Титр вируса метод рида и менча

Обновлено: 27.03.2024

Ключевые слова: вирус простого герпеса, ВПГ, клеточная культура, масляный экстракт водорослей, противовирусное действие, in vitro.

Для цитирования: Львов Н.Д., Мельниченко А.В., Алимбарова Л.М., Никитина А.А. Ингибиторный эффект препарата на основе масляного экстракта водорослей на репродукцию вируса герпеса в культуре клеток in vitro. РМЖ. 2019;1(II):51-55.

Drug inhibitory effect, based on algae oil extract, on the herpes virus reproduction in cell culture in vitro

N.D. Lvov, A.V. Melnichenko, L.M. Alimbarova, A.A. Nikitina

Gamalei National Research Center for Epidemiology and Microbiology, Moscow

Keywords: herpes simplex virus, HSV, cell culture, algae oil extract, antiviral effect, in vitro.
For citation: Lvov N.D., Melnichenko A.V., Alimbarova L.M., Nikitina A.A. Drug inhibitory effect, based on algae oil extract, on the herpes virus reproduction in cell culture in vitro. RMJ. 2019;1(II):51–55.

В статье представлены результаты оригинального исследования, посвященного изучению влияния препарата на основе масляного экстракта морских водорослей на репродукцию вируса простого герпеса 1, 2 в эксперименте in vitro на чувствительной модели — клеточной культуре.

Введение

Материал и методы

ОП опытных лунок = (ОП среды/ОП контр. лунок – ОП среды) ×100%,
где ОП — оптическая плотность.

Результаты и обсуждение

Определение цитотоксичности МЭВ

На первом этапе исследования необходимо было определить цитотоксичность препарата, т. е. возможность использования препарата без повреждающего действия на клетки и максимально переносимую концентрацию.
Данные представлены в таблице 1. Для адекватной статистической обработки материала на каждую концентрацию препарата отводилось 3–4 лунки, опыты воспроизводились в 3 повторах.

В результате проведенных исследований обнаружено, что препарат МЭВ в концентрации 0,1% оказывает выраженное цитопатическое действие на клетки в первые сутки (нарушение морфологии клетки, снижение жизнеспособности более чем на 90%), а в концентрации 0,001% не оказывает токсического влияния на физиологическое состояние клеток, показатели равнялись контрольным. МЭВ в концентрации 0,01% слаботоксичен, при этом отмечается снижение темпов роста культуры и процента жизнеспособных клеток на 54%. В случае воздействия 1,0 и 0,1% раствором препарата наблюдался выраженный цитотоксический эффект, что отражалось на первые сутки наблюдения статически достоверным снижением как плотности клеточной суспензии, так и жизнеспособности клеток (р <0,0017).
Установлено, что 50% тканевая цитотоксическая доза
ТЦД50/мл составила 0,0055% раствора препарата МЭВ.
В митохондриальном тесте были определены эффективные концентрации препарата, вызывающие 50% ингибирование выживаемости клеток (IC 50). Значения абсорбции представлены в относительных единицах. Для контроля (без препарата, 1% ДМСО) значения линий составляют 0,904±0,05 и 1,03±0,08 (рис. 1).

В дальнейших исследованиях использованы только концентрации препарата МЭВ 0,01–0,00001%, т. к. более высокие концентрации (1,0–0,1%) использовать нецелесообразно, поскольку они оказывалют выраженный цитотоксический эффект на клетки.

Исследование противовирусного действия препарата МЭВ на репродукцию вируса простого герпеса in vitro в культуре клеток

Таблица 1. Характеристика аллергенов, используемых в лабораторной диагностике [3]

где ТЦД50 (тканевая цитотоксическая доза, вызывающая морфологические изменения ткани и снижающая жизнеспособность клеточной культуры на 50%)
составила 0,0055, ТЦИД50 (ИД 50) (тканевая цитотоксическая доза, ингибирующая репродукцию вируса на 50%) составила 0,001.
Если препарат имеет ХТИ8, то препарат обладает сильным противовирусным действием. По данным литературы, также рассматривается снижение титра вируса при действии препарата не менее чем на 1,25–2,0 lgТЦИД50/мл вирусной активности в условиях одноциклового исследования.
По результатам проведенных исследований ХТИ для препарата МЭВ составил 5,5, что свидетельствует о противовирусной активности препарата.

Исследование инфекционной активности ВПГ в иммуноферментном анализе

Таблица 3. Инфекционная активность ВПГ при различных концентрациях препарата

На дальнейшем этапе определения противовирусного действия МЭВ проводили ИФА для оценки активности ВПГ в культуре клеток. Результаты представлены в таблице 3.

В результате исследования было выявлено, что при концентрации препарата 0,001%, внесенного за 1 ч до инфицирования вирусом (в условиях эксперимента), отмечается наиболее значительное снижение инфекционной активности вируса (титр вируса составил 1:300 по сравнению с контролем — 1:656 100).

Заключение

Таким образом, препарат МЭВ оказывает максимальное противовирусное действие против ВПГ в концентрации 0,001% при внесении за 1 ч до появления вируса (профилактическая схема) и менее выраженное противовирусное действие по лечебной схеме (после инфицирования вирусом). ХТИ для препарата МЭВ составил 5,5, что свидетельствует о противовирусной активности препарата. МЭВ является новым перспективным препаратом с механизмом действия, отличным от механизма известных лекарств (препараты ряда ациклогуанозина), в лечение ВПГ-инфекции.
Данные исследования представляют собой начальную фазу наших экспериментов в этом направлении, и уже первые шаги показали перспективность МЭВ как антигерпетического препарата.

Методические указания устанавливают методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа с целью установления их эффективности и безопасности.

3.3.2 . МЕДИЦИНСКИЕ
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Методы определения показателей
качества иммунобиологических
препаратов для профилактики
и диагностики гриппа

Методические указания

1 . Разработаны: Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (Т.А. Бектимиров, Н.И. Лонская, Л.В. Агафонова, Н. Кастрикина, Н.А. Озерецковский, Н.В. Медуницын, А.А. Мовсесянц); Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (Г.Ф. Лазикова).

2 . Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации (протокол № 19 от 19 сентября 2003 г.).

3 . Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28.09.03.

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

28 сентября 2003 г.

Дата введения: с момента утверждения

3.3.2 . МЕДИЦИНСКИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа

Методические указания

Настоящие методические указания устанавливают методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа с целью установления их эффективности и безопасности.

Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и организаций, осуществляющих определение показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа.

Целью введения настоящих методических указаний является регламентация методов определения показателей качества противогриппозных препаратов на их соответствие требованиям нормативных документов.

Методические указания содержат описание общих методов определения показателей качества противогриппозных препаратов. Особенности методов оценки качества противогриппозных препаратов, не охватываемые настоящим документом, описаны в документах на эти препараты.

Задачей проведения контроля является установление эффективности и безопасности противогриппозных препаратов.

3.1 . Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с вирусом гриппа (макрометод)

Реакцию торможения гемагглютинации применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител.

Постановка РТГА включает следующие этапы работы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции.

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

• антиген (вакцина, вируссодержащая жидкость - аллантоисная или культуральная);

• иммунные сыворотки к различным вирусам гриппа;

• буферно-солевой раствор рН 7,2 ± 0,2 (Na -фосфатный буфер 0,01 М с 0,16 M NaCl );

• взвесь куриных эритроцитов, 1 %.

3.1.1 . Приготовление взвеси куриных эритроцитов

Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцовой вены.

Свежеполученную от 3 - 5 петухов кровь помещают во флакон со стеклянными бусами или же с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5 %-ный раствор лимонно-кислого натрия). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона в течение 5 - 7 мин при температуре (20 ± 2) °C до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают буферно-солевым раствором (на 1 объем крови - 4 объема буферно-солевого раствора) путем центрифугирования при (800 ± 200) об/мин в течение (15 ± 5) мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100 %, готовят 1 %-ную суспензию куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования на ФЭК-56.

3.1.2 . Приготовление 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования

Для получения стандартных концентраций эритроцитарных суспензий рекомендуется использовать фотометрический метод, позволяющий определять их концентрацию по величине оптической плотности. Основанием для этого служит наличие линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией эритроцитов в определенном интервале концентраций - от 0,15 до 1,00 %.

Величину оптической плотности для 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов определяют экспериментально, в ряду нескольких (~20) параллельных проб с последующим вычислением среднеарифметической величины, принимаемой за исходный показатель оптической плотности.

3.1.3 . Определение показателя оптической плотности 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов

Для приготовления одной пробы отбирают градуированной пипеткой 0,2 мл осадка эритроцитов в емкость, содержащую 19,8 мл буферно-солевого раствора; содержимое тщательно перемешивают, заполняют им объем прямоугольной кюветы фотоколориметра (толщина слоя = 1 мм) и немедленно измеряют оптическую плотность суспензии при длине волны λ = 540 нм.

В качестве контрольного раствора используют дистиллированную воду, предварительно заполняя ею объем второй такой же кюветы ФЭК.

3.1.4 . Приготовление 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов по показателю оптической плотности

Готовят требуемое количество суспензии куриных эритроцитов несколько большей, чем 1 %-ной концентрации. Добавлением буферно-солевого раствора рН 7,2 ± 0,2 к полученной суспензии и измерением оптической плотности ее на ФЭК доводят концентрацию суспензии до такой, показатель оптической плотности которой равен величине, определенной ранее (п. 3.1.2).

Примечание. Поскольку значение оптической плотности суспензии эритроцитов может изменяться в зависимости от качества эритроцитов (на что влияет сезон года, климатические условия, состояние и возраст животных и т.п.), а также зависит от технических характеристик измерительного прибора (ФЭК), величину оптической плотности 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов следует определять периодически (1 раз в 3 - 4 месяца) и на одном и том же приборе.

3.1.5 . Определение гемагглютинирующего титра антигена

В лунках плексигласовой планшеты готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,4 мл на буферно-солевом растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1 %-ной суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшеты и оставляют при температуре (20 ± 2) °C на 40 - 45 мин (до оседания эритроцитов в контроле, см. ниже).

Реакцию оценивают по четырехкрестовой системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (1 АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (3 или 4 креста).

Определение титра антигена сопровождается отрицательным контролем на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. С этой целью в контрольную лунку той же плексигласовой доски вносят 0,4 мл буферно-солевого раствора и 0,4 мл 1 %-ной суспензии эритроцитов. При отсутствии спонтанной агглютинации на дне лунки выпадает гомогенный с ровными краями осадок эритроцитов (отрицательная реакция).

3.1.6 . Приготовление рабочей дозы антигена

В РТГА рабочей дозой является то разведение антигена, в 0,2 мл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (4 АЕ). Для вычисления ее следует установленную величину титра антигена разделить на 8. Полученная от деления цифра указывает, во сколько раз нужно развести антиген, чтобы в 0,2 мл его содержалось 4 АЕ (рабочая доза).

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (4 АЕ). Для этого в пять лунок горизонтального ряда плексигласовой доски, начиная со второй, вносят по 0,2 мл буферно-солевого раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 0,2 мл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания переносят 0,2 мл смеси из 2-й лунки в 3-ю, из 3-й - в 4-ю, из 4-й - в 5-ю, из 5-й лунки 0,2 мл удаляют. Затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл буферно-солевого раствора и по 0,4 мл 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. В 6-й лунке ставят контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов (см. выше). После встряхивания смесь оставляют при температуре (20 ± 2) °C на 40 - 45 мин (до оседания эритроцитов в контроле).

При правильном выборе рабочей дозы полная (++++) агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в первых трех лунках. В 4-й и 5-й лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного выше разведение антигена должно быть изменено путем добавления соответствующего количества антигена или буферно-солевого раствора для получения необходимой рабочей дозы. При этом необходимо повторно проверить правильность приготовления рабочей дозы.

3.1. 7 . Постановка реакции торможения гемагглютинации

Сыворотки, используемые в РТГА, могут содержать неспецифические ингибиторы гемагглютинации. Поэтому для их удаления перед постановкой РТГА сыворотки необходимо обработать нейраминидазой холерных вибрионов (см. примеч.).

После удаления неспецифических ингибиторов готовят двукратные разведения сывороток в лунках плексигласовой доски, начиная с 1:10 до 1:640 и выше в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл рабочей дозы антигена (4 АЕ). Смесь встряхивают, оставляют при температуре (20 ± 2) °C на 30 мин, затем в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают, оставляют при температуре (20 ± 2) ° C в течение 40 - 45 мин (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции (п. 4.1.6).

При наличии специфических антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр сыворотки принимают предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Задержка гемагглютинации указывает на соответствие типа антигена и взятой сыворотки; отсутствие задержки гемагглютинации свидетельствует о несоответствии типа взятой сыворотки.

Препарат считают специфичным, если он не реагирует в РТГА с гетерологичной сывороткой.

Удаление неспецифических ингибиторов гемагглютинации из иммунных сывороток с помощью нейраминидазы холерных вибрионов.

При наличии инструкции по применению нейраминидазы необходимо следовать требованиям, изложенным в данном документе.

Метод основан на способности нейраминидазы холерных вибрионов, не действуя на специфические антитела, разрушать ингибиторы гемагглютинации к вирусам гриппа A и B в сыворотках крови человека, кур, крыс, кролика.

Содержимое ампулы (1 мл лиофилизированного препарата нейраминидазы холерных вибрионов) растворяют в 1 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Готовят рабочее разведение препарата в буферно-солевом растворе, равное 1:50. В разведенном виде препарат хранят в холодильнике при температуре (4 ± 20) °C не более 3 суток.

К 0,1 мл цельной сыворотки добавляют 0,5 мл нейраминидазы в рабочем разведении 1:50.

Смесь ставят на 18 ч в термостат при (36 ± 0,5) °C.

Смесь прогревают при (56 ± 10) °C в водяной бане в течение 1 ч.

К смеси (сыворотка плюс нейраминидаза) добавляют 0,4 мл буферно-солевого раствора, чтобы получить разведение сыворотки 1:10.

Сыворотка, обработанная нейраминидазой, может быть использована для РТГА в течение 2 недель при условии хранения ее при температуре (5 ± 1) °C.

3.1.8 . Приготовление растворов

Приготовление буферно-солевого раствора рН 7,2 ± 0,2 (0,01 М Na-фосфатный буфер, содержащий 0,15 M NaCl):

• 26,8 г двузамещенного натрия Na 2 HPO 4 · 7 H 2 O растворяют в дистиллированной воде и объем в мерной колбе доводят до 1 л (0,1 М Na 2 HPO 4 );

• 13,8 г однозамещенного натрия NaH 2 PO 4 · Н2О растворяют в дистиллированной воде и объем в мерной колбе доводят до 1 л (0,1 М NaH 2 PO 4 );

• к 720 мл 0,1 М раствора Na 2 HPO 4 добавляют 280 мл 0,1 М раствора NaH 2 PO 4 ; pH такого раствора должен быть равным 7,2 ± 0,05;

• 100 мл полученного 0,1 М Na-фосфатного буфера разбавляют дистиллированной водой до 1 л и добавляют 8,5 г хлористого натрия (NaCl); pH полученного раствора - 7,2 ± 0,05. Если рН выше или ниже требуемого, добавляют 1 N раствор НСl или 1 N раствор NaOH, соответственно.

Приготовление раствора Альсевера

• 0,42 % натрия хлорида;

• 0,8 % натрия цитрата;

• 100,0 мл бидистиллированной воды.

Реакцию среды раствора доводят с помощью 5 %-ной лимонной кислоты до рН от 6,15 до 5,60 (примерно 10 мл кислоты на 1 л раствора). Стерилизуют фильтрацией или автоклавированием в течение 3 последовательных дней при 100 ° C и 0,7 атм. Для консервирования добавляют на 1 мл крови 1,2 мл раствора Альсевера.

В этом виде эритроциты можно хранить при (4 ± 2) °C в течение 1 - 2 недель. Перед употреблением их необходимо трехкратно отмыть буферно-солевым раствором с помощью центрифугирования при (800 ± 200) об./мин в течение 10 мин.

Приготовление консервирующего раствора 5 %-ного натрия цитрата

Перед употреблением 5 %-ный раствор цитрата натрия на дистиллированной воде разводят в 2 раза буферно-солевым раствором и к одной части полученного раствора натрия цитрата добавляют 2 части крови. В этом консерванте эритроциты можно хранить при (4 ± 2) °C в течение 3 - 5 суток.

3.2 . Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с вирусом гриппа (микрометод)

Принцип метода, его учет и ингредиенты для реакции, проводимой микрометодом, те же, что и для проведения РТГА макрометодом. Изменяются только концентрации и объемы ингредиентов.

3.2.1 . Приготовление 0,5 %-ной взвеси эритроцитов петуха

Взвесь готовят из 1 %-ной суспензии эритроцитов (см. макрометод) разведением ее в 2 раза (т.е. в соотношении 1:1) буферно-солевым раствором.

3.2.2 . Определение гемагглютинирующего титра антигена

В каждую лунку микропанели вносят буферно-солевой раствор в объеме 50 мкл. Затем в первую лунку вносят 50 мкл антигена в разведении 1:10 и далее проводят титрование по принципу двукратного разведения. Из последней лунки удаляют 50 мкл. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5 %-ной суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре (20 ± 2) °C на 40 - 45 мин до оседания эритроцитов в контроле (см. ниже).

Реакцию оценивают по четырехкрестовой системе. За титр антигена или одну агглютинирующую единицу (1 АЕ) принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов на 3 или 4 креста.

Определение титра антигена сопровождается постановкой отрицательного контроля на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. В качестве отрицательного контроля служат несколько лунок панели, в которые вместо антигена внесен буферно-солевой раствор.

3.2.3 . Приготовление рабочей дозы антигена

Рабочая доза антигена при постановке РТГА микрометодом равна 8 ГАЕ. Для ее приготовления гемагглютинирующий титр делят на 16. Полученная цифра означает, во сколько раз необходимо развести антиген.

Пример. Титр антигена равен 1:160. Разделив 160 на 16, получаем цифру 10, указывающую, что антиген необходимо развести в 10 раз.

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (8 АЕ). Для этого в шесть лунок микропанели, начиная со второй, вносят по 25 мкл буферно-солевого раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 25 мкл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания смеси 25 мкл ее объема переносят из 2-й лунки в 3-ю, из 3-й - в 4-ю и т.д. Из последней лунки панели 25 мкл удаляют. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл буферно-солевого раствора и по 50 мкл 0,5 %-ной суспензии эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре (20 ± 2) °C на 40 - 45 мин до оседания эритроцитов в контроле.

При правильном выборе рабочей дозы агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в четырех лунках панели. В остальных лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного результата добавляют антиген или буферно-солевой раствор для получения необходимой рабочей дозы.

3.2.4 . Постановка реакции торможения гемагглютинации

Постановка реакции микрометодом соответствует описанному для макрометода, за исключением объемов используемых ингредиентов реакции.

Готовят двукратные разведения сыворотки в объеме 25 мкл, вносят рабочую дозу антигена (8 АЕ) в объеме 25 мкл и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре (20 ± 2) °C в каждую лунку панели вносят по 50 мкл 0,5 %-ной взвеси эритроцитов. После оседания эритроцитов в контроле (как правило, через 40 - 45 мин) проводят учет результатов.

За титр активности принимают разведение сыворотки, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов.

Определение проводят на развивающихся куриных эмбрионах 10 - 12-дневного возраста.

Десятикратные разведения вируса (вакцины) готовят в 4,5 мл буферно-солевого раствора рН от 7,4 до 7,0, меняя при каждом разведении пипетку.

Вводят в аллантоисную полость 0,2 мл вируссодержащей жидкости из разведений от 10 -5 до 10 -7 (разведения могут меняться в зависимости от целей исследования и предполагаемой инфекционной активности вируса), используя на каждое разведение по 4 эмбриона. Для заражения эмбрионов используют разные шприцы или проводят заражение одним шприцем, начиная с большего разведения.

Эмбрионы инкубируют при температуре 35 °C в течение 48 ч для вируса гриппа (вакцины) типа A и 72 ч для вируса гриппа (вакцины) типа В. По истечении срока инкубации отдельно из каждого эмбриона отбирают по 0,4 - 0,5 мл аллантоисной жидкости, которую помещают в 4 отдельные лунки плексигласовой доски. Затем в каждую лунку добавляют по 0,4 - 0,5 мл 1 %-ной суспензии куриных эритроцитов. Через 30 - 40 мин контакта при температуре (20 ± 2) °C, после оседания эритроцитов в контроле, проводят учет гемагглютинации.

Контроль проводят, как описано выше, но вместо аллантоисной жидкости из куриного эмбриона в свободные 4 лунки панели вносят по 0,4 - 0,5 мл буферно-солевого раствора рН 7,2 ± 0,2.

Вычисление биологического титра проводят по методу Рида и Менча.

Метод основан на логической предпосылке, что тканевая культура или животное, погибшие при заражении их каким-либо разведением вируса, погибнут и при заражении любым более низким разведением.

Целью исследования была оценка противовирусной активности метилглюкаминовой соли акридонуксусной кислоты (препарат циклоферон) в отношении вирусов гриппа A/Swine/1976/31 (H1N1) в опытах in vivo.

В работе использовали препарат циклоферон в виде 12,5% водного раствора. Тамифлю (Этил (3R,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоксилат фосфат, Hoffmann LaRoche, Швейцария).

Экспериментальная гриппозная инфекция

Для заражения животных была использована вируссодержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционная активность вируса в заражающем материале была определена в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (Am.J.Hyg.,1938,27:493-497).

Исследуемые препараты вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл в следующих дозах: циклоферон - 120 мг/кг, ремантадин - 50 мг/кг, тамифлю — 20 мг/кг веса животных. Препараты вводили по лечебно-профилактической схеме: за 24 часа и 1 час до заражения и через 24, 48 и 72 часа после заражения. В качестве плацебо контрольной группе животных вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы.

Вирусы вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 1 LD50. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней, т.е. срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных. Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании смертности животных в группах рассчитывали процент летальности, индекс защиты (IP, отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (из расчета 14 дней наблюдения).

В группе животных (n=10), получавших циклоферон, погибло 4 (40%), осталось в живых -6 (60%) особей. Средняя продолжительность их жизни составила 12.1 суток, индекс защиты- 30%. В группе животных (n=10), получавших тамифлю, погибло 3 (30%), осталось в живых 7 особей. Средняя продолжительность их жизни составила 12.2 суток, индекс защиты 47.5%. В контрольной группе мышей (n=14) погибло 8 особей, в живых осталось 6, смертность составила 57.1%. Средняя продолжительность их жизни составила 10.3 суток.

В группе животных (n=10), получавших ремантадин, погибло 2 особи (20%), осталось в живых 8 животных, средняя продолжительность жизни составила 13.4 суток, индекс защиты 65%.

Таким образом, по показателю средняя продолжительность жизни животных, циклоферон не уступает тамифлю (соответственно 12.1 и 12.2 суток). По показателю летальность (соответственно 40 и 30%) циклоферон незначительно (1 особь) уступает тамифлю. Индекс защиты на тамифлю составил 47.5, а на циклофероне - 30.0%, уступая тамифлю на 17.5%. Индекс защиты ремантадина против устойчивого вируса A/PR/8/34 составил 15-23%, тогда как циклоферона - 35-41%.

С учетом полученных экспериментальных данных целесообразно, с целью экстренной профилактики гриппа А рекомендовать прием указанных препаратов, а при тяжелом течении вирусной инфекции, рекомендовать комбинированный прием циклоферона и тамифлю в дозах, указанных в инструкции по их медицинскому применению.

2.2. Вирусы. В работе были использованы адаптированные к мышам вирусы гриппа следующих штаммов:
- A/Swine/1976/31 (H1N1) - свиного происхождения
- A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) - птичьего происхождения
- A/Aichi/2/68 (H3N2) - человеческого происхождения (ремантадин-чувствительный)
- A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) - человеческого происхождения (ремантадин-устойчивый)
- А/Владивосток/2/09 (H1N1) - человеческого происхождения (Тамифлю-устойчивый).

Вирусы пассировали в аллантоисной полости 10-12 дневных куриных эмбрионов в течение 48 часов при 36 ° С.

2.4. Экспериментальная гриппозная инфекция.

Для заражения животных была использована вируссодержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционная активность вируса в заражающем материале была определена в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (Am.J.Hyg.,1938,27:493-497).

Исследуемые препараты вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл в следующих дозах: Циклоферон - 120 мг/кг, Ремантадин - 50 мг/кг, Тамифлю - 20 мг/кг веса животных. Препараты вводили по лечебно-профилактической схеме: за 24 часа и 1 час до заражения и через 24, 48 и 72 часа после заражения. В качестве плацебо контрольной группе животных вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы.

Вирусы вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 1 и 5 LD50. В каждую группу наблюдения брали по 25 мышей. На 3 день после заражения 10 животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Из этих 10 легких 5 использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при -20 ° С до постановки соответствующих экспериментов), оставшиеся 5 фиксировали 10% забуференным формалином и использовали для гистологического анализа (см. ниже).

Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в течение 14 дней, т.е. срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных. Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (M, отношение числа павших за 14 дней животных к общему числу зараженных животных в группе), индекс защиты (IP, отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (DL) из расчета 14 дней наблюдения в соответствии со следующими формулами:

DL=(&Sigma N D)/Nt, где N - количество животных, проживших D дней, Nt - общее число животных в группе;
M=M/Nt, где М - число животных в группе, павших в течение 14 дней после заражения,
IP=((Mc-Me)/Mc)?100% где Mc и Me - смертность в процентах в контрольной и опытной группах соответственно.

2.5. Титрование вируса в легочной ткани.

Для определения инфекционного титра вируса гриппа в легочной ткани животных легкие мышей, извлеченные на 3 сутки после инфицирования гомогенизировали в десятикратном объеме стерильного физиологического фосфатного буфера и готовили из гомогенатов серию десятикратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK, выращенных на 96 луночных панелях на среде МЕМ. Клетки заражали серийными десятикратными разведениями легочного гомогената от 10 0 до 10 -6 и инкубировали в термостате в течение 48 часов. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов физиологическом растворе.

Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации и выражали в логарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозы вируса (lg ЭИД50).

2.6. Гистологический анализ. Для морфологического исследования легкие фиксировали 10 % формалином, заливали в парафин и готовили из полученных блоков срезы толщиной 4 мкм. Срезы освобождали от парафина ксилолом, регидратировали в этаноле убывающей концентрации, окрашивали гематоксилин- эозином и заключали в бальзам. Препараты исследовали под световым микроскопом. Оценивали интенсивность и клеточный состав воспалительного инфильтрата в очагах пневмонии, а также степень дегенеративных и пролиферативных процессов в ткани легких.

2.7. Электронно-микроскопические исследования. Клетки MDCK, выращенные в 24-луночных планшетах, обрабатывали Циклофероном за 1 час до заражения вирусом гриппа A/swine/1976/31 (H1N1) в дозе 10 4 CTD50/0,2 mL. Через 8 и 24 часа после заражения контрольные и опытные клетки культуры фиксировали 1,5% раствором глутаральдегида на среде DMEM (рН 7,2), центрифугировали 20 мин при 2000 об./мин и фиксировали 2,5% раствором OsO4Клетки обезвоживали ацетоном в возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон/аралдит. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Japan) при инструментальном увеличении 5000 - 50000. Фотосъемку производили на пленку ФТ-41МД.

Исследование клеточного состава и морфологии вирионов гриппа в бронхолегочных смывах животных. Для изучения влияния Циклоферона на морфогенез гриппозной инфекции in vivo животных инфицировали вирусом гриппа A/swine/1976/31 (H1N1) в дозе 10-100 LD50. Животным опытной группы дважды в сутки по лечебно- профилактической схеме (см. выше) вводили Циклоферон из расчета 120 мг/кг/сут. Животные контрольной группы получали инъекции физиологического раствора. На 3 сутки после инфицирования животных забивали и готовили бронхолегочные смывы, вводя через трахею 1 мл физиологического фосфатного буфера. Клеточную фракцию осаждали центрифугированием 15 мин при 2500 об./мин, ресуспендировали в 100 мкл физиологического раствора и наносили в виде мазка на предметные стекла. Мазки окрашивали краской Гимза и исследовали под световым микроскопом.

Вирус гриппа из надосадка бронхолегочных смывов концентрировали при помощи ультрацентрифугирования при 20 000 об./мин в течение 1 часа в роторе SW.50-1 (Beckman), ресуспендировали в 50 мкл физиологического раствора, сорбировали на Медную сетку с углеродной подложкой в течение 15-20 сек, затем подложку отмывали дистиллированной водой и контрастировали 1,5% раствором натриевой соли фосфовольфрамовой кислоты (ФВК) (рН 7,1). Препарат высушивали при комнатной температуре и исследовали с помощью электронного микроскопа JEM-100S (JEOL, Япония).

Профессор Л.В. Колобухина, профессор Н.А. Малышев, к.м.н. Л.Н. Меркулова, д.м.н.Е.И. Бурцева, М.Ю. Щелканов
ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва ИКБ № 1 г. Москвы

Грипп относится к группе острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), которые занимают первое место в мире по частоте и количеству случаев и составляют 95% всех инфекционных заболеваний. В России ежегодно выявляют от 27,3 до 41,2 млн. пациентов, заболевших гриппом и другими ОРВИ.

Возбудители гриппа относятся к семейству ортомиксовирусов и включают 3 вида вирусов гриппа: А, В, С (в зависимости от антигенной характеристики внутреннего нуклеопротеида). Вирусы гриппа А являются наиболее частой причиной возникновения эпидемий и пандемий. Вспышки гриппа (А и В) происходят ежегодно в зимние месяцы и продолжаются около 6-8 недель. По данным ВОЗ, эпидемии гриппа ежегодно уносят жизни 250-500 тыс. человек.

Основными составляющими терапии гриппозной инфекции являются этиотропные (специфические противовирусные) препараты, иммуномодулирующие препараты (обладающие неспецифическим противовирусным действием), патогенетическая и симптоматическая терапия, направленная на облегчение симптомов заболевания.

Актуальность поиска новых эффективных противовирусных препаратов обусловила создание нового противовирусного препарата Ингавирин ® (2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-1,5 кислоты), представляющего собой низкомолекулярный псевдопептид, аналог эндогенного псевдопептида, выделенного из тканей морского моллюска Aplysia californica.

В 2008 г. в период эпидемического подъема заболеваемости гриппом в Москве в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН проведено рандомизированное простое слепое плацебо-контролируемое сравнительное исследование препарата Ингавирин ® и арбидол при лечении больных гриппом. Цель исследования заключалась в оценке терапевтической эффективности и безопасности Ингавирина ® в сравнении с арбидолом при лечении гриппа у взрослых.

Пациенты были разделены на три группы: 33 пациента (1-я группа) получали Ингавирин ® в дозе 90 мг (1 капсула) в сутки, 39 пациентов (2-я группа) принимали плацебо, имитирующее Ингавирин ® - по 1 капсуле в сутки, 33 пациента (3-я группа) - арбидол по 200 мг 4 раза в сутки. Курс терапии составил 5 дней.

Средняя продолжительность заболевания до начала лечения, частота клинических симптомов, в том числе подъема температуры, на момент включения в исследование во всех группах были сопоставимы (табл. 1).

Таблица 1.

Демографическая и клиническая характеристика больных гриппом в исследуемых группах

* Число пациентов, включенных в анализ клинической эффективности проводившейся терапии (у 5 из 100 пациентов во время лечения возникли осложнения гриппа, и у них не проводился анализ продолжительности основных симптомов болезни)

Все пациенты по показаниям получали симптоматическую терапию, включавшую назальные капли, противокашлевые средства. Препараты, обладающие жаропонижающим действием, назначали только при температуре выше 39°С, как правило, однократно. Для этого использовали парацетамол или диклофенак.

Критериями эффективности проводившейся терапии являлись:
1. Сроки нормализации температуры тела.
2. Сроки исчезновения основных симптомов интоксикации (головной боли, головокружения, слабости).
3. Сроки обратного развития катаральных симптомов.
4. Сроки элиминации вируса со слизистой оболочки носа
5. Динамика инфекционного титра штаммов, выделенных от больных в процессе лечения.

Дополнительным критерием эффективности являлась частота возникновения осложнений гриппа на фоне различных видов терапии.

Помимо ежедневного клинического наблюдения за пациентами, включавшего врачебный осмотр, двухразовую термометрию, регистрацию жалоб, динамику симптомов и лабораторных тестов, в динамике лечения осуществлялась изоляция вируса из назальных смывов больных (ежедневно, в течение 5 дней терапии) с использованием перевиваемой клеточной линии почки собаки (MDCK - Madin-Darby canine kidney) по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ [1,2]. Идентификацию вирусных штаммов осуществляли с помощью РТГА [3]. Расчет инфекционных титров проводили по методу Рида и Менча [4]. Достоверным считали различие инфекционных титров не менее, чем на 2 lg (ТСID50/мл).

Статистический анализ
Значения измеряемых случайных величин представляли в виде: М±m, где М - среднее значение, m - математическое ожидание дисперсии. Для проверки достоверности различий случайных величин использовали непараметрические критерии Манна-Уитни и Уилкоксона. Сравнение частотных характеристик проводили с использованием статистики χ 2 с поправкой Йетса. Различие между параметрами считалось статистически достоверным при р

Результаты изучения эффективности

В исследовании участвовало 105 больных гриппом, однако в анализ клинической эффективности проводившейся терапии (время нормализации температуры и исчезновения/уменьшения симптомов интоксикации, сроки обратного развития катаральных симптомов) было включено только 100 пациентов, т.к. у 5 больных во время лечения возникли осложнения гриппа, и у них не проводился анализ продолжительности основных симптомов болезни.

Сроки нормализации температуры тела
Анализ сроков нормализации температуры в сравниваемых группах показал, что через 1,0-1,5 сутки температура тела снизилась до нормальной у 5,6% больных, принимавших плацебо, у 35,5% пациентов, принимавших арбидол, и у 66,7% пациентов, принимавших Ингавирин ® (рис. 1, табл. 2). При этом достоверные различия наблюдались как между группами пациентов, принимавших Ингавирин ® и плацебо, так и между группами Ингавирина ® и арбидола, что свидетельствует о большей эффективности Ингавирина ® .

Рис. 1. Сроки нормализации температуры тела у больных гриппом на фоне различных видов терапии

Таблица 2.

Сроки нормализации температуры на фоне различных видов терапии

Срок нормализации температуры, сутки Вид лечения Достоверность различий
Ингавирин ® плацебо арбидол
n%n%n%P1*р2**
1-1,52266,725,61135,5
21030,3925,0825,8--
313,01336,11032,2
4--925,026,5--
5--38,3----
Всего:331003610031100

* р1 - достоверность различий между группой Ингавирина ® и плацебо; ** р2 - достоверность различий между группой Ингавирина ® и арбидола

У всех пациентов, принимавших Ингавирин ® , отмечена нормализация температуры в течение 3-х суток, в то время как в группе пациентов, получавших плацебо, у 25% пациентов нормализация температуры наблюдалась лишь на 4-е сутки, у 8,3% - на 5-е, а в группе арбидола нормализация температуры у всех пациентов произошла лишь на 4-е сутки.

Терапевтический эффект Ингавирина ® в виде снижения температуры становился явным примерно после 2 дней терапии, что подтверждается достоверным снижением средней максимальной температуры через 24 ч и 48 ч лечения Ингавирином ® , по сравнению с пациентами, принимавшими плацебо, у которых повышенная температура тела наблюдалась и через 48 часа и через 72 часа после начала терапии. Среди пациентов, принимавших Ингавирин ® , динамика изменения температуры была сходной с наблюдавшейся среди пациентов, принимавших арбидол (табл. 3, рис. 2).

Рис. 2. Средняя максимальная температура у больных гриппом в динамике лечения

Таблица 3.

Значения средней максимальной температуры (°С) на фоне различных видов терапии (М±m)

Время Вид лечения Достоверность различий
Ингавирин ® (n=33)плацебо (n=36) арбидол (n=31)P1*р2**
До лечения39,1±0,139,3±0,138,9±0,1--
24 ч37,8±0,138,6±0,137,9±0,2-
48 ч37,2±0,138,0±0,137,3±0,1-
72 ч36,7±0,137,4±0,136,9±0,1-

* р1 - достоверность различий между группой Ингавирина ® и плацебо; ** р2 - достоверность различий между группой Ингавирина ® и арбидола

Сроки исчезновения симптомов интоксикации
Средняя продолжительность лихорадки была достоверно меньше в группе пациентов, принимавших Ингавирин ® (34,5 ч), по сравнению с пациентами, получавшими плацебо (72,0 ч) и арбидол (48,4 ч), что свидетельствует о большей эффективности Ингавирина ® по сравнению с арбидолом. Средняя продолжительность симптомов интоксикации (головной боли, головокружения и слабости) была достоверно меньше в группе пациентов, принимавших Ингавирин ® , по сравнению с пациентами, получавшими плацебо (табл. 4). В целом, динамика симптомов была сходной при терапии Ингавирином ® и арбидолом, однако в группе пациентов, принимавших Ингавирин ® , наблюдалось несколько более быстрое регрессирование головокружения, головной боли и слабости, чем в группе пациентов, принимавших арбидол.

Таблица 4.

Продолжительность основных симптомов интоксикации на фоне различных видов терапии (М±m)

Продолжительность симптома Вид лечения Достоверность различий
Ингавирин ® (n=33)плацебо (n=36) арбидол (n=31)P1*Р2**
Лихорадка, часы34,5±2,572,0±3,948,4±3,7
Головная боль, сутки2,1 ±0,23,1 ±0,32,3±0,2-
Головокружение, сутки1,7±0,22,4±0,22,2±0,2-
Слабость, сутки3,3±0,24,9±0,23,4±0,2-

* р1 - достоверность различий между группой Ингавирина ® и плацебо; ** р2 - достоверность различий между группой Ингавирина ® и арбидола

Сроки обратного развития катаральных симптомов
Анализ влияния проводившейся терапии на сроки обратного развития симптомов поражения верхних дыхательных путей показал, что на фоне приема Ингавирина ® , арбидола и плацебо через 2 дня после начала терапии отсутствие кашля отмечено у 35,5, 33,3 и 15,2% пациентов, соответственно (табл. 5, рис. 3). Продолжительность кашля до 5-6 суток терапии наблюдалась у 7 пациентов (22,6%), принимавших Ингавирин ® , у 8 (26,7%) и 15 (48,4%) пациентов, принимавших арбидол и плацебо соответственно. Отмечено статистически достоверное более быстрое исчезновение кашля у пациентов в группе Ингавирина ® , по сравнению с плацебо.

Рис. 3. Продолжительность катаральных симптомов у больных гриппом на фоне различных видов терапии

Таблица 5.

Сроки исчезновения катаральных симптомов у больных гриппом на фоне различных видов терапии

Время исчезновения симптома, сутки Вид лечения Достоверность различий
Ингавирин ® плацебо арбидол
n%n%n%Р1*р2**
Кашель
1-21135,5515,21033,3-
3-41341,91236,41240,0--
5-6722,61236,4826,7-
7-8 412,0 --
Итого:311003310030100
Ринит
1-21134,4926,51136,7-
3-41443,81338,21343,3-
5-6721,81029,4620,0-
7-8 25,9 --
Итого:321003410030100
Трахеит
1314,3215,4315,0--
2942,9215,4630,0
3419,0646,1945,0
4419,0215,415,0-
514,817,715,0--
Итого:211001310020100

* р1 - достоверность различий между группой Ингавирина ® и плацебо; ** р2 - достоверность различий между группой Ингавирина ® и арбидола

Симптомы ринита у пациентов на фоне терапии Ингавирином ® исчезали достоверно быстрее, чем в группе плацебо. При этом сроки исчезновения симптомов на фоне терапии Ингавирином ® и арбидолом были сопоставимы.

Продолжительность трахеита коррелировала со сроками исчезновения кашля: через 1-2 дня терапии симптомы трахеита отсутствовали у 57,2, 45,0 и 30,8% пациентов, принимавших Ингавирин ® , арбидол и плацебо соответственно. Таким образом, явления трахеита были менее выраженными при терапии Ингавирином ® , чем при приеме арбидола и плацебо.

Сроки элиминации вируса со слизистой оболочки носа и динамика инфекционного титра штаммов, выделенных от больных в процессе лечения
Одиннадцати пациентам, у которых исходно был изолирован вирус гриппа, проводился анализ динамики элиминации вируса в течение 5 дней приема Ингавирина ® . Через 24 ч после начала приема препарата у 4 из 11 пациентов (36,4%) не удалось изолировать вирус из назальных смывов. Элиминация вируса в те же сроки у больных в группе плацебо отмечена у 1 из 8 больных (12,5%). Кроме того, в группе плацебо отмечено статистически достоверное (на 2lg (ТСID50/мл) и более) увеличение инфекционных титров в динамике лечения. Полученные результаты вирусологического исследования свидетельствуют о противовирусном действии Ингавирина ® .

Оценка безопасности препарата с помощью лабораторных методов не выявила влияния Ингавирина ® на функцию сердечно-сосудистой системы, печени, почек, систему гемопоэза.

Заключение
Проведенное исследование клинической эффективности Ингавирина ® показало, что применение исследуемого препарата в ранние сроки гриппозной инфекции (первые 24-36 ч) приводит к статистически достоверному уменьшению продолжительности лихорадочного периода и снижению выраженности симптомов интоксикации, по сравнению с плацебо.

На фоне терапии Ингавирином ® в дозе 90 мг 1 раз в сутки наблюдается достоверное (по сравнению с плацебо) снижение выраженности симптомов поражения верхних дыхательных путей, а также их продолжительности.

Следует отметить отсутствие развития бактериальных осложнений гриппозной инфекции среди пациентов, принимавших Ингавирин ® , в то время как в группе плацебо и арбидола у 7,7 и 6,1% пациентов соответственно отмечено возникновение вторичных бактериальных осложнений гриппа, требующих лечения антибиотиками.

Полученные результаты отражают клинически достоверное снижение тяжести заболевания на фоне терапии Ингавирином ® , что подтверждается данными вирусологических исследований о снижении инфекционных титров в процессе лечения Ингавирином ® .

Сравнительный анализ результатов лечения Ингавирином ® и арбидолом показывает, что их эффективность при гриппе в целом сопоставима, однако отсутствие осложнений в группе Ингавирина ® , а также меньшая продолжительность таких значимых симптомов как лихорадка, головокружение, слабость, кашель могут свидетельствовать о лучшем лечебном эффекте Ингавирина ® .

Отмечена хорошая переносимость и безопасность Ингавирина ® . Проведенный комплекс лабораторных исследований позволяет сделать заключение о том, прием Ингавирина ® в дозе 90 мг/сут. в течение 5 сут. (курсовая доза 450 мг) не оказывает влияния на функцию печени и почек, не вызывает изменений в составе крови.

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что Ингавирин ® является эффективным лекарственным препаратом при лечении гриппа у взрослых.

1. Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация: методические рекомендации. - СПб., 2006. - 24 с.
2. Бутенко А.М., Дерябин П.Г. Индикация, изоляция и идентификация вирусов // В кн.: Медицинская вирусология. Руководство/Ред.: академик РАМН Д.К. Львов. - М.: МИА 2008. - С. 301-303.
3. Дерябин П.Г., Бутенко AM., БурцеваЕ.И. Реакция гемагглютинации и реакции торможения гемагглютинации // В кн.: Медицинская вирусология. Руководство / Ред.: академик РАМН Д/К. Львов. - М.: МИА, 2008. - С. 312-317.
4. Reed L., Muench Н. A simple method of estimating 50 % endpoints //Amer. J. Hygiene. - 1938. - V. 27. - P. 493-497.
5. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. - М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.

Читайте также: