Тест-система на вирус зика

Обновлено: 27.03.2024

Рассмотрены этиология, пути передачи, патогенез и клинические признаки лихорадки Зика, методы диагностики, профилактики и контроля заболеваемости.

Aetiology, ways of transmission, pathogenesis and clinical signs of Zika virus were considered, as well as the methods of diagnostics, prevention and morbidity control.

Лихорадка Зика — быстро распространяющаяся острая зооантропонозная арбовирусная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя. Распространена в странах тропического и субтропического пояса. В настоящее время заболевание мало изучено [1, 2].

Возбудителем заболевания является вирус Зика (англ. Zika virus, ZIKV), относящийся к арбовирусам семейства Flaviviridae рода Flavivirus [3]. Следует отметить, что флавивирусы являются возбудителями целого ряда инфекционных болезней: желтой лихорадки, лихорадки Денге, клещевого энцефалита, омской геморрагической лихорадки, энцефалита Повассан, японского энцефалита, энцефалита Сент-Луис, энцефалита Долины Муррея и лихорадки Западного Нила.

Структура вируса схожа со структурой других флавивирусов, имеет нуклеокапсид сферической формы диаметром около 50 нм с мембраной, являющейся гликопротеиновой оболочкой, поверхностные белки которой располагаются в иксоаэдрической симметрии. Внутри нуклеокапсида содержится одноцепочечная линейная РНК, содержащая 10 794 нуклеотида, кодирующая 3 419 аминокислот, составляющих белковые структуры вируса. Прикрепление вируса к цитоплазматическим клеточным мембранам и его проникновение внутрь клетки обусловлено наличием специального мембранного белка Е [4] (рис. 1).

Вирус Зика

Репликация вирусной РНК происходит на поверхности эндоплазматического ретикулума в цитоплазме клеток-мишеней. Для синтеза собственного полипротеина вирус использует белки зараженных им клеток хозяина. Далее в процессе репликации РНК в клеточную мРНК производится синтез собственных структурных и неструктурных нуклео­протеидов, сборка вирусной клетки и выход вируса посредством лизиса клетки хозяина.

Следует также отметить высокую способность флавивирусов к мутациям, обусловленным несовершенством механизма копирования генетической информации, что может приводить к изменению антигенных свойств и вирулентности вируса.

Впервые вирус был выделен от макак-резусов (лат. Macaca mulatta) 18 апреля 1947 г. в ходе работы по мониторингу за лесной формой желтой лихорадки в лесу Зика (Уганда), в рамках исследовательской программы Рокфеллера, откуда и берет начало название возбудителя. Двумя днями позже лихорадящие обезьяны были доставлены в лабораторию, где их сывороткой были заражены мыши. Через 10 дней у всех мышей были отмечены симптомы заболевания. В дальнейшем возбудитель был выделен из мозга зараженных животных. В 1948 г. вирус впервые выделен из организма самки комара рода Aedes aegipti, а в 1968 — из биоматериалов представителей коренного населения Нигерии. С 1951 по 1981 г. были зафиксированы спорадические случаи заболевания на территории Африки — в Уганде, Танзании, Египте, Центральной Африканской Республики, Сьерра Леоне, Габоне, Сенегале, а также в некоторых странах Азии, включая Индию, Малайзию, Филиппины, Таиланд, Вьетнам и Индонезию. В апреле 2007 г. на островах Яп на территории Федеральных Штатов Микронезии впервые была зафиксирована вспышка лихорадки Зика с лабораторно подтвержденными случаями заболевания (выделена РНК вируса Зика в биоматериалах от пациентов в острой фазе болезни). В 2013 г. вспышка на территории Французской Полинезии. В 2015 г. началось активное распространение вируса на территории Центральной и Южной Америки.

Регионы, эндемичные по лихорадке Зика

Источник возбудителя — больные люди, здоровые вирусоносители, обезьяны, зараженные вирусом. От человека к человеку и от животных вирус передается с укусами комаров рода Aedes (A. aegipti и А. albopictus), которые также являются переносчиками возбудителей лихорадки Денге, желтой лихорадки и чикунгуньи. Наибольшую эпидемическую опасность представляет комар A. aegipti, который распространен в тропических и субтропических районах, но не выживает при более низких температурах. А. albopictus также способен переносить вирус, но может впадать в состояние спячки и выживать в регионах с более низкой температурой. Комары инфицируются вирусом от зараженных людей и животных [5]. Не исключена возможность адаптации вируса к организму комаров других видов.

Для самок комаров A. aegipti и А. albopictus характерно прерывистое питание, вследствие чего они кусают нескольких человек за цикл питания. Через 3 дня после завершения цикла питания самка комара откладывает яйца, которые могут сохраняться до года при отсутствии воды. В водной среде яйца превращаются в личинки, а далее в половозрелые особи. Для цикла развития нужно очень небольшое количество воды. Комары выше­описанных видов могут пролетать расстояние не более 400 м, но часто неумышленно заносятся людьми, например в багажниках машины, с вещами, растениями, на большие расстояния. При возможности выживания и размножения в новом температурном климате комары могут приводить к распространению вируса в регионах, куда были завезены [5].

Основной механизм передачи возбудителя — трансмиссивный. В настоящий момент описаны случаи заражения половым путем и при переливании крови [6–8]. Также, по данным бразильских ученых, вирус проникает через гематоплацентарный барьер, вызывая внутриутробное инфицирование плода с последующим развитием тяжелой врожденной патологии [9–12].

Естественный резервуар вируса пока остается неизвестным [5].

Патогенез болезни на данный момент также мало изучен. В ходе недавних исследований было доказано, что в первую очередь вирус поражает дермальные фибробласты, кератиноциты эпидермиса, незрелые дендритные клетки в месте внедрения, затем достигает лимфатических узлов с последующим гематогенным распространением. За адгезию и проникновение вируса внутрь клеток-мишеней отвечает фосфатидилсериновый рецептор AXL, находящийся на поверхности иммунных клеток кожи. В этих клетках были обнаружены пораженные ядра в месте предполагаемого внедрения вируса. Повышение репликации вируса вызывает в клетках продукцию интерферона I типа и аутофагосом. Доказана высокая чувствительность вируса к интерферонам I и II типа. На протяжении болезни отмечается стойкое повышение активности Т-клеток (в основном Th1, Th2, Th9 и Th17) выражающееся в увеличении уровня соответствующих цитокинов с четким возрастанием к периоду реконвалесценции [1, 13, 14].

Манифестация заболевания, по данным Всемирной организации здравоохранения, происходит в 1 из 5 случаев заражения, что характерно и для других флавивирусных инфекций.

Инкубационный период заболевания неизвестен. По некоторым данным составляет от 2 до 7 дней, по другим — может длиться до двух месяцев (в связи с чем в США введен запрет на донорство в течение двух месяцев для всех вернувшихся из эндемичных районов).

Клиническая картина заболевания многообразна, сходна с таковой при лихорадке Денге и чикунгунья. Длительность болезни составляет от 2 до 7 суток. Чаще заболевание начинается с появления лихорадки, хотя в некоторых случаях может протекать на фоне нормотермии. Характерны головная боль, боли в мышцах и суставах, конъюнктивит. Обычно на 2–3 день болезни на коже туловища, шеи, верхних и нижних конечностей (иногда включая ладони и стопы) появляется пятнисто-папулезная сыпь (рис. 3). Часто отмечается развитие конъюнктивита. В редких случаях заболевание может сопровождаться головокружением, рвотой, диареей, болями в животе. В целом заболевание протекает доброкачественно и, в отличие от лихорадки Денге, развитие геморрагического синдрома не отмечается [1, 4, 6, 11, 15]. Известны случаи проявления заболевания изолированным конъюнктивитом. Имеются данные, что особую опасность заражение представляет для беременных женщин в первом триместре беременности, что обусловлено проникновением вируса через гематоплацентарный барьер с последующим развитием внутриутробной инфекции, приводящей к серьезной патологии развития плода (микроцефалия) [9–12]. В 2015 г. описан случай заражения беременной женщины в конце первого триместра беременности. На момент перенесения заболевания, сопровождавшегося лихорадкой и сыпью, женщина проживала на территории Бразилии. На 29?й неделе беременности ультразвуковым методом была выявлена микроцефалия плода. После экстренного искусственного родоразрешения пациентки была проведена аутопсия плода, подтвердившая наличие микроцефалии с компонентами гидроцефалии, агирии и наличием очагов мультифокального воспаления, петрификатов. В веществе головного мозга плода методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и электронной микроскопии был обнаружен вирус Зика. Существуют данные связи лихорадки Зика с развитием синдрома Гийена–Барре, а также различных аутоиммунных реакций [1, 4, 16].

Клиническая картина заболевания, пятнисто-папулезная сыпь

В настоящее время нет никаких свидетельств того, что вирус Зика у переболевших женщин представляет опасность инфицирования плода при будущих беременностях. Вирус Зика обычно остается в крови инфицированного человека в течение приблизительно недели [12].

Ввиду легкого течения заболевания специфического лечения не требуется. Рекомендуется соблюдение постельного режима, применение любых доступных нестероидных противовоспалительных средств. С целью дезинтоксикации рекомендовано обильное питье. В случае усугубления симптомов — обращение за медицинской помощью. Особое внимание следует уделять беременным пациенткам [2, 5].

В связи с клиническим сходством с другими тропическими лихорадками клиническая диагностика малоинформативна.

Для лабораторной диагностики лихорадки Зика методом выбора является ПЦР и выделение вируса из образцов крови. Серологическая диагностика малоинформативна в силу перекрестных реакций с другими флавивирусами, такими как вирус лихорадки Денге, вирус Западного Нила и вирус желтой лихорадки [2, 5, 6].

Профилактика и контроль заболеваемости заключается в сокращении численности комаров путем преобразования и/или уничтожения мест их размножения, снижении вероятности их контакта с населением путем использования репеллентов, москитных сеток на дверях и окнах, противомоскитного полога для сна. Следует помнить, что для размножения комарам рода Aedes требуется очень малое количество воды, поэтому нужно опорожнять сельскохозяиственные резервуары с водой (ведра, бочки, горшки для растений и т. д.). Также большую роль играет санпросветработа с населением. Особую осторожность следует соблюдать при поездках в эндемичные по заболеванию районы: использовать средства индивидуальной защиты (репелленты, закрытую форму одежды), а также избегать мест распространения комаров [2, 3, 5].

В США предостерегают от половых контактов лиц, вернувшихся их эндемичных районов по лихорадке Зика: совсем воздержаться при наличии беременной партнерши и соблюдать осторожность во всех остальных случаях [17].

Всемирная организация здравоохранения оказывает помощь странам в осуществлении контроля над болезнью, вызванной вирусом Зика, следующим образом:

  • сделать приоритетными научные исследования в области болезни, вызванной вирусом Зика, путем созыва экспертов и партнеров;
  • усилить эпиднадзор за вирусом Зика и потенциальными осложнениями;
  • усилить потенциал для передачи информации о риске распространения в целях содействия странам в выполнении их обязательств по Международным медико-санитарным правилам;
  • обеспечить специальную подготовку в области клинического ведения, диагностики и борьбы с переносчиками, в том числе с помощью ряда сотрудничающих центров Всемирной организации здравоохранения;
  • усилить потенциал лабораторий для выявления вируса;
  • поддерживать органы здравоохранения в осуществлении стратегии борьбы с переносчиками, ориентированной на уменьшение популяций комаров Aedes, таких как предоставление ларвицидов для обработки стоячей воды в местах, которые не могут быть обработаны иным образом, то есть путем мытья, опорожнения, накрывания;
  • подготовить рекомендации в отношении клинической помощи и последующего наблюдения за людьми, инфицированными вирусом Зика, в сотрудничестве с экспертами и другими организациями здравоохранения [2, 5, 18, 19].

Пациентка находится в боксированном отделении инфекционной больницы в удовлетворительном состоянии. У обследованных контактных членов семьи результаты исследований на вирус Зика отрицательные.

Перед развитием заболевания больная вернулась из туристической поездки в Республику Доминиканы. Через несколько дней после возвращения было зафиксировано ухудшение самочувствия, появление лихорадки, сыпи.

Пациентка была незамедлительно госпитализирована с рекомендацией обследования на геморрагические лихорадки. По результатам лабораторного исследования отечественной тест-системой в биологических жидкостях заболевшей выявлена РНК вируса Зика.

На борту рейса, на котором прибыла больная, проведен комплекс противоэпидемических мероприятий, опасность для прилетевших этим рейсом отсутствует.

С начала 2016 г. Роспотребнадзором начат еженедельный мониторинг лиц, прибывающих из стран, неблагополучных по трансмиссивным лихорадкам. На 15 февраля 2016 г. в аэропортах и морских пунктах пропуска, принимающих рейсы из стран Южной и Центральной Америки и Карибского бассейна, Бразилии, Юго-Восточной Азии и Океании и Африки, досмотрено более 50 тысяч лиц на наличие признаков инфекционных заболеваний.

Роспотребнадзор также сообщает, что в климатических условиях Российской Федерации риска распространения лихорадки Зика нет. Также обращено внимание на планирование отдыха в странах тропического и субтропического регионов: предпочтительно выбирать страны, благополучные в эпидемиологическом отношении.

При появлении одного или нескольких симптомов заболевания (жар, сыпь, конъюнктивит, боли в мышцах и суставах, озноб, общая слабость) в течение 2–3 недель после возвращения из стран, эндемичных по вирусу Зика, необходимо незамедлительно обратиться к врачу.

Литература

Ю. Я. Венгеров, доктор медицинских наук, профессор
О. В. Парфенова 1

ГБОУ ВПО МГМСУ им. А. И. Евдокимова МЗ РФ, Москва

Вирус Зика является переносимым комарами флавивирусом, впервые выявленным у обезьян в Уганде в 1947 году. Позднее, в 1952 г., вирус был выявлен у людей в Уганде и Объединенной Республике Танзания.

Вспышки болезни, вызванной вирусом Зика, регистрировались в Африке, Америке, Азии и в Тихоокеанском регионе. В 1960-1980-х гг. в Африке и Азии выявлялись редкие отдельные случаи инфицирования людей, которые обычно сопровождались болезнью в легкой форме.

В октябре 2015 г. Бразилия сообщила о связи между вирусной инфекцией Зика и микроцефалией. Вскоре вспышки болезни и передача инфекции стали регистрироваться в Америке, Африке и других регионах мира. На сегодняшний день, в общей сложности, 86 стран и территорий сообщили фактические данные о вирусной инфекции Зика, передаваемой комарами.

Признаки и симптомы

По оценкам, длительность инкубационного периода (с момента контакта с вирусом до появления симптомов) болезни, вызванной вирусом Зика, составляет 3-14 дней. У большинства людей, инфицированных вирусом Зика, симптомы не развиваются. Симптомы болезни, как правило, слабо выражены и включают повышение температуры, сыпь, конъюнктивит, боли в мышцах и суставах, общее недомогание и головную боль, которые обычно длятся 2-7 дней.

Осложнения болезни, вызванной вирусом Зика

Вирусная инфекция Зика во время беременности является причиной развития микроцефалии и других врожденных патологий у плода и новорожденного ребенка. Она также приводит к таким осложнениям, как потеря плода, мертворождение и преждевременные роды.

Вирусная инфекция Зика может также запускать механизм развития синдрома Гийена-Барре, невропатии и миелита, особенно у взрослых людей и детей старшего возраста.

Продолжаются научные исследования для изучения воздействия вирусной инфекции Зика на результаты беременности, стратегий профилактики и контроля, а также связи инфекции с другими неврологическими расстройствами у детей и взрослых.

Передача инфекции

Вирус Зика передается, в основном, при укусах инфицированных комаров рода Aedes, главным образом Aedes aegypti, в тропических и субтропических районах. Комары Aedes обычно кусают в дневное время, а пик их активности приходится на раннее утро или предвечерние/вечерние часы. Этот же комар переносит денге, чикунгунью и желтую лихорадку.

Вирус Зика передается также от матери плоду во время беременности, при половых контактах, переливании крови и продуктов крови и при пересадке органов.

Диагностика

Лечение

На сегодняшний день лечения вирусной инфекции Зика и связанных с ней болезней не существует.

Симптомы вирусной инфекции Зика обычно слабо выражены. Люди с такими симптомами, как повышенная температура, сыпь или боли в суставах, должны много отдыхать, пить достаточно жидкости и принимать обычные болеутоляющие и жаропонижающие средства. При усугублении симптомов необходимо обращаться за медицинской помощью и консультацией.

Беременные женщины, которые живут в районах с передачей вируса Зика или у которых развились симптомы вирусной инфекции Зика, должны обращаться к врачу для лабораторного тестирования и получения другой клинической помощи.

Профилактика

Укусы комаров

Основной мерой профилактики вирусной инфекции Зика является защита от укусов комаров в дневное и раннее вечернее время. Особое внимание следует уделять предотвращению укусов комаров среди беременных женщин, женщин репродуктивного возраста и детей раннего возраста.

Меры индивидуальной защиты включают ношение одежды (предпочтительно светлой), максимально закрывающей тело; использование физических барьеров (устанавливать на окна сетки, закрывать двери и окна); и нанесение на кожу или одежду репеллентов, содержащих ДЭТА, IR3535 или икаридин, согласно инструкции на этикетке.

Днем и ранним вечером дети раннего возраста и беременные женщины должны спать под противомоскитными сетками. Туристы и жители затронутых районов должны принимать описанные выше основные меры предосторожности для защиты от укусов комаров.

Комары Aedes размножаются в небольших емкостях с водой поблизости от домов, школ или мест работы. Важно уничтожать такие места размножения комаров, в том числе накрывать контейнеры для хранения воды, удалять стоячую воду из цветочных горшков и убирать мусор и использованные шины. Инициативы местных сообществ имеют важное значение для поддержки местных властей и программ общественного здравоохранения в их усилиях по сокращению мест размножения комаров. Органы здравоохранения могут также рекомендовать использовать ларвициды и инсектициды для сокращения популяций комаров и ограничения распространения болезни.

Вакцины для профилактики вирусной инфекции Зика или ее лечения на сегодняшний день не существует. Разработка такой вакцины является активной областью научных исследований.

Передача инфекции во время беременности

Вирус Зика может передаваться от матери плоду во время беременности и приводить к развитию микроцефалии (уменьшенные размеры головы) и других врожденных патологий у ребенка, совокупность которых определяют как врожденный синдром, вызванный вирусом Зика.

Микроцефалия является следствием аномального развития мозга или утраты мозговой ткани. Последствия для ребенка зависят от степени поражения мозга.

Врожденный синдром, вызванный вирусом Зика, включает и другие патологии, в том числе контрактуры конечностей, высокий мышечный тонус, офтальмологические патологии и потерю слуха. Риск развития врожденных патологий после перенесенной во время беременности инфекции до сих пор неизвестен; по оценкам, у 5-15% детей, рожденных женщинами, которые были инфицированы вирусом Зика во время беременности, имеются признаки осложнений, связанных с вирусом Зика. Врожденные патологии могут развиваться независимо от того, сопровождалась ли инфекция симптомами или протекала бессимптомно.

Передача инфекции половым путем

Вирус Зика может передаваться половым путем. Это представляет проблему с точки зрения связи между вирусной инфекцией Зика и неблагоприятными последствиями для беременности и для плода.

Для районов с активной передачей вируса Зика все люди с вирусной инфекцией Зика и их половые партнеры (особенно беременные женщины) должны получать информацию о рисках передачи вируса Зика половым путем.

ВОЗ рекомендует надлежащим образом консультировать всех сексуально активных мужчин и женщин и предлагать им полный спектр методов контрацепции, с тем чтобы они могли принимать обоснованные решения в отношении беременности и сроков ее наступления в целях предотвращения возможных неблагоприятных последствий для беременности и для плода.

Женщины, у которых были незащищенные половые отношения и которые не хотят забеременеть из-за опасений в отношении вирусной инфекции Зика, должны иметь возможность беспрепятственно воспользоваться срочными услугами по предотвращению беременности и получить соответствующую консультацию. Беременные женщины должны придерживаться более безопасного полового поведения (в том числе правильно и постоянно использовать презервативы) или воздерживаться от половых отношений как минимум в течение всего срока беременности.

В районах, где нет активной передачи вируса Зика, ВОЗ рекомендует мужчинам и женщинам, возвращающимся из районов с активной передачей вируса Зика, придерживаться более безопасного полового поведения или воздерживаться от половых отношений в течение шести месяцев для мужчин и двух месяцев для женщин в целях предотвращения инфицирования их половых партнеров. Половым партнерам беременных женщин, живущим в районах с местной передачей вируса Зика или возвращающимся из таких районов, рекомендуется придерживаться безопасного полового поведения или воздерживаться от половых отношений на протяжении всего срока беременности.

Деятельность ВОЗ


Обзор

Zika Virus — эмерджентная инфекция, распространение которой не на шутку взволновало ВОЗ и мировые СМИ.

Автор
Редактор


Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

Лихорадка Зика: что за зверь и откуда он взялся?

История распространения вируса Зика

Рисунок 1. История распространения вируса Зика.

Вирус Зика имеет типичное для семейства Flaviviridae строение: геном РНК+ (РНК вируса в зараженной клетке играет роль иРНК), нуклеокапсид и гликопротеидный суперкапсид, икосаэдральный тип симметрии (рис. 2). Основу суперкапсида составляет гликопротеид Е, который является основным фактором адгезии вируса, принимает участие в объединении оболочки вируса с мембраной клетки. Кроме того, в состав вириона входят высокомолекулярные белки НС1, NS3, NS5 и низкомолекулярные NS2A, NS2B, NS4A и NS4B. Их роль на данный момент является малоизученной [3].

Модель вируса Зика

Рисунок 2. Модель вируса Зика. Модель сделана компанией Visual Science.

Где и как распространяется вирус Зика?

Вирус Зика долгое время считался классическим примером арбовирусной инфекции. Грубо говоря, группы вирусных инфекций совершенно разной генетической природы, которые объединяет лишь одно — членистоногие в качестве переносчиков. Специфическими переносчиками вируса Зика являются комары Aedes aegypti (рис. 3) и Aedes albopictus [2]. Ареал обитания этих видов ограничен экваториальной и тропической областями. Соответственно, вирус может активно распространяться только в этих регионах. Так было принято считать до недавнего времени.

Aedes aegypti

Рисунок 3. Aedes aegypti — переносчик вируса Зика.

В связи с быстрым распространением лихорадки Зика в Центральной и Южной Америках, подтверждением трансплацентарного пути передачи, а также возникновением неэндемичных случаев заболевания вне границы обитания комаров-переносчиков, ученые принялись более подробно изучать пути передачи вируса. Понятно, что кто ищет, тот всегда найдет — это и произошло в результате исследования. Все гипотезы имеют косвенные или малочисленные доказательства, но от этого являются не менее интересными. Предполагается возможность передачи вируса во время гемотрансфузий, также совсем недавно было установлено, что самки комаров Aedes могут заражать свое потомство. Особо опасной считается возможность полового пути передачи, ведь именно он стирает границы эндемичности лихорадки Зика и наделяет это заболевание высоким уровнем социальной опасности [4].

Почему так много шума?

В научной литературе клиническую картину лихорадки называют облегченной версией лихорадки денге, не отягощенной геморрагическим синдромом и летальностью [5]. Правда, для того, чтобы приблизительно понять, что это значит, нужно еще найти человека, который хотя бы один раз видел вживую пациента, зараженного вирусом лихорадки денге. Если говорить проще, то лихорадка Зика проявляется точно так же, как многие другие инфекционные заболевания (рис. 4). Подтвердить диагноз возможно только лабораторно.

Клиническая картина лихорадки Зика

Рисунок 4. Клиническая картина лихорадки Зика.

Важно отметить, что лабораторная диагностика вируса Зика весьма затруднительна и не всегда точна. Исследование методом иммуноферментного анализа (ИФА) может давать ложноположительные результаты, поскольку вирус Зика содержит антигены, перекрестно реагирующие с антителами вируса лихорадки денге. Более-менее надежный способ диагностики на данный момент — полимеразная цепная реакция (ПЦР) [6].

Перспективным направлением в лабораторной диагностике является использование нанотехнологий. Яркий пример — метод спектроскопии с использованием серебряных наночастиц, усиливающих сигнал. Методика основана на SERS — комбинационном рассеивании света. Благодаря такому виду диагностики менее чем за 1 минуту можно выявить следовые частицы вируса в биологическом материале, а также идентифицировать штаммы репродуцирующихся вирусов, выявляя даже наименьшие спектральные различия в строении белков [7].

Атомно-силовой микроскоп

Рисунок 5. Схема работы атомно-силового микроскопа.

Микроцефалия

Рисунок 6. Сравнение размера головы ребенка с синдромом микроцефалии с физиологической нормой.

Что касается осложнений у взрослых, то это тот самый случай, когда редко, но метко. Синдром Гийена-Барре проявляется неврологическими расстройствами, которые имеют патогенез вялых параличей. У пациентов наблюдаются мышечная слабость, паралич лицевого нерва и бульбарный паралич. Последний становится причиной смерти 5% пациентов. Еще 20% вследствие патологии становится инвалидами, что пугает даже больше. Прямых доказательств связи синдрома Гийена-Барре с заражением вирусом Зика пока нет, но тот факт, что об этом говорит ВОЗ, как бы намекает [11].

Так много букв, но что делать?

Лабораторная диагностика

Неспецифическую профилактику проще всего обеспечить туристам: ну не ездите вы в беременном состоянии в регионы эпидемии! Во всех остальных случаях отменять поездки не обязательно, но меры предосторожности лучше соблюдать. Они включают применение репеллентов, москитных сеток, защищенные половые контакты. Власти стран с наличием эпидемии либо риска ее возникновения должны проводить профилактическую дезинсекцию и уничтожение потомства комаров рода Aedes (рис. 8).

Вирус Зика

Рисунок 8. Уничтожение комаров-переносчиков необходимо для предотвращения распространения вируса Зика.

Как эпидемия вируса Зика влияет на мир?

Распространение лихорадки Зика по земному шару стало причиной значительного резонанса в обществе именно благодаря тератогенному действию вируса. Дело в том, что наиболее серьезная эпидемическая ситуация в связи с этим заболеванием сложилась в странах Африки, Центральной и Южной Америки. Очень часто это страны с резко патриархальной культурой (особенно африканские), где не то, что аборты не разрешены, там до сих пор популярна традиция женского обрезания (Нигерия, Камерун, Конго и т.д.) [15]! В Латинской Америке, в первую очередь, в Бразилии, ситуация немногим лучше: возможность искусственно прервать беременность — это всего лишь редкие исключения, подтверждающие правило. Из-за страха врожденной патологии у ребенка женщины этих стран очень часто идут на незаконный аборт, который чреват летальным исходом. Такое положение дел не может не волновать общество, поэтому во многих странах Латинской Америки впервые за много лет был поднят вопрос легализации абортов (рис. 9). Впрочем, на данный момент никакого решения не последовало даже в Бразилии, где резонанс был особо высоким [16].

Демонстрация за аборты

Рисунок 9. Демонстрация в поддержку права женщин на свободный аборт.

Кроме того, эпидемия лихорадки Зика некоторое время угрожала проведению Олимпийских игр 2016 в Рио-де-Жанейро. Несколько команд даже отказались от участия в соревнованиях из-за опасности заражения. Однако сейчас, когда игры уже завершились, можно смело сказать, что вирус Зика на Олимпиаду никак не повлиял.

В заключение

Сложно сказать, насколько сильным будет распространение вируса Зика, останется ли за ним статус пандемии, который заболеванию приписывает часть научного сообщества. Во многом все зависит от того, подтвердится ли половой путь передачи инфекции, не возникнет ли адаптации возбудителя к новым переносчикам, в частности, другим представителям рода Aedes. Возможно, позже будет создана эффективная и безопасная вакцина — тогда опасность заболевания будет полностью нивелирована. А пока остается расслабиться, следить за новостями и не паниковать раньше времени.


Обзор

Реконструкция оболочки вируса Зика. Карта поверхности вириона (разрешение — 3,8 Å), полученная с помощью программной обработки криоэлектронных микрофотографий, позволяет предположить, как именно вирус поражает те или иные клетки, и вычислить потенциальные мишени для терапии или компоненты для вакцины. Симметрически неэквивалентные мономеры вирусного гликопротеина Е окрашены разными цветами.

Автор
Редакторы

В эпоху глобализации из-за свободного перемещения людей по миру проникновение ZIKV в новые регионы становится неизбежным. Там он может длительно сохраняться, передаваясь от животных к животным и изредка вызывая мелкие вспышки болезни у людей, либо циркулировать в человеческой популяции. Угроза, исходящая от любого нового заболевания, зависит от его эпидемиологии, клинических особенностей и способности медицинского сообщества эффективно его контролировать (рис. 1). И сейчас огромные усилия брошены на изучение особенностей вируса Зика и механизмов его воздействия на человеческое здоровье, в особенности — на здоровье беременных [1].

Операция по уничтожению комаров в Бразилии

Рисунок 1. Сотрудник муниципальной службы города Ресифи (Бразилия) во время операции по уничтожению комаров Aedes aegypti, переносящих вирус Зика.

Хронология событий в Зика-эпопее

Микрофотография вируса Зика

Рисунок 2. Микрофотография вируса Зика, полученная с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ). Вирусные частицы размером 40 нм окрашены синим цветом.

В Энтеббе расположен Угандийский исследовательский институт вирусологии (Uganda Virus Research Institute, UVRI), чьи сотрудники в 1947 году при изучении желтой лихорадки в лесу Зика выделили из крови макаки до тех пор неизвестный флавивирус. Ученые описали его как вирус Зика (рис. 2). А на следующий год обнаружили вирус в комарах Aedes africanus [3].

В 1952 году вирус выявили уже у людей — в Уганде и Танзании, а в 1954 году — в Нигерии. ZIKV четко ассоциировался с лихорадкой и кожной сыпью, в связи с чем его окончательно объявили патогенным для человека. Тогда же, в 50-е, экспериментальным путем с участием добровольцев установили основного переносчика вируса — комара Aedes aegypti, обычного переносчика желтой лихорадки, лихорадки денге и чикунгуньи. Позже компанию ему составили и другие виды, в том числе Aedes albopictus [1].

В 60–80-е годы легкие формы инфекции выявляли в странах Африки, Азии и в Индии. Длительное присутствие ZIKV в этих регионах подтверждалось обнаружением вируса в комарах и нечеловекообразных обезьянах. У людей до 2007 года фиксировали не так много клинических случаев, и потому система здравоохранения не спешила бить тревогу [4].

Первую крупную вспышку лихорадки Зика зарегистрировали в 2007 году на острове Яп в тихоокеанских Федеративных штатах Микронезии, где инфицированными оказались 73% населения, однако симптомы у подавляющего большинства были умеренными и недолгими. Следующая вспышка охватила в 2013–2014 годах Французскую Полинезию, где заразились 66% жителей. Одновременная волна заболеваемости синдромом Гийена-Барре подняла вопрос о его ассоциации с вирусом Зика: тогда зафиксировали 42 случая — а это на порядок больше, чем в 2012 году, когда синдром диагностировали у троих [1].

К 27 июля ZIKV циркулировал уже в 67 странах и территориях (рис. 3). Крупная вспышка заболевания произошла в Колумбии — там заразились 65 000 человек. У многих из них выявлялись неврологические синдромы, отмечались и случаи микроцефалии [1].

В июле 2016 зафиксировали две смерти, связанные с заражением ZIKV: в США и Пуэрто-Рико. Предполагают, что смерти вызвал не сам вирус, а обострившиеся во время лихорадки симптомы хронических заболеваний.

В середине августа 2016 года в Пуэрто-Рико ввели режим чрезвычайной ситуации, поскольку распространение вируса набирало обороты слишком быстро: за полгода (с декабря 2015 по 12 августа 2016) число заразившихся возросло с одного до 10 000 человек.

К 1 сентября в американской Флориде зарегистрировали 47 случаев заболевания, а в Майами-Бич впервые в США обнаружили трех комаров — переносчиков вируса Зика.

История распространения вируса Зика

Рисунок 3. История распространения вируса Зика по миру.

В Россию впервые вирус завезли в феврале 2016 года из Доминиканской республики. За прошедшие месяцы отмечены еще 7 случаев. Все — у туристов, вернувшихся из стран, где распространяется ZIKV: большинство — из Доминиканской республики, один — с Карибских островов. Все пациенты благополучно перенесли лихорадку.

Патогенез лихорадки Зика

Передача вируса и развитие болезни

Какие-то симптомы появляются у меньшинства инфицированных: на острове Яп лишь 19% заразившихся сообщили о симптомах, а во Французской Полинезии — 26%. Если признаки лихорадки развиваются, то в 95% случаев это происходит через 6–11 суток после заражения (рис. 4). Симптомы сходны с проявлениями других подобных инфекций [1], [4]:

  • повышенная температура тела;
  • кожная сыпь;
  • боль в суставах и мышцах;
  • головная боль;
  • конъюнктивит;
  • отеки;
  • иногда рвота;
  • общее недомогание.

Схема протекания инфекции

Рисунок 4. Схема протекания инфекции у человека и комара. В среднем признаки развиваются на шестой день после инфицирования. Примерно на девятый день начинается выработка иммуноглобулинов (антител): первым обнаруживают IgM, количество которого позже снижается одновременно с ростом концентрации IgG. Последний сохраняется в крови неопределенное время. Виремия, вероятно, возникает до появления симптомов, и ее продолжительность сказывается на риске инфицирования восприимчивых комаров, кусающих зараженного человека. После определенного инкубационного периода комар приобретает способность передавать возбудителя другим людям. Tg — интервал между эпизодами инфицирования первого и второго человека.

Виремия, или вирусемия — медицинское состояние, когда вирусы попадают в кровоток и могут распространяться по всему телу, — аналогично бактериемии, при которой в кровь попадают бактерии [9]. — Ред.

В клетку вирус Зика проникает, взаимодействуя с определенными рецепторами на ее поверхности. Основной из них — AXL. А посредником выступает рецептор TIM-1, который связывает вирусные частицы и транспортирует их к AXL, способствующему проникновению вируса в клетку. Однако TIM-1 не необходимое звено, он лишь повышает концентрацию вирионов на поверхности клетки и ускоряет их взаимодействие с AXL [10].

Когда вирус оказывается внутри клетки, она отвечает повышенной продукцией интерферонов IFN-α и IFN-β, а также хемокинов CXCL10 и CXCL11, которые играют важную роль во врожденном и адаптивном иммунитете. Эти хемокины привлекают Т-клетки и другие лейкоциты к месту воспаления и даже оказывают прямое антимикробное действие, когда их концентрация в кожных фибробластах сильно повышается [10].

Антитела к вирусу обнаруживают в крови уже на девятый день после заражения. Продолжительность иммунитета против ZIKV пока не известна, но, судя по другим флавивирусам, можно предположить, что он пожизненный [1].

Вирус Зика и беременность

Однако установить связь между ZIKV и микроцефалией оказалось достаточно сложно из-за нескольких обстоятельств:

  • остается неясным, сколько беременностей затронул вирус — инфекция ведь часто бессимптомна;
  • до сих пор нет четкого определения микроцефалии;
  • существуют другие инфекционные агенты, вызывающие микроцефалию: цитомегаловирус и Rubella virus (вирус краснухи).

Симптомы инфекции у беременных женщин такие же, как и у остальных, но пока не известно, влияет ли на частоту их проявления иммунодефицит, характерный для этого периода. Результаты исследований, касающихся неблагоприятных последствий заболевания для эмбриона, очень разнородны: где-то у 29% беременных с симптомами болезни развивался эмбрион с микроцефалией, а где-то и у 74%. Возможно, такие расхождения возникли потому, что в исследованиях участвовало недостаточное количество пациентов — меньше 50 человек. С определенной уверенностью можно утверждать лишь то, что ZIKV-ассоциированная микроцефалия разовьется у плода одной из ста инфицированных в первый триместр женщин независимо от наличия симптомов, и этот риск становится незначительным во второй и третий триместры [1].

Помимо микроцефалии с вирусом Зика сейчас связывают и другие эмбриональные патологии [1]:

  • внутричерепной кальциноз; ;
  • дефекты органа зрения;
  • гипоплазию ствола мозга; ; .

Устройство вируса Зика

Организация генома

К концу августа 2016 года в GenBank хранилось 67 полных последовательностей генома ZIKV. Вирус Зика содержит кодирующую молекулу РНК длиной 10,8 т.н. с одной ORF (открытой рамкой считывания), фланкированной нетранслируемыми участками (UTR) — 5′-UTR длиной 106 н. и 3′-UTR длиной 428 н. (рис. 5). ORF кодирует полипротеиновый предшественник, который впоследствии разделяется на три структурных белка (капсидный [С], премембранный [prM] и оболочечный [E]) и семь неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5). Вирусный полипротеин во время трансляции и/или после нее расщепляется вирусной протеазой, сигнальной пептидазой и неизвестной протеазой клетки-хозяина. Фрагмент pr затем, при производстве зрелых вирионов, обычно отсекается в аппарате Гольджи фурином [17].

Геном вируса

Рисунок 5. Геном вируса (представлен в виде последовательности кодируемых РНК белковых продуктов). Структурные белки окрашены серым цветом, неструктурные синим. Цифрами обозначены длины белков (число аминокислотных остатков). Стрелки указывают на места расщепления полипротеина.

Основные белки

Белок E — главный поверхностный гликопротеин флавивирусов, а неструктурные белки NS3 и NS5 — основные ферменты вирусной репродукции [17]. Структура этих белков показана на рисунке 6.

Структура главных белков ZIKV

Рисунок 6. Структура главных белков ZIKV.

Белок Е разделен на два структурных региона — стволовой и трансмембранный (на рис. 6 — stem и ТМ) — и три функциональных домена: домен I участвует в организации оболочки (рис. 7), домен II отвечает за взаимодействие мономеров, а домен III связывает клеточный рецептор.

NS3 состоит из протеазного и хеликазо-НТФазного доменов, которые осуществляют процессинг вирусного полипротеина и раскручивание структурированных участков во время синтеза вирусной РНК.

NS5 содержит метилтрансферазный домен, который метилирует 5’-CAP-участок геномной РНК, и домен РНК-зависимой-РНК-полимеразы (RNA dependent RNA polymerase, RdRp).

Трехмерная модель вируса Зика

Рисунок 7. Трехмерная модель вируса Зика в атомном разрешении, созданная в студии биомедицинской визуализации Visual Science. Модель построена по данным научных публикаций об организации вируса Зика и родственных вирусов и считается наиболее достоверной на текущий момент.

Известно, что гликозилирование играет важную роль в инфекционности, созревании и вирулентности флавивирусов [18], [19]. Для вируса Зика предсказаны потенциальные участки для N- и O-гликозилирования в белках prM, E, NS1 и NS4B, которые гликозилируются и в других флавивирусах. Исследования, посвященные роли этих сайтов в жизненном цикле вируса Зика, еще только планируются [17]. Правда, уже обнаружено одно структурное отличие белка Е ZIKV от подобных белков других флавивирусов — выставленная на поверхность вирусной частицы аминокислотная петля, с которой в позиции Asn154 связывается гликан (см. видео). Предполагают, что именно эта петля вместе с прикрепленным сахаром может отвечать за тропизм вируса (взаимодействие с рецепторами определенной группы клеток) и патогенез болезни [20].

Отличие в структуре белка Е ZIKV от гомологичных белков других флавивирусов.

исследовательская группа Университета Пердью, США

Борьба с вирусом Зика

Диагностика

Основные проблемы диагностики ZIKV-инфекции — это значительное количество бессимптомных случаев и неспецифичность симптомов: лихорадка денге и чикунгунья, которые тоже переносятся комарами рода Aedes, проявляются подобным образом. Предположить заражение вирусом Зика можно, если симптомы появляются у человека, который недавно побывал или длительно проживал в районе циркуляции ZIKV [1], [4].

Лучшим решением был бы высокоспецифичный тест на антитела, который можно использовать не только для подтверждения инфицированности, но и для проверки иммунитета против вируса Зика в самом начале беременности, что позволило бы женщинам понять степень риска. Однако такое тестирование осложняется кросс-реактивностью с другими флавивирусами. Определенные надежды дает тест ELISA. Например, IgG-ELISA, применяемый во Французской Полинезии, где циркулирует вирус денге, еще до основной вспышки лихорадки Зика выявлял ZIKV-позитивных доноров крови (тогда их было <1%) [1].

Профилактика

Основной способ — это защита от укусов комаров, в том числе и с помощью контроля их распространения.

В регионах циркуляции вируса Зика и потенциально опасных зонах людям рекомендуют носить светлую одежду, закрывающую как можно больше поверхности тела, устанавливать на окна и двери домов противомоскитные сетки, использовать сетку во время сна, а также применять репелленты с ДЭТА, IR3535 или икаридином [4].

Самки комаров Aedes после насыщения кровью откладывают яйца, которые в безводной среде могут сохраняться до года. Даже в минимальном количестве воды из яиц выходят личинки и дальше развиваются во взрослых особей. Потому для контроля численности и распространения комаров необходимо постоянно отслеживать и ликвидировать места их размножения: ведра, бочки, горшки с водой, сточные канавы, использованные автомобильные покрышки. В особых случаях прибегают к распылению инсектицидов [4].

Пример эффективного контроля численности переносчика вирусов — действия Уильяма Горгаса по ликвидации эпидемии желтой лихорадки в Гаване и регионе Панамского канала в начале XX века. Этот американский военврач и его команда устроили жестокую борьбу с антисанитарией и обработали все здания и улицы инсектицидами (от которых, к слову, пострадало и немало жителей). В результате желтая лихорадка была полностью побеждена [21].

В 50-х и 60-х годах в государствах Америки применяли интенсивные меры по контролю переноса возбудителя желтой лихорадки, включая повсеместное распыление ДДТ. Это привело к устранению Aedes aegypti из 18 стран и значительно сократило область распространения заболевания. Позже подобные программы успешно осуществили Сингапур и Куба. Конечно, через некоторое время лихорадка вернулась, но даже краткосрочный период без инфекции имел большое значение для населения [1].

Чтобы сократить риск передачи ZIKV половым путем (особенно во время беременности), мужчинам, проживающим в зонах циркуляции вируса или недавно побывавшим там, ВОЗ рекомендует пользоваться презервативами или воздерживаться от половой активности на всём протяжении беременности партнерши [4].

Лечение

Обычно заболевание протекает в легкой форме и не требует специального лечения. Во время лихорадки необходим отдых и обильное питье, иногда — прием препаратов для устранения боли и других неприятных симптомов [4].

Тем не менее существуют вещества, которые оказывают воздействие и на сам вирус Зика. Например, эффективно подавляет репродукцию вируса in vitro 2′-C-метиладенозин, а 7-деаза-2′-C-метиладенозин (МК-608) ингибирует репликацию ZIKV in vitro и затормаживает развитие болезни в экспериментах на мышах. Препараты 2′-C-метилцитидин, рибавирин, фавипиравир и T-1105 ослабляют цитопатическое действие вируса и снижают его урожай [22], [23].

Разумеется, вакцина решила бы проблему кардинально, но она до сих пор не разработана. Сейчас исследованиями занимаются 18 коммерческих компаний и исследовательских институтов [24–26]. Однако первая фаза клинических испытаний стартует не раньше конца 2016 года, а значит, готовая вакцина появится еще не скоро, и распространение инфекции по миру продолжится [1].

Заключение

Хотя всевозможные случайности в эволюции вирусов делают точный прогноз пандемий практически невозможным, научный мир пытается повышать скорость реакции на новые угрозы. В ближайшее время усилия биологов и медиков сосредоточатся на разработке единой стратегии, которую в любой момент можно было бы применить к той или иной вспышке заболевания. Такая стратегия позволит быстро разобраться в путях передачи, патогенезе и способах контроля инфекции, чтобы предотвратить ее глобальное распространение.


Обзор

Возможности применения трехмерных клеточных систем.

Автор
Редакторы


Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

SkyGen

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

От пробирки до организма

Ежегодно в лабораториях по всему миру разрабатываются тысячи противоопухолевых препаратов различных механизмов действия. Давайте отправимся в небольшое путешествие вместе с новоизобретенным препаратом, которое он совершает от лабораторного ламинара, где был разработан, до попадания в кровь первого пациента, где сможет выполнить свое предназначение.

Все начинается с доклинических исследований. Это, вероятно, одна из самых важных стадий тестирования. На этой стадии среди множества противоопухолевых препаратов выбирают лишь несколько наиболее эффективных, которые продолжат дальнейшие испытания. Как правило, первую фазу доклинических исследований проводят на культурах опухолевых клеток человека. От того, насколько действенным препарат покажет себя на этой, самой первой стадии, зависит дальнейшая его возможность прохождения испытаний на животных (как правило, мышах и далее — кроликах). И только потом, при успешном прохождении этой стадии, активные препараты допускаются до трех фаз клинических испытаний .

Кажется, гуманность и рациональность использования в качестве теста для нового препарата опухолевых клеток человека ни у кого не вызывает сомнений. Но часто именно на этой стадии у предполагаемо успешного препарата возникают проблемы.

Давайте зададим себе вопрос: каким свойствам должна соответствовать модель, на которой мы хотим протестировать лекарство? Очевидно, она должна быть, во-первых, доступной и простой в использовании; во-вторых, максимально приближенной по своим свойствам к раковой опухоли человека. Ведь использование рациональной тест-системы поможет избежать огромного количества денежных (и временных) расходов на проверку и перепроверку препарата. Клеточные культуры, на первый взгляд, отвечают этим требованиям. Однако по многим признакам они все же отличаются от настоящей раковой опухоли, находящейся в организме. Чем же?

Идеальная тест-система — какая она?

Помимо общеизвестных радио- и химиотерапии (уничтожающих не только раковые клетки, но и здоровые), а также хирургического удаления (очевидным недостатком которого является невозможность удалить все элементы опухоли хирургическим путем), существуют относительно новые и перспективные методы в противоопухолевой терапии, например, генная терапия и иммунотерапия, развившаяся на базе генной [6], [7]. Сейчас одним из самых эффективных подходов доставки противоопухолевых веществ, используемых как при химиотерапии, так и при иммунотерапии, является таргетированная (целенаправленная) доставка противоопухолевых веществ к раковым клеткам. Преимуществом такого вида терапии является то, что она не должна нанести вред здоровым клеткам организма [8].

Как же сегодня проходит испытание новоиспечённого препарата? Сначала опухолевые клетки человека культивируются (выращиваются) in vitro. Затем к полученной культуре добавляется противоопухолевый препарат. Клетки инкубируют, то есть дают им время провзаимодействовать с препаратом, и далее определяют, в какой степени он обладает противоопухолевым действием (и обладает ли) с помощью известных биологических методов, которые определяют жизнеспособность клеток (например, МТС-теста или МТТ-теста).

Что такое МТS-тест и МТТ-тест

MTS- и MTT-тесты позволяют оценить метаболическую активность клеток и судить об их жизнеспособности. В них используются реагенты, содержащие вещество тетразол. Проникая в живые клетки, тетразол под действием митохондриальных дегидрогеназ восстанавливается в пурпурно окрашенный и нерастворимый в воде формазан. Соответственно, чем больше жизнеспособность клетки, тем активней в митохондриях работают дегидрогеназы, тем интенсивнее получится фиолетовый окрас (рис. 1). При проведении данных тестов клетки лизируют (разрушают), а кристаллы формазана переходят в раствор в таких органических растворителях, как, например, ДМСО. Далее об активности митохондриальных дегидрогеназ и о жизнеспособности клеток судят по данным оптической плотности получившегося раствора.

96-луночный планшет

Рисунок 1. 96-луночный планшет после проведения MTT-теста. По изменению интенсивности окраса раствора можно судить о количестве живых клеток в ячейке.

Подробнее об этих методах можно прочитать в статье о методах исследования цитотоксичности при скрининге лекарственных препаратов [11].

Сначала Земля была плоской.

Двумерные монокультуры

Несмотря на то, что данному протоколу в этом году исполнилось 30 лет, а за прошедшие десятилетия ученые разработали более совершенные тест-системы, панель опухолевых клеточных линий имеет свои преимущества. Каждая из 60 линий формирует свой специфический ответ на исследуемое вещество, который сравнивается с уже имеющейся базой данных и подлежит дальнейшему изучению, чтобы потом сделать предположение о механизме действия того или иного препарата [13]. Если же биологический эффект от тестируемого препарата отличается от всех ранее занесенных в базу данных, можно предположить, что препарат имеет принципиально иной механизм действия. Панель опухолевых клеточных линий помогает определить, есть ли у того или иного препарата или химического соединения противоопухолевая активность по отношению к разным группам онкологических заболеваний [14]. Только представьте, каждый год подобным образом тестируются свыше 2500 препаратов! И только 2% из них достигают такого уровня эффективности, при котором их допускают к следующему уровню испытаний, — на животных.

Но даже эти препараты часто показывают низкую эффективность in vivo, потому что в организме происходит взаимодействие препарата не только с раковыми клетками, но и с компонентами опухолевого микроокружения – и это в трехмерной пространственной структуре, что не учитывается в модели плоских монокультур [15–17]. Достоверность результатов доклинического скрининга препарата можно было бы сделать выше, используя несколько типов клеток и/или конструируя опухоль в пробирке так, чтобы она имела трехмерную структуру.

Псевдодвумерные системы

  • одна голова хорошо, а две лучше: две клеточные линии (опухолевая и стволовая) проявляют большую жизнеспособность в состоянии стресса, находясь в ко-культуре;
  • жизнеспособность опухолевых клеток в трехмерной структуре значительно выше, чем в двумерной [20], [21]. Можно предположить, что сходным поведением обладают клетки настоящей раковой опухоли.

Несмотря на то, что данная модель шагнула дальше протокола 1990 года, у нее по-прежнему есть недостатки, например, небольшое количество клеточных линий. Всего две, в то время как раковая опухоль in vivo отличается куда большим разнообразием.

Конгломерат, формирующийся при совместном культивировании

Рисунок 2. Конгломерат, формирующийся при совместном культивировании мезенхимных стромальных клеток (МСК) и клеток нейробластомы SH-SY5Y на аналоге внеклеточного матрикса (Матригеле).

(а) — SH-SY5Y, меченные красной флуоресцентной меткой;
(б) — МСК, меченные зеленой флуоресцентной меткой;
(в) — культура при фазово-контрастной световой микроскопии;
(г) — совмещение изображений панелей А и B.
Масштабный отрезок — 100 мкм.

Мир 3D

Трехмерные модели

Существует несколько основных моделей многоклеточных структур.

Одним из относительно недавно заявленных способов стало, наконец, создание трехмерной структуры с использованием матрикса, имитирующего межклеточную архитектуру [27]. Ведь внеклеточный матрикс является очень важным компонентом окружения всех клеток, не только раковых: помимо структурной поддержки, в зависимости от его состава, матрикс может выполнять и другие важные функции, например, регулировать межклеточные взаимодействия [14], [28]. Данную модель уже можно считать многокомпонентной тест-системой, поскольку она содержит различные клеточные линии (и опухолевые, и иммунные, и стромальные клетки, которые ко-культивируют совместно). В ходе эксперимента можно регулировать как состав, так и плотность матричной системы. Получается, что данная система является более универсальной, так как для каждого конкретного типа клеток можно подобрать свои параметры и максимально имитировать естественную для клеток среду. На основе компонентов природного внеклеточного матрикса были созданы гидрогели, которые довольно точно воссоздают микроокружение клеток [29]. Но нужно понимать, что природный матрикс — очень сложная и многокомпонентная среда, с которой иногда возникают трудности при использовании в системах in vitro [28]. Некоторые компоненты природного матрикса вовсе не являются стандартными для использования в различных искусственно созданных системах. Потому их воздействие трудно предугадать и изучить, а сам гидрогель — назвать универсальным. Вслед за гидрогелем появились синтетические матриксы, заменившие его в трехмерных моделях in vitro [30], [31]. Привлекательность синтетических матриксов заключается в том, что они являются химически чистыми, т.е. не содержат неохарактеризованных веществ. Значит, результаты, полученные в искусственной системе с использованием данного матрикса in vitro, достаточно просто соотнести с результатами, полученными in vivo. Недостатком же использования синтетических матриксов является отсутствие именно тех сигнальных молекул, которые секретируются конкретной системой in vivo.

Что касается экспериментов, проведенных с известными противоопухолевыми препаратами и данными тест-системами, то их результаты действительно отличаются от экспериментов, проведенных с монокультурами и теми же препаратами.

График зависимости жизнеспособности клеток

Рисунок 3. График зависимости жизнеспособности клеток ко-культуры от концентрации противоопухолевого препарата цисплатина.

Серые столбцы — жизнеспособность клеток ко-культуры в процентном соотношении по сравнению с контрольными клетками, не обработанными цисплатином.
Черные столбцы — данные зависимости жизнеспособности монокультуры опухолевых клеток от концентрации цисплатина, приведены в качестве сравнения. Данные получены с помощью MTS-теста.

График зависимости жизнеспособности клеток

Рисунок 4. График зависимости жизнеспособности клеток ко-культуры от концентрации противоопухолевого препарата доксорубицина.

Серые столбцы — жизнеспособность клеток ко-культуры в процентном соотношении по сравнению с контрольными клетками, не обработанными доксорубицином.
Черные столбцы — данные зависимости жизнеспособности монокультуры опухолевых клеток от концентрации доксорубицина, приведены в качестве сравнения. Данные получены с помощью MTS-теста.

Из результатов различных опытов и экспериментов можно сделать вывод о том, что трехмерные многокомпонентные тест-системы позволяют нам оценить влияние препарата наиболее полно: влияние и на раковые клетки, и на другие типы клеток в культуре, и на межклеточные взаимодействия.

Прежде чем человечество выполнит важнейшую задачу, — научится лечить рак, — ему предстоит совершить длинный путь, одна из самых первых, но очень важных стадий которого — поиск идеальной тест-системы для отбора противоопухолевого препарата в доклинических исследованиях. Мы попробовали проанализировать, как они постепенно менялись и совершенствовались от простых двумерных монокультур до сложных трехмерных структур, включающих в себя несколько типов клеток. И все же ни одна из разработанных на данный момент тест систем не имитирует опухоль in vitro на 100%. Используя для тестирования противоопухолевых препаратов один из способов, мы не имеем полного понимания того, как тот или иной препарат поведет себя в организме. Это значит, что цель пока не достигнута; поиски должны продолжаться.

Читайте также: