Е.М., Мезенцева М.В. Оптимизация диагностики герпес-вирусной инфекции 8 типа. РМЖ. 2019;1(II):62-65.

Diagnosis optimization for the human herpesvirus type 8

N.D. Lvov, E.M. Panyukova, M.V. Mezentseva

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after N.F. Gamaleya, Moscow

Aim: to study an association of immunological parameters with human herpesvirus type 8 (HHV-8) markers for the laboratory variants determination of viral reproduction and human immunity condition in patients with Kaposi’s sarcoma (KS) and prognostic markers selection of the disease exacerbation.
Patients and Methods: 22 patients with KS underwent a comprehensive study. The following methods were applied in this study: ELISA for the HHV-8 small capsid protein (SCP) IgG determination in human serum and polymerase chain reaction for the HHV-8 DNA determination in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and in a biopsy sample from the KS focus. The production of interferon α (IFN-α), interleukins IL-1β, IL-6, IL-8, IL-1 receptor antagonist (IL-1 RA).
Results: a correlation between the HHV-8 SCP IgG detection and reduced IFN-α values, as well as between the HHV-8 DNA detection and increased IL-1 RA values, were found. The highest IFN-α levels in patients with KS were observed in the absence of HHV-8 antibodies. The IL-1 RA median value in patients with detected HHV-8 DNA was 838 pg/ml, and in patients without detected DNA — 187.5 pg/ml (p=0.0015). The proinflammatory IL-1β level increase in the patients’ serum with the HHV-8 IgG presence (p=0.0016) was shown. It was also shown that the HHV-8 DNA detection in the PBMC revealed higher IL-6 values and lower IL-8 values in patients’ serum with KS.
Conclusion: prognostic markers determination of the HHV-8 exacerbation and 4 KS laboratory variants selection were conducted, which can improve the HHV-8 diagnosis effectiveness to carry out a set of prophylactic measures for KS progression prevention.

Keywords: human herpesvirus type 8, Kaposi’s sarcoma, enzyme immunoassay, polymerase chain reaction, immunoglobulin G, interferon α, interleukin, IL-1 receptor antagonist.
For citation: Lvov N.D., Panyukova E.M., Mezentseva M.V. Diagnosis optimization for the human herpesvirus type 8. RMJ. 2019;1(II):62–65.

В статье представлены результаты оригинального исследования, посвященного изучению взаимосвязи иммунологических показателей с маркерами вируса герпеса человека 8 типа для выявления лабораторных вариантов состояния вирусной репродукции и иммунитета человека у пациентов с саркомой Капоши и выделения прогностических маркеров обострения заболевания.

Введение

Вирус герпеса 8 типа (ВГ-8) — этиологический агент ряда заболеваний, в число которых входит саркома Капоши
(СК) [1–4]. Наиболее часто СК встречается в странах Африки, южнее Сахары, где герпес-вирусная инфекция 8 типа (ГВИ-8) является эндемичной и распространена более чем у 90% населения. У детей восточной и центральной Африки частота встречаемости ГВИ-8 — 25–60% [5].
Геном ВГ-8 обнаруживается во всех элементах СК при всех стадиях заболевания независимо от клинического варианта [4]. Чаще всего постановка диагноза СК, подтвержденного гистологическими исследованиями биоптата, не вызывает затруднений. Однако в ряде случаев, например на ранних этапах формирования СК, когда гистологическая картина нечеткая, и при иных сосудистых опухолях, этиологически не связанных с ВГ-8, но симулирующих очаги СК, бывает необходимо применение дополнительных диагностических процедур, позволяющих провести дифференциальный диагноз.
С этой целью зарубежные исследователи проводят диагностику маркеров ВГ-8 в крови пациента и в очаге СК. Применяются различные методы диагностики: иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР), гнездовая ПЦР (Нестед-ПЦР), гибридизация in situ, иммуногистохимический анализ [1, 6, 7].
Применение только ИФА недостаточно для высокоэффективной диагностики маркеров ВГ-8, поэтому часто сочетают применение разных тест-систем к различным вирусным белкам, а также применяют дополнительно другие методы. Неудовлетворительная чувствительность ИФА может объясняться, например, недостаточной иммуногенностью различных вирусных белков у части обследуемых или отсутствием литической активации, когда в тест-системе выявляются белки капсида или вирусной оболочки. При применении рекомбинантных белков в наборах ИФА необходимо помнить, что рекомбинантный белок не является точной копией нативного белка и часто представляет собой его усеченный вариант.
Применение ПЦР тоже не всегда эффективно. При латентной ГВИ-8 концентрация вирусной ДНК в крови пациента невелика и может не определяться из-за недостаточной чувствительности тест-системы. Следовательно, метод ПЦР также не является вполне надежным для диагностики инфекции, вызванной ВГ-8.
Мы предлагаем использовать комплексную диагоностику: ИФА для определения иммуноглобулинов класса G (IgG) к малому капсидному протеину ВГ-8 в сыворотке крови человека, ПЦР для определения ДНК ВГ-8 в мононуклеарах периферической крови человека (МПК) и в биоптате из очага СК, а также определение продукции интерферона α (ИФН-α), интерлейкина 1β (ИЛ-1β), рецепторного антагониста к ИЛ-1 (РА-ИЛ-1), ИЛ-6 и ИЛ-8 [1, 8]. Это позволяет повышать диагностическую эффективность исследования и выявлять активацию литического цикла вируса. Выявление прогностических факторов усиления вирусной инфекции позволит реагировать на возможные обострения комплексом профилактических мер, своевременно корректируя нарушения в иммунной системе.

Материал и методы

Результаты и обсуждение

Заключение

Таким образом, для комплексной диагностики ГВИ-8 и перспектив нейтрализации ее активности у пациентов с СК в период роста опухоли и отсева новых очагов, а также при ухудшении общего состояния пациента показано определять содержание в сыворотке крови ИФН-α, ИЛ-1, РА-ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-8. Совокупность этих параметров в комплексе с маркерами ВГ-8 позволит также оценить, на каком этапе находится активация инфекции, вызванной ВГ-8.
Сочетанное использование методов ИФА и ПЦР с определением ДНК в МПК позволяет повысить диагностическую чувствительность выявления ГВИ-8 у пациентов с СК. Исследование содержания ИФН-α у пациентов с СК позволяет оценивать риски возможной литической активации ВГ-8. Анализ содержания ИЛ-1 и РА-ИЛ-1 в сыворотке крови помогает осуществлять мониторинг активности воспалительного процесса с тем, чтобы корректировать терапию. Определение содержания ИЛ-6 показано у пациентов с СК для оценки активации вирусной инфекции, вызванной ВГ-8, т. к. усиление вирусной репликации до величин, доступных для детекции методом ПЦР, по времени совпадает с повышением уровня ИЛ-6. Мониторинг ИЛ-8 показано проводить для оценки потенциальной возможности и сроков достижения ремиссии при СК.
Таким образом, начало литической активации ВГ-8, сопровождаемой ростом титра антител к МКП ВГ-8, постепенным увеличением уровня ИФН-α, высоким содержанием ИЛ-1 и невысоким уровнем ИЛ-6, постепенно сменяется ситуацией, когда на фоне повышенной частоты обнаружения ДНК ВГ-8 отмечаются повышенные уровни ИЛ-6, рецепторного антагониста к ИЛ-1 и падение уровня самого ИЛ-1.
Комплексная диагностика дает возможность проводить своевременный профилактический курс лечения, предотвращать появление новых очагов СК, останавливать рост уже имеющихся очагов и улучшать общее состояние пациента.

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), включая грипп – это группа инфекционных заболеваний дыхательной системы, возбудителями которых являются вирусы. Преимущественный путь передачи – воздушно-капельный.

Наиболее распространенные возбудители ОРВИ: вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, риновирусы, рино-синцитиальный вирус, энтеровирусы, коронавирусы, пикорнавирусы и др. Несмотря на разнообразие вирусов, симптомы ОРВИ схожи. В результате внутриклеточного размножения вирусов, клетки погибают и отторгаются. Это приводит к развитию воспаления дыхательных путей. Затем вирус попадает в кровь, развивается интоксикация. Вирус гриппа, к тому же, оказывает токсическое действие на сердечно-сосудистую и нервную системы, угнетает иммунитет.

У каждого вируса есть особенности, они в большей или меньшей степени поражают разные отделы дыхательных путей, но клиническая картина в большинстве случаев схожа и даже врач не может сказать наверняка, какой из вирусов стал причиной заболевания. Поэтому однозначно утверждать природу вируса можно лишь после проведения лабораторного исследования.

Характерные черты некоторых ОРВИ

Грипп

Для гриппа характерно острое начало. Ведущий симптом – интоксикация: сильная головная боль, головокружение, боль в глазных яблоках, мышцах и суставах. Характерен озноб, быстрое повышение температуры до 39-40°С. Беспокоят заложенность носа, сухой кашель. Возможны проявления со стороны желудочно-кишечного тракта (тошнота, рвота, учащенный стул). Характерен также внешний вид болеющего – одутловатость (отёчность) и покраснение лица, покраснение конъюнктивы глаз.

Аденовирусная инфекция

При поражении аденовирусом возможны следующие формы заболевания: воспаление дыхательных путей (ринофарингит, ларингит, трахеит, бронхит), фарингоконъюнктивальная лихорадка, конъюнктивит, аденовирусная ангина, вирусная пневмония, вирусная диарея и гастроэнтерит. При поражении дыхательных путей чаще всего интоксикация выражена слабо, температура поднимается до 38°С, но при фарингоконъюнктивальной лихорадке возможно повышение до 40°С. Особенность аденовируса заключается в том, что он может поражать конъюнктиву глаз, в этом случае развивается конъюнктивит, на слизистой глаз появляется плёнка, вокруг глаз – отёк, покраснение и болезненность. Аденовирусы могут длительное время находиться в клетках миндалин, обуславливая хроническую форму тонзиллита.

Парагрипп

Интоксикация и повышение температуры при парагриппе также не выражены. На первое место выходят катаральные симптомы: затруднение носового дыхания, выделения из носа. Характерен ларингит, который сопровождается болями в горле, грубым сухим кашлем, охриплостью голоса.

Респираторно-синцитиальный вирус

При проникновении этого вируса в дыхательные пути возможно острое начало заболевания. Симптомы, похожи на симптомы парагрппа. В начале болезни часто мучает продолжительный приступообразный кашель. Респираторно-синцитиальные вирусы могут стать причинным фактором для развития в будущем бронхиальной астмы.

Риновирусная инфекция

Температура при риновирусной инфекции может не повышаться, а если повышается, то до невысоких цифр. Характерно покраснение яблок глаз, боль в горле. Для риновирусной инфекции типичны заложенность носа, нарушение вкуса и обоняния, обильные выделения из носа, чихание. Может незначительно снижаться слух.

Коронавирусы

Для коронавирусов характерны обильные выделения из носа, головная боль, кашель, фарингит. Температура редко повышается до высоких значений.

Исключение составляет новая коронавирусная инфекция 2019 года.

Последствия гриппа и ОРВИ

После ОРВИ возможны многие серьезные заболевания. Чаще прочего развивается бронхит. Возможны отиты и синуситы, пневмония. Респираторно-синцитиальный вирус, метапневмовирус, вирусы гриппа и аденовирусы вызвают бронхиты и пневмонию преимущественно у детей до 5 лет. Поражаются также органы не дыхательной системы, поэтому осложнением вирусной инфекции, чаще гриппа, может стать миокардит (воспаление сердечной мышцы), пиелонефрит и другие заболевания.

Инфицирование детей до 2х лет респираторно-синцитиальным вирусом, вирусами парагриппа и бокавирусом может привести к тяжелым состояниям, требующим госпитализации — крупу и бронхо-обструктивному синдрому.

Каким возбудителем инфицирован человек, может сказать только лабораторная диагностика, по клинической картине, к сожалению, это сделать невозможно. Лабораторный анализ на определение гриппа и других возбудителей респираторной инфекции даёт возможность назначить адекватное лечение, определить прогноз, не допустить характерных для каждого возбудителя осложнений и избежать необоснованной антибиотикотерапии.

Где можно сдать анализ на грипп?

Сдать анализ на вирус гриппа и других возбудителей респираторных инфекций можно в Центре Молекулярной диагностики (CMD. Целесообразно сдавать анализ на выявление гриппа и возбудителей ОРВИ при подозрении на вирусную инфекцию в первые — вторые сутки заболевания, когда возбудитель содержится в организме в максимальном количестве.

Диагностика гриппа и острых респираторных вирусных инфекций в CMD:

Как работают диагностические тесты

Молекулярно-генетические методы, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), способны обнаружить геном возбудителя в мазке из носоглотки заболевшего.

ПЦР — быстрый прямой метод диагностики, способный обнаружить специфичные участки генома микробов, то есть отличающие их друг от друга. Метод ПЦР по сути является экспресс-анализом на грипп и другие респираторные инфекции.

Основа метода - многократное избирательное копирование (амплификация) определённого участка ДНК/РНК с целью получения такого количества генетического материала, которого будет достаточно для визуального обнаружения. При этом многократно копируется только заданный участок генома. Так как геном уникальная часть каждого организма, ПЦР позволяет безошибочно определить какой именно вирус стал причиной болезни. Следовательно, врач, исходя из результатов этого анализа, сможет назначить лечение, которое будет эффективно в отношении конкретного вируса.

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Исследование урогенитального тракта методом ПЦР на ИППП ;

тест методом ПЦР на коронавирус Covid-19, мазок из носа и зева на определение РНК вируса SARS-CoV-2;

Для проведения исследования в медицинских офисах необходимо предъявить СНИЛС и документ удостоверяющий личность. Запись на исследование В случае получения положительного или сомнительного результата на COVID-19 и при необходимости проведения подтверждающего тестирования обра.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
термостабильная ДНК-полимераза;
дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК– рибонуклеиновая кислота - биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев - нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды - основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) - гуанин, цитозиновый (C) - цитозин, тиминовый (Т) - тимин, урациловый (U) - урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов - A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа - A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК - рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Читайте также: