Титр вируса в ветеринарии

Обновлено: 24.04.2024

Добрый день!
Помогите пожалуйста.
У меня вот какая история: В апреле 2014 года в моем доме появился котенок мейн-куна. Дома уже была старшая кошка. Через несколько дней после появления котенка у нас дома, котенок стал поносить. Стали разбираться сдавали анализы. Пока сдавали анализы у старшей кошки тоже начался понос и в кале появились капельки крови. Сдали анализ на Коронавирус - положительно.Врач нам назначила лечение:
Сумамед суспензия 100 мг/5 мл по 1 мл 1 раз в день 5 дней (МЕД)
Форвет по 0,5 мл подкожно 1 разв день 5 дней (ВЕТ)
После проведенного лечения результаты анализов были такие:
Старшая кошка - Титр Ig G к коронавирусной инфекции кошек - 1:10
Младшая кошка - Титр Ig G к коронавирусной инфекции кошек - 1:20-80
Продолжали постоянно контролировать состояние животных
У младшей кошки анализ был все время: 1:20-80
В конце октября после очередного анализа врач посоветовала нам лекарство:
Фоспренил - по 1 мл подкожно 1 раз в день 2 недели.
После проведенного лечения младшей кошки, сдали повторный анализ и результат оказался:
Титр Ig G к коронавирусной инфекции кошек 1:160-320
ПЦР Коронавирусный гастроэнтерит - положительно.
У кошки начался понос.
Врач нам назначила: бисептол 120 мг по 1 таблетке 2 раза в день
Весь этот период кошка ведет себя активно. Кушает Играет.
В настоящий момент мы изолировали младшую кошку от старшей.
Прошу Вас помочь нам в назначении лечения. Есть ли препараты способные
стабилизировать состояние кошки.
Слышала, что есть лекарство - virbagen omega - на сколько оно эффективно?

Здравствуйте! вирбаген-идеальный вариант,но, насколько знаю, в России он не продается. Правильно, что разделили животных, жаль, что не соблюдали карантин сразу. Старшую можно лечить симптоматически, а младшей нужно заниматься серьезно, есть риск перехода короны в ФИП. Советую быть осторожнее с иммуномодуляторами, многие из них провоцируют мутацию вируса. Оптимально-ронколейкин и полиферрин. Ждите консультации специалиста. Я не врач.

Коронавирусная инфекция - хроническое заболевание. Лечение в основном симптоматическое, направленное на поддержание и улучшение качества жизни животного. Нужен очный осмотр питомца, для того чтобы назначить лечение. Вы можете подойти к нам в период с 12.00 до 18.00 на бесплатный прием.

Инфекционный перитонит кошек (ИПК, Feline infectious peritonitis, FIP) ― тяжелое заболевание животных семейства кошачьих, приводящее к летальному исходу. Возбудитель ИПК входит в состав группы таксономически близких коронавирусов, включающую вирус энтерита кошек (ЭК), трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) и коронавирус собак (CCV). Имеются данные, что вирус ИПК образуется в результате мутации авирулентного кишечного вируса ЭК. При этом вирус приобретает вирулентность, способность поражать моноциты и макрофаги и вызывать тяжелый перитонит. Сложность серологической диагностики ИПК связана с высоким антигенным сходством коронавирусов, в частности вирусов ЭК и ИПК и, соответственно, практически идентичным спектром генерируемых антител. Цель работы заключалась в определении диагностической ценности детекции антикоронавирусных антител методами иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблоттинга.

Объектом исследования являлись сыворотки крови от здоровых кошек, от подозрительных по заболеванию и клинически больных животных. Сыворотки получали из ветеринарных клиник, а также частных питомников и приютов. Диагноз подтверждали клиническими или патолого-анатомическими исследованиями.

В первую очередь была сконструирована тест-система для определения антител к коронавирусу в формате непрямого ИФА. В качестве антигенов использовали очищенные в градиенте плотности сахарозы вирусы ИПК и ТГС. Показана 100% корреляция иммунохимической специфичности антител сероположительных сывороток кошек к вирусам ИПК и ТГС. В связи с этим, далее в качестве антигена использовали вирус ТГС, культивирование которого хорошо отлажено в нашей лаборатории. Опосредованную сорбцию вирусных антигенов на планшет осуществляли с помощью специфических моноклональных антител к вирусу ТГС. После инкубации с исследуемыми сыворотками, вирус-специфические сывороточные антитела детектировали с помощью специально полученных поликлональных антител к IgG кошки, конъюгированных с пероксидазой хрена.

На первом этапе исследования проводили скрининговое исследование сывороток крови в одном разведении (1/200) для выявления животных с антителами к коронавирусу с помощью разработанного иммуноферментного метода. Затем отобранные положительные сыворотки титровали с разведениями от 1/200 до 1/25600.

При исследовании в таком алгоритме (первичный скрининг с последующим титрованием) 131 сыворотки кошек индивидуального содержания (пациенты ветеринарных клиник) выявлены следующие закономерности (Таблица 1).

Таблица 1
Результаты определения титров антител к коронавирусу в сыворотках крови кошек

У здоровых животных титр антител в ИФА не превышал значения 1:400 (46% животных). Часть животных (23%) без клинических признаков заболевания имела титр антител от 1:800 до 1:1600, что может свидетельствовать об инфицированности как вирусом ИПК, так и вирусом ЭК. Высокие ( ≥ 1:3200) титры антител к коронавирусу, определяемые методом ИФА, выявлены только у животных с клиническими признаками ИПК (29% животных). Следует отметить, что у 2% животных, уровни определяемых в ИФА антител были достаточно низкими (≤ 1:400), однако наблюдалась проявление клинической картины ИПК. Такой эффект может быть связан с наличием в организме большого количества вируса, который блокирует антитела и препятствует связыванию антител с вирусным антигеном, сорбированным на планшете.

Т.е., при скученном содержании животных, по-видимому, имеет место латентное вирусоносительство из-за которого общий уровень антител выше, чем у животных при индивидуальном содержании.

Из полученных данных следует, что более важным прогностическим и диагностическим показателем является не сам факт наличия антител к коронавирусу, а их высокие титры с тенденцией быстрого увеличения, что прямо коррелирует с тяжестью клинического проявления болезни.

Мы исследовали также возможность использования метода иммуноблоттинга в качестве подтверждающего метода для диагностики ИПК. Показано, что в сыворотках крови с низким титром вирус-специфических антител (≤ 1:400) в ИФА, методом иммуноблоттинга выявлялся только один белок N вируса ТГС, однако по мере повышения титров антикоронавирусных антител увеличивался и спектр детектируемых вирусных антигенов.

Сыворотки крови с высокими титрами антител (≥ 1:3200) детектировали все основные структурные белки коронавирусов (N, S, M) (Рис.1).

Рис. 1. Иммуноблоттинг для выявления антител к коронавирусу.
А – окраска суммарных белков в геле Кумасси G-250: 1 – маркеры молекулярной массы 200, 150, 120, 100, 85, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 кД, 2 – вирус ТГС, стрелками отмечено положение основных белков вируса ТГС;
Б – обработка вирусных антигенов после электропереноса на ПВДФ мембрану сыворотками крови кошек: 3 – сыворотка крови клинически здоровой кошки, 4…13 – сыворотки крови, положительные в ИФА, титр 1:200 (4, 5), титр 1:400 (6, 7), титр 1:800 (8), титр 1:1600 (9), титр 1:3200 (10, 11), титр 1:6400 (12, 13).

Таким образом, при сопоставлении результатов иммуноблоттинга и ИФА с анамнезом и патоморфологической картиной можно заключить, что изменение специфичности сыворотки крови по отношению к основным структурным белкам коронавируса имеет важное значение при постановке диагноза ИПК. Так, при выявлении антител к высокомолекулярным белкам (М.м. > 85 кД) коронавируса и прежде всего к S- белку в сыворотке крови кошек, диагноз на ИПК можно считать подтвержденным. Детекция одного N-белка (М.м. 45 кД) коронавируса в иммуноблоттинге не позволяет поставить диагноз на ИПК и его можно считать отрицательным.

Однако наличие антител к N-белку совместно с антителами к другим низкомолекулярным белкам (М.м. < 45 кД) может свидетельствовать о возможном инфицировании животного и в этом случае, как и в случае ИФА, анализ следует повторить через 1-2 недели.
Показано также, что у животных с высокими титрами антител (≥ 1:3200), достоверно повышен уровень суммарного белка в крови и снижено соотношение альбумин/глобулин (Рис.2). Изменения уровней билирубина и альбумина не выявлено.

Рис.2. Изменение уровня общего белка в крови (А) и соотношения альбумин/глобулин (Б) у кошек с различными титрами антител к коронавирусу

Заключение. Разработанная иммуноферментная тест-система для определения антител к коронавирусу методом непрямого ИФА может быть использована в практической ветеринарии для диагностики ИПК. Диагностическое значение иммуноферментного метода определения антикоронавирусных антител было определено при исследовании сывороток крови кошек с подозрением на ИПК и животных с подтвержденным диагнозом ИПК. Для правильной интерпретации результатов ИФА обязательно определение титров антикоронавирусных антител. Высокие титры антител считаются типичными для генерализованной инфекции и в сочетании с клиническими симптомами ИПК могут быть важным прогностическим показателем. Титр антител в ИФА выше, чем 1/3200 является диагностическим титром.

Предложенный метод иммуноблоттинга может быть эффективно использован в качестве подтверждающего теста для диагностики ИПК. При наличии в сыворотке антител к S – белку коронавируса диагноз на ИПК можно считать подтвержденным.

Показана также корреляция между уровнем антикоронавирусных антител, уровнем общего белка в и соотношения альбумин/глобулин.

Бешенство – инфекционное заболевание всех млекопитающих, вызываемое вирусом из семейства Rhabdoviridae. Данный вирус не просто опасен, а смертелен для человека. Вирус передаётся через слюну заражённого животного. После укуса вирус со слюной попадает в мышцы, затем мигрирует по периферическим нервам в центральную нервную систему, где происходит его репликация. Позже по нервным путям вирус бешенства проникает в слюнные и серозные железы, поражает кожу и сердце.

Инкубационный период бешенства составляет примерно 4-6 недель, но может длиться в редких случаях до одного года. Данная болезнь может проявляться в буйной, энцефалитной (с воспалением головного мозга), паралитической и тихой форме. Вначале у животного возникает лихорадка, нервозность, затем возможно нападение, изменение голоса, ненормальное поведение, параличи, расстройство глотания, которое приводит к боязни воды, слюнотечение, расстройства зрения. Бешенство может протекать и в тихой форме, когда животное становится слишком ласковым, но, в то же время, может укусить.

Диагностика.
Диагноз ставят только уже после смерти животного, так как пожизненное определение недостоверно. При этом определяется вирусный антиген в свежезамороженном мозге методом иммунофлюоресценции.

Чума плотоядных.

Чума плотоядных - это инфекционное заболевание собак, возбудителем которого является вирус рода Morbilliviridae. В окружающую среду вирус попадает вместе с истечениями из носа, глаз, со слюной, калом, мочой и кожным эпителием. Вирус чумы является пантропным вирусом, то есть способен поражать клетки всех систем организма.

Инкубационный период вируса чумы плотоядных может длиться от 3-х до 21 дней. Клиническими признаками нервной формы являются: эпилептические припадки, парезы, параличи конечностей, тонус мышц, отсутствие реакции зрачка глаза на свет. Но чаще данная инфекционная болезнь протекает в нескольких формах, то есть кроме нервных расстройств у собаки наблюдается диарея, гнойные истечения из глаз и носа, рвота.

Диагностика.
При исследовании ОКА крови обнаруживают лейкопению.
Для диагностики чумы используют серологические тесты: ИФ (иммунофлюоресценция), РН (реакция нейтрализации), РДП (реакция диффузной преципитации), РСК (реакция связывания комплемента), РНГА (реакция непрямой гемагглютинации), РПГА (реакция пассивной гемагглютинации). Также для диагностики используют биопробу на восприимчивость и ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Болезнь Ауески (псевдобешенство).

Это инфекция коры головного мозга, вызванная вирусом Herpes suis, поражающая ядра мозговых нервов и нередко приводящая и летальному исходу. Собаки и кошки имеют риск заразиться данной инфекцией как при поедании мяса заражённых свиней, так и при контакте со свиньями (даже здоровыми).
После перорального поступления вируса в слизистую оболочку рта он начинает активно развиваться в лимфатических тканях глоточного кольца. Из миндалин и слизистой оболочки пасти вирус распространяется уже по нервным путям черепно-мозговых нервов по направлению к клеткам ствола головного мозга. При этом из-за репликации вируса возникают множественные дегеративные изменения нервов организма.

Инкубационный период псевдобешенства длиться от 2-х до 9 дней, при этом отсутствуют данные о заражении от собаки к собаке. Вначале у животного наблюдается беспокойство или апатия, измождённость. Затем появляется анорексия, рвота, тахипное, странная вокализация, сильное слюноотделение и признаки, в общем напоминающие бешенство. Вследствие укусов и расчёсов у животных появляются самоповреждения, а через 24-48 часов наступает помрачения сознания, судороги, параличи и смерть.

Диагностика.
Для лабораторной диагностики применяют методы ИФ, РДП, РН, РСК, биопробу.

Панлейкопения (чумка) кошек.

Возбудитель панлейкопении – вирус Panleukopenia feline из семейства парвовирусов. Источником заражения являются больные и переболевшие кошки, выделяющие вирусные частицы в окружающую среду вместе с фекальными и рвотными массами.
Инкубационный период составляет от 2-х до 12-ти дней.
Расстройства нервной системы при панлейкопении скорее связаны с последствиями самой болезни, а не патогенностью возбудителя. При сильном обезвоживании и нарушениями электролитного баланса, кроме классических признаков панлейкопении, у кошек могут наблюдаются коматозные стояния и судороги. Кроме того, при панлейкопении у кошки на поздней стадии беременности возможны разнообразные нарушении ЦНС у котят, например, гипоплазия мозжечка. У поражённых котят наблюдается приседающая походка с динамическим дрожанием.

Диагностика.
Для диагностирования панлейкопении можно использование экспресс-тесты.
Для вирусологических исследований у больных кошек берут сыворотку крови для серологических реакций (нейтрализации, торможения гемагглютинации и ИФ), а также носоглоточные смывы, мочу и кал для ПЦР.

Вирус лейкоза кошек (вирусная лейкемия кошек).

Данное заболевание вызывает РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae. Вирус лейкоза не поражает нервную систему непосредственно, однако может приводить к нервным расстройством из-за образования опухолей центральной нервной системы. Кошки заражаются друг от друга при тесном контакте через повреждённую кожу и слизистые, например, при совместном облизывании, груминге, драках и половом поведении. Также возможно и внутриутробное заражение котят от больной лейкозом кошки.
Инкубационный период может составлять от нескольких месяцев до нескольких лет после заражения.

Диагностика.
Вирус лейкемии кошек (FeLV) обнаруживается с помощью ИФ или прямым выделением из плазмы. С помощью метода непрямой иммунофлюоресценции возможно определить спецефический антиген FeLV в лейкоцитах крови. Также возможна диагностика иммуноиммиграционным экспресс-методом и ПЦР.

Вирус иммунодефицита кошек.

Вирус иммунодефицита кошек – это болезнь, возбудителем которой является нейротропный вирус из семейства Retroviridae. Вирус способен проникать в мозг и вызывать нервные нарушения. Симптомы энцефалопатии обычно развиваются после появления признаков недостаточности иммунной системы. У кошек наблюдается ненормальное стереотипное поведение – повторяющиеся бесцельные движения. Возможна агрессивность, дезориентация, замедленная реакция зрачка на свет, порез тазовых конечностей, судороги.

Диагностика.
Данная инфекция диагностируется с использованием иммуноферментного анализа (ИФА), для определения антител. Антитела, также могут быть выявлены методом непрямой флюоресценции. Также возможно использование ПЦР для определения провирусной ДНК.

Протозойные инфекционные заболевания.

Неоспороз – это протозойная инфекция, которой болеют и собаки и кошки, вызываемая простейшими Neospora canium, сходными по строению с Toxoplasma gondii, но отличающимися по иммунологическим свойствам.
Неоспоры способны проникать в мозг и скелетную мускулатуру, вызывая слепоту, поведенческие изменения и параличи. Взрослые животные заболевают при поедании заражённого мяса лошадей, крупного рогатого скота, овец и коз.

Инкубационный период составляет примерно 1 неделю. Щенки и котята заражаются неоспорозом от матерей-носителей, при этом у малышей наблюдается вытянутое положение тазовых конечностей, недержание мочи и кала. У взрослых животных практически всегда наблюдается поражение периферических нервов и мышц, что приводит к мышечной активности, разрыв или атрофия мышц.

Диагностика.
Для диагностики неоспороза исследуют сывороточные антитела (титры антител у собак с клинической формой заболевания составляют 1:800, матери больных щенков имеют титры 1:200). При исследовании спинномозговой жидкости наблюдают повышенное количества белка, нейтрофилов, эозинофилов. С помощью узи наблюдают изменения печени.
В целом, диагностика неоспороза также трудна и длительна, как при токсоплазмозе.

Токсоплазмоз.

Это инфекционная болезнь как кошек, так и собак, возбудителем которой является протозойный паразит Toxoplasmma gondii, половая стадия размножения которого происходит в организме кошки, а бесполая – в организмах млекопитающих или птиц. Инфицированная собака, в отличие от кошки, является только промежуточным хозяином и не выделяет ооцист токсоплазмы с калом. Заражение собак происходит через содержащее токсоплазмоцисты мясо – свинину, козлятину и баранину. Щенки могут быть заражены внутриматочно или через молоко.

Инкубационный период токсоплазмоза составляет от 2-х до 4-х недель. Чаще болеют молодые животные до 1 года и животные с ослабленным иммунитетом.
Токсоплазмоз – это мультисистемное заболевание. Нервная форма наблюдается только у 10 % больных животных. При этом наблюдаются потеря сознания, судороги, круговые движения, потеря координации, ухудшение зрения, дисфункции спинного мозга и энцефалопатии.

Диагностика.
Диагностировать токсоплазмоз трудно. Для данного заболевания характерно изменение концентрации печёночных ферментов и желчных кислот. Наиболее точным на сегодняшний день считают определение токсоплазмоза с помощью ИФА (иммунологические исследования). Для исследования на антитела используют сыворотку крови, околоплодные воды, спинномозговую жидкость, содержимое стекловидного тела. Также для диагностики применяют ПЦР.

Инфекционные заболевания, вызываемые грибками.

Криптококкоз.

Причиной заболевания является дрожжевой грибок Cryptococcus neoformans, заражение которым происходит преимущественно через голубиный помёт. Инфекция попадает в организм воздушно – капельным путём, вызывая в полости носа и лёгких гранулёмы. Из носа криптококки мигрируют через решетчатую кость в головной мозг, что приводит к менингоэнцефалитам. У собак и кошек возникают вестибулярные нарушения, параличи лицевого нерва, эпилептические припадки, агрессивность и порезы.
Инкубационный период точно не установлен и по данным разной литературы может составлять от месяца до нескольких лет.

Диагностика.
Самый лёгкий способ обнаружения данного микроорганизма – цитологическое исследование образцов носового экссудата, мочи, спинномозговой жидкости, плеврального выпота. Определение титров антител при данном заболевании бесполезно по причине недостаточного иммунного ответа организма хозяина. При исследовании общего клинического анализа крови возможен моноцитоз. При анализе спинномозговой жидкости обнаруживается нейтрофилия, эозинофилия, увеличение концентрации белка.
Инфекционные заболевания, вызываемые бактериями.

Листериоз – инфекционное заболевание животных, возбудителем которого является небольшая бактерия палочковидной формы с закруглёнными концами, не образующая спор и капсул - Listeria monocytogenes. Больные и переболевшие животные выделяют листерий с калом, мочой, истечениями из половых органов, с молоком, истечениями из носовой полости, а также с абортированным плодом. Листерии могут достаточно длительно сохраняться в окружающей среде. Основной резервуар возбудителя в природе – заражённые листериозом грызуны, загрязняющие воду и корм сельскохозяйственных животных. Заражение сельскохозяйственных животных происходит через слизистую оболочку носовой и ротовой полостей, конъюнктиву, пищеварительный тракт, повреждённую кожу. Попадая в организм, листерии проникают в различные органы, в том числе и головной мозг, активно выделяют токсины. Инкубационный период составляет от 7 до 30 дней. У щенков развиваются явления энцефалита, нескоординированные движения, парезы, судороги, приступы буйства.

Диагностика.
С целью выявления скрыто больных животных проводят серологические исследования (РА – реакция агглютинации и РСК). Разработан метод люминесцирующих антител.

МЕТОДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Для диагностики вирусных болезней людей и животных используют серологические реакции, которые основаны на взаимодействии вирусных антигенов со специфическими антителами.

Вирус – антиген, так как их белковая оболочка вызывает выработку специфических антител, которые накапливаются в сыворотке крови. Они способны соединятся в комплекс антиген + антитело только со своим антигеном. Если антиген – инфекционный агент (вирус), антитела его нейтрализуют: в этом состоит биологическая роль антитела.

Взаимодействие антител с антигенами возможно в пробирке, что является основой серологических реакций. Если взятая пара АГ (антиген) и АТ (антитело) гомологичны и соответствуют друг другу, то они образуют комплекс АГ + АТ. Это позволяет обнаружить по известному антителу неизвестный антиген [1].

1. Реакция нейтрализации (PH)

Это универсальная реакция служит эталоном при оценке других серологических реакций.

Принцип ее состоит в том, что при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс антиген + антитело, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Индикатором свободного (не связавшегося с антителами) вируса является чувствительная к вирусу живая система: животные, куриные эмбрионы или культура клеток.

При постановке реакции в пробирке смешивают равные объемы вируса и сыворотки, смесь выдерживают при соответствующей температуре (4, 22 или 37 °С) в течение одного часа или 16—18 ч (зависит от вируса и условий опыта). Затем этой смесью заражают чувствительную к вирусу живую систему, наблюдают за состоянием живых объектов и через соответствующий срок учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию:

1) гибели, развития клинической картины болезни и патологических изменений в органах и тканях лабораторных животных;

2) гибели, патологических изменений в оболочках, тканях зародыша и отсутствию гемагглютининов в жидкостях полостей куриных эмбрионах;

3) цитопатического действия (ЦПД) или бляшкообразования в культуре клеток. [2]

Так как для нейтрализации определенного количества вируса требуется определенное количество антител, а один из этих компонентов все еще неизвестен, то PH можно ставить в двух вариантах:

1) к разным дозам (разведениям) сыворотки (обычно в виде последовательных 2-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы вируса (обычно 100—1000 ЕД50). В этом варианте определяют титр вируснейтрализующих антител в сыворотке, показателем которого служит разведение сыворотки, защищающее от действия вируса 50 % зараженных биологических систем;

2) к разным дозам (разведениям) вируса (обычно в виде последовательных 10-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы сыворотки (обычно в разведениях 1 : 10 или 1 : 20). При постановке данного варианта PH кроме исследуемой (или специфической) сыворотки используют и нормальную (отрицательную) сыворотку. В этом случае определяют индекс нейтрализации (IN), который показывает, во сколько раз иммунная (специфическая) или исследуемая сыворотка снижает титр вируса по сравнению е нормальной сывороткой.

Достоинствами PH являются ее универсальность и высокая специфичность; недостатки — большая трудоемкость; необходимость строго соблюдать стерильность материалов, посуды и инструментов; высокая стоимость живых биологических систем; относительная длительность биопробы и необходимость проведения математических расчетов. [3]

2.Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Широко используется при исследовании гемагглютинирующих вирусов.

Основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.

Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного.

Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а отсутствие гемагглютинации — на его отсутствие, так как антитела полностью нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса. [4]

РТГА можно ставить в двух вариантах:

1) к разным разведениям сыворотки (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы вируса (4—8 ГАЕ);

2) к разным разведениям вируса (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы сыворотки.

Постановку РТГА по первому варианту проводят по следующим этапам:

• титруют вирус в РГА и определяют его гемагглютинирующий титр;

• приготовляют и контролируют рабочую дозу вируса (4 или 8 ГАЕ);

• ставят главный опыт РТГА;

Оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах и определяют титр антител. За титр антител в сыворотке принимается наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию. [5]

РГТА позволяет решить следующие диагностические задачи:

• обнаружить и определить титр антител в сыворотке крови с помощью известного вируса;

• идентифицировать неизвестный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами).

Достоинства РТГА — простота техники постановки и быстрый результат. Однако эту реакцию можно использовать только для гемагглютинирующих вирусов. [4]

3.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА — на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;

• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);

• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;

• смесь оставляют на 2—3 ч при комнатной температуре или на 16—18 ч при 4 °С;

• учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;

• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса). [6]

4.Реакция связывания комплемента (РСК)

Это — одна из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных болезней.

Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных этапов. На первом этапе участвуют антиген и антитело (один из этих ингредиентов заранее известен), а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии антигена и антитела их комплекс связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним — гемолизина). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антитела, то лизиса эритроцитов не происходит (положительная РСК). При отрицательной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов. РСК часто используют в диагностической практике для обнаружения и идентификации вирусов, обнаружения и титрования антител в сыворотках крови.

Основными компонентами РСК служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент (сыворотка крови морской свинки), гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7,2—7,4) или различные буферные растворы. [2]

5.Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП)

Основана на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов.

Для создания условий диффузии в слое агара делают лунки, в которые заливают компоненты. Количество и взаимное расположение лунок зависит от решаемой задачи.

РДП позволяет решить следующие диагностические задачи:

обнаружить и идентифицировать неизвестный выделенный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами);

обнаружить и определить титр антител в сыворотках с помощью известного антигена.

РДП может быть поставлена в чашках Петри (макрометод) и на предметных стеклах (микрометод).

Методика постановки макрометода по технике принципиально не отличается от постановки микрометода, только в этом случае в чашку Петри наливают 20—25 мл расплавленного агара и в застывшем геле делают лунки диаметром 5—6 мм по специальной схеме (расстояние между лунками 4—5 мм ) и вносят соответствующие компоненты.

При постановке РДП на предметных стеклах препарат можно через 48—72 ч высушить и окрасить раствором амидного черного, что позволит его сохранить и сфотографировать.

Достоинства РДП: простота техники постановки; быстрота получения ответа; не требует стерильной работы, особой чистоты компонентов; возможность документирования результата путем фотографирования. Недостаток РДП — низкая чувствительность. [7]

6.Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд)

Эту реакцию используют в том случае, если вирус обладает гемадсорбирующими свойствами. Гемадсорбцией называется адсорбция (прилипание) эритроцитов к поверхности клеток, зараженных вирусом.

Чтобы наблюдать гемадсорбцию, из пробирки с зараженной вирусом культурой клеток удаляют культуральную жидкость и вносят 0,5%-ную взвесь эритроцитов, оставляют на 5—10 мин, затем слой клеток споласкивают физиологическим раствором (чтобы смыть эритроциты). Если в зараженной культуре клеток идет репродукция вируса, то на таких клетках под малым увеличением микроскопа можно видеть адсорбировавшие эритроциты, в контрольных (незараженных) культурах клеток таковые отсутствуют.

РТГАд основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой (содержащей антитела к этому вирусу).

Методика постановки РТГАд заключается в следующем: на 3—7-й день после заражения культур клеток из них удаляют питательную среду, промывают клетки раствором Хенкса и вносят в каждые 4 пробирки по 0,5 мл специфической к вирусу ПГ-3 сыворотки в разведении 1:10;

пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной температуре на 30 мин (для контакта клеток с антителами);

во все пробирки вносят по 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки;

через 30 мин — учет результатов. Отсутствие гемадсорбции в пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в пробирках с зараженной культурой клеток, но не обработанной специфической сывороткой, свидетельствует о наличии вируса ПГ-3 в культуре клеток.

Чаще всего РТГАд применяют для идентификации вируса и редко для обнаружения и титрования антител. [4]

7.Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

При данном методе используют явление люминесценции.

В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции — это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания.

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра (длина волны 300—460 нм).

Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.

Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ-флуоресцеин изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамин сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом. [3]

Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в следующем:

• готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах — инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;

• препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4—16 ч);

• окрашивают по прямому или непрямому методу; ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.

Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового животного — контроль.

Различают два основных метода применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.

Прямой метод (одноступенчатый). На фиксированный препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °С во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного конъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 — 7,5), подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.

Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.

Непрямой метод (двухступенчатый). На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного — продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов.

Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает метод с использованием комплемента. Метод заключается в том, что на фиксированный препарат наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных. [5]

Библиографический список

1. Госманов, Р. Г. Ветеринарная вирусология [Текст] : учебник для студ. вузов, обуч. по спец. 111201 "Ветеринария" / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : КолосС, 2006. – 93c.

2. Широбоков В. П. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Текст] : учебник для студ. высш. мед. учеб. заведений. – М. : Винница Нова Книга, 2015. – 262 с.

4. В. А. Подколзина, А. А. Седов Медицинская микробиология[Текст]: конспект лекций для вузов. – М.: Приор-издат, 2007. – 14с.

5. Павлович С. А. Микробиология с вирусологией и иммунологией [Текст] : учеб. пособие / Павлович С. А. – 3-е изд., испр. – Минск: Выш. шк., 2013. – 388 с.

6. Донецкая Э.Г.-А. Клиническая микробиология [Текст] : Руководство для специалистов клинической лабораторной диагностики. — М. : ГЭОТАРМедиа, 2011. — 57 с.

7. Кишкун А. А. Клиническая лабораторная диагностика [Текст]: учеб. пособие. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 807 с.

Реакция нейтрализации и её использование в вирусологии (литературный обзор)

Реакция нейтрализации (РН) - это универсальная реакция, которая служит эталоном при оценке других серологических реакций. Принцип ее состоит в том, что при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс антиген + антитело, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т.е. их нейтрализацией. Однако реакции нейтрализации применяют и с диагностическими целями. Особенно широкое применение они получили в вирусологической практике как для серологической диагностики вирусных заболеваний, так и для идентификации вирусов. С этой целью используют реакции нейтрализации роста вирусов в культуре ткани, подавления бляшкообразования, гемадсорбции, торможения гемагглютинации (РТГА) [2,5].

Источником вируса в реакции служат жидкости и экстракты инфицированных культур клеток, куриных эмбрионов, органов зараженных животных [3].

При постановке реакции в пробирке смешивают равные объемы вируса и сыворотки, смесь выдерживают при соответствующей температуре (4, 22 или 37 °С) в течение одного часа или 16—18 ч (зависит от вируса и условий опыта). Затем этой смесью заражают чувствительную к вирусу живую систему, наблюдают за состоянием живых объектов и через соответствующий срок (в зависимости от вируса) учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию:

1) Гибели, развития клинической картины болезни и патологических изменений в органах и тканях лабораторных животных

2) Гибели, патологических изменений в оболочках, тканях зародыша и отсутствию гемагглютининов в жидкостях полостей куриных эмбрионах;

3) Цитопатического действия (ЦПД) или бляшкообразования в культуре клеток.

Сыворотки, используемые в PH, должны быть предварительно освобождены от термолабильных неспецифических ингибиторов путем прогревания. Как чувствительную систему, так и метод ее заражения подбирают с учетом наилучшей возможности культивирования данного вируса. Так как для нейтрализации определенного количества вируса требуется определенное количество антител, а один из этих компонентов все еще неизвестен, то PH можно ставить в двух вариантах:

Необходимо помнить, что любая серологическая реакция (в том числе и PH) должна сопровождаться контролями на каждый компонент, участвующий в реакции [4].

Библиографический список

2.Широбоков В. П. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студ. высш. мед. учеб. заведений. – М. : Винница Нова Книга, 2015. – 262 с.

Читайте также: