Титрование вирусов в ветеринарии

Обновлено: 27.03.2024

Титр – это количество вируса, содержащегося в единице объема материала. Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки и оспины на ХАО КЭ. Если имеются данные обратные то инфекционная активность вируса может быть измерена в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ) 1БОЕ = дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ – одной оспины. Методы: заражают несколько КК или КЭ на ХАО. Высчитывают среднеарифметическое количество оспин или бляшек. Оно = БОЕ или ООЕ вируса. Рассчитывают сколько БОЕ или ООЕ приходится на единицу объема вируссодержащего материала. Это и есть титр. Т=n/Va, где n-сред арифметическое бляшек или оспин, а –разведение материала, V – введенная доза. Метод 50%-ного инфекционного действия. За единицу количества вируса принимается доза, которая способна вызвать инфекционный эффект у 50% зараженных. Число таких доз в единице материала и будет выражать титр вируса в этом материале. Готовят 10 кратное разведение исследуемого материала, затем одинаковыми дозами заражают равные группы живых тест объектов. Учитывают результат действия и находят в каком разведение вирус проявил свое действие на 50%. Если сразу такое разведение не найдено то оно рассчитывается по формуле Т=lgB – (b-50)/(b-a) *lgd, где В – разведение дающие инфекционный эффект более 50%, b – процент дающий инфекционный эффект более 50%, а – менее 50% d – кратность разведения. За 1ГАЕ принимается такая доза вируса, которая способна агглютинировать примерно 50% эритроцитов содержащихся в том же, что и вирус объеме 1% суспензии отмытых эритроцитов. Готовят ряд последовательных кратных разведений материала и к каждому разведению добавляют 1% суспензию. Реакция оценивается в крестах. Реакция с 2 крестами содержит 1ГАЕ, которая умножается на кратность разведения.

Методы уничтожения, инактивации и консервации вирусов.

Требования по безопасности ужесточаются в связи с необходимостью во многих случаях приготовления концентратов вирусных антигенов. Следует отметить, что инактивация должна быть не только эффективной, но и максимально щадящей (селективной). Иными словами, сопутствующие изменения в структуре вирусных частиц и их компонентов должны быть минимальными. Однако механизм инактивирующих воздействий во многих отношениях недостаточно выяснен и их использование зачастую носит эмпирический характер.

Так как вирионы в центре агрегатов, образованных клеточными и сывороточными компонентами, могут быть защищены от инактивации, разрушение и удаление агрегатов различными методами очистки вирусной суспензии является важным этапом перед инактивацией. При изготовлении цельновирионных не-реплицирующихся вакцин используют химические и физические методы инактивации вирусов.

Химические методы инактивации вирусов

Из химических соединений наиболее часто используют два главных типа инактиваторов: ретикулирующие (разрыхляющие) агенты и алкилирующие агенты.

К ретикулирующим агентам относятся альдегиды, в том числе формальдегид, глютаральдегид и глицидальдегид, из которых наиболее часто используют формальдегид. К алкирующим агентам относятся бетапропиолактон, этиленимин и другие азиридины.

Механизм действия инактивирующих агентов, вероятно, заключается в следующем: 1) взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами, они делают невозможной их репликацию; 2) вызывают ретикуляцию белков.

Механизм действия инактивирующих агентов лучше изучен применительно к белкам, чем к нуклеиновым кислотам, хотя в целом остается не полностью выясненным. Инактивация вирусов, кажется, основывается на двойном действии ретикуляции белков, взаимодействующих с клеточными рецепторами, и блокаде репликации нуклеиновых кислот. Необходимая концентрация инактивирующих агентов зависит, главным образом, от относительной концентрации белков и нуклеиновых кислот в инактивируемой среде. Температура и гомогенность инактивируемого субстрата также играют ключевую роль в кинетике инактивации вируса.

Возможность обратимости изменений реактивных групп (аминогруппа лизина, фенольные ядра тирозина) необходимо учитывать, особенно в случае использования формальдегида.

Полнота инактивации вируса должна определяться сразу после изготовления вакцины.

Наиболее общепринятыми инактивирующими агентами являются формальдегид, бета-пропиолактон и этиленимин. Одним из преимуществ бета-пропиолактона, используемого для изготовления вакцины против бешенства, и этиленимина, применяемого в изготовлении вакцины против ящура, является то, что они полностью гидролизуются в течение нескольких часов с образованием нетоксичных продуктов.

Формальдегид инактивирует вирусы благодаря высокой реакционной способности в отношении белков и нуклеиновых кислот. Он вступает в соединение не только с вирусными частицами, но и с многочисленными компонентами среды, в которую его добавляют.

Механизм инактивации вирусов формальдегидом сложен и характеризуется двумя типами реакций. Взаимодействие формальдегида с нуклеиновой кислотой и белками вируса протекает, соответственно, по типу реакции первого и второго порядка. Наиболее существенна для инактивации первая, которая, однако, в значительной мере зависит от второй.

Взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами и белками, формальдегид реагирует в основном с аминогруппами. Присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот.

Формальдегид с большей скоростью взаимодействует с аминогруппами аминокислот и белков с образованием метилольных производных, чем с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Сложилось представление, что с белками и нуклеиновыми кислотами вирусов формальдегид реагирует в две стадии. Вначале, в результате взаимодействия формальдегида с амино- или иминогруппами, быстро образуются весьма нестабильные метилольные производные, а затем, в результате вторичных реакций — бисметиленовые производные.

Продукты взаимодействия формальдегида с аминокислотами способны вступать в реакцию с нуклеиновыми кислотами значительно быстрее, чем сам формальдегид.

Во второй стадии происходит медленное взаимодействие первичных продуктов реакции с другими группами белков, в результате чего образуются ковалентно связанные димеры полипептидов. При этом уплотняется белковая оболочка и уменьшается ее проницаемость. Вследствие этого снижается скорость инактивации вируса. Под влиянием формальдегида в вирионах клещевого энцефалита образовывались гликопротеиновые димеры и комплекс РНК с белками нуклеокапсида. Последний отличался высокой стабильностью и разрушался только РНКазой. Предполагается, что образование этого комплекса — основной механизм инактивации вируса. Гликопротеин, экстрагированный из инактивированного вируса, обладал нормальной антигенной и иммуногенной активностью.

Следует отметить, что реакция формальдегида с аминогруппами обратима, то есть при удалении избытка реагента или разбавлении раствора активность нуклеиновой кислоты может быть восстановлена. Процесс взаимодействия вируса с формальдегидом зависит от таких факторов, как концентрация реагента, температура, рН среды.

При оптимальных условиях инактивации взаимодействие формальдегида с белками многих вирусов не оказывает значительного влияния на их антигенные свойства. Однако ряд вирусов теряет значительную часть антигенной активности при инактивации формалином. Это особенно касается оболочечных вирусов и, прежде всего, вирусов кори и респираторно-синцитиального (PC) вируса. Например, инактивирован-ная формалином вакцина против PC-вируса вызывала образование антител к белку F, которые не подавляли его инфекционную и симпластообразующую активность. Более того, вакцинация приводила к осложнению течения болезни при последующем ее возникновении. Вероятно, под действием формалина изменяются эпитопы гликопротеина, ответственные за индукцию вируснейтрализующих антител.

Это касается, прежде всего, поверхностного F белка, ответственного за протективный иммунитет. Однако многие из вирусов, которые относительно хорошо переносят инактивацию формалином, оказываются весьма чувствительными к изменениям ее условий. Повышение концентрации формальдегида в десять и более раз по сравнению с оптимальной (0,1%-ной) приводило к морфологическим изменениям поверхностного антигена вируса гепатита В и снижению его активности, а увеличение продолжительности обработки очищенного полиовируса сопровождалось значительным повреждением капсида некоторых вирионов. С целью смягчения повреждающего действия формальдегида на антигенность и иммуногенность вирусов стали применять стабилизирующие вещества. Установлено, например, что добавление арилдона (5,4 М) не влияет на инактивацию аттенуированных и вирулентных штаммов полиовируса формалином (1:4000, 37°С) и, в то же время, способствует сохранению иммуногенности за счет стабилизации D-антигена.

Применяют следующие методы консервации вирусов:

при хранении вирусного материала (кусочки органов или тканей) часто используют глицерин (50%-ный раствор на ИХН), который обладает бактериостатическим действием и в то же время защищает вирусы. При этом можно хранить несколько месяцев при 4С.

чаще всего хранят вирусы в холодильниках, обеспечивающих температуру -20, -30, -70С. При этой температуре некоторые вирусы без добавки защитных веществ сравнительно быстро теряют инфекционность. Хорошее защитное действие при замораживании и хранении вирусов оказывает добавка: инактивированной сыворотки крови или обезжиренного молока или 0,5-1,5% желатина.

Быстрая заморозка до минус 196С жидким азотом. Вирусы, чувствительные к низким значениям рН, следует замораживать в жидкостях, не содержащих однозамещенных фосфатов.

Лиофилизация – высушивание в замороженном состояние в условиях вакуума – очень хороший способ консервирования. В лиофилизированном виде вирусы могут храниться несколько лет.

В лабораторных работах с вирусами, биофабричном производстве и в ветеринарной практике постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Без такого определения невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство живых и инактивированных противовирусных вакцин и диагностических препаратов, оценка активности живых противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и многие другие работы.

Количество вируса в каком-либо материале определяют по титру вируса в этом материале. Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале.

Титр вирусаэто количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы.

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ — одной оспины.

Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД50— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

Виды единиц количества вирусов при определении по 50%-ному инфекционному действию

Тест-объекты

Виды инфекционного

действия вирусов

Единицы количества

названия единиц

сокращение обозначения

томы или патоло-

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

1 ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);

1 ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;

1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;

1 ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;

1 ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10 3,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10 3 ' 48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10 3,48 =3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД50, на значительном отрезке приближается к прямой.

Рисунок 35. График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД50, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4—6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД50. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД50) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

1.1 Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации

Как и многие другие вирусы животных, вирусы гриппа агглютинируют эритроциты. В основе агллютинации лежит взаимодействие гемагглютинина, одного из поверхностных вирусных белков, с рецепторами, расположенными на поверхности эритроцитов. Поскольку каждая вирусная частица содержит не одну молекулу гемагглютинина, образующего шиловидные выступы, при достаточно высокой концентрации вируса формируются крупные агрегаты эритроцитов со структурой типа сети.

Образование таких агрегатов легко наблюдать в лунке или пробирке с U-образным дном; в этом случае нормальные эритроциты образуют компактный осадок на дне пробирки, а агглютинированные оседают равномерно. Эта реакция исключительно удобна для количественного определения вируса.

Для постановки гемагглютинации определенное количество эритроцитов смешивают в лунках планшета с равным объемом исследуемой суспензии вируса в разных разведениях. Планшет затем инкубируют 30—45 мин при комнатной температуре без перемешивания. По результатам реакции можно определить, при каком разведении вирусного препарата утрачивается гемагглютинирующая активность. Количество вируса, агглютинирующее 50% эритроцитов, определяется как 1 гемагглютинирующая единица.

Таким образом, зная, какое разведение вируса соответствует одной ГАЕ, можно вычислить титр вируса в ГАЕ/мл. Значение ГАЕ зависит от условий анализа, в частности от объема реакционной смеси и концентрации эритроцитов; кроме того, постановка реакции в разных лабораториях может иметь свои особенности. Ниже приведена методика, постоянно используемая в лаборатории авторов.

ГАЕ — удобная единица для сравнения разных препаратов вируса, однако она не определяет ни общего количества вируса в препарате, ни количества инфекционных частиц. Тем не менее для любого конкретного штамма вируса соотношение между ГАЕ и другими единицами измерения количества вируса может быть определено эмпирически; затем, если вирус не претерпел генетических изменений, титр в ГАЕ можно использовать для расчета других параметров. Для большинства лабораторных штаммов вируса гриппа выполняется следующее приблизительное соотношение:

1 ГАЕ = 2-10 единиц инфекционности для куриных эмбрионов =2 10 БОЕ = 10 физических единиц.

Подготовка эритроцитов.

В реакции можно использовать эритроциты различного происхождения, например человека или морской свинки, но чаще всего используют куриные эритроциты. 1%-ную суспензию готовят следующим образом.

1. Кровь фильтруют через два слоя муслина.

2. Фильтрат центрифугируют 5 мин в настольной центрифуге при 1500 об/мин.

3. Супернатант и верхний слой осадка, состоящий из лейкоцитов, удаляют с помощью пастеровской пипетки, присоединенной к водоструйному насосу. Клетки 3 раза промывают физиологическим раствором, суспензируя осадок и повторно осаждая эритроциты при 1500 об/мин.

4. Эритроциты ресуспендируют в физиологическом растворе и получают плотный осадок центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают, а осадок эритроцитов суспендируют в 100-кратном объеме физиологического раствора. Суспензию тщательно перемешивают и хранят при 4°С.

Постановка реакции.

1. В лунках планшета готовят последовательные двукратные разведения вирусной суспензии с неизвестным титром на физиологическом растворе; объем суспензии в каждой лунке должен быть равен 0,25 мл. В опыт включают также и контрольную лунку с физиологическим раствором.

2. 1%-ную суспензию эритроцитов интенсивно встряхивают и вносят в каждую лунку в количестве 0,25 мл. Смесь в лунках перемешивают, поворачивая планшет, и инкубируют планшет 45 мин без дальнейшего перемешивания на листе белой бумаги.

В предельном разведении, обладающем гемагглютинирующей активностью, наблюдается один из трех типов агглютинации, что можно использовать для приблизительного расчета титра вируса.

Более экономным методом определения титра является микровариант этой реакции, в котором используется по 0,05 мл суспензии вируса и эритроцитов; реакцию можно ставить в микропланшете для титрования. Следует, однако, иметь в виду, что в этом случае одна ГАЕ определяется как количество вируса в объеме 0,05 мл, агглютинирующее 50% эритроцитов в 0,05 мл 1%-ной суспензии.

Факторы, влияющие на результат реакции гемагглютинации.

Результаты реакции гемагглютинации могут искажаться лод действием ряда факторов.

1. Существенно, чтобы перед использованием кровь не хранилась слишком долго. Через 5—7 дней в ней начинается гемолиз, что делает исследование гемагглютинации сначала неточным, а затем вообще невозможным.

2. Поскольку при низкой концентрации эритроцитов получают завышенные значения титра вируса, суспензию эритроцитов перед использованием необходимо тщательно перемешать.

3. Учет результатов реакции не следует откладывать надолго. Помимо гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа локализован фермент нейраминидаза, отщепляющий •от олигосахаридов концевые остатки сиаловой кислоты. Поскольку гемагглютинин присоединяется к поверхности эритроцитов именно через остатки сиаловой кислоты, действие нейраминидазы нарушает связи между вирионами и клетками. Поэтому через некоторое время слой агглютинированных эритроцитов начинает разрушаться. Некоторые штаммы вируса гриппа имеют столь высокую нейраминидазную активность, что быстрое удаление клеточных рецепторов препятствует агглютинации при комнатной температуре. В этом случае рекомендуется ставить реакцию гемагглютинации при 4°С.

4. Результат реакции может быть искажен, если используемые планшеты недостаточно хорошо вымыты. Сразу же после окончания работы планшеты следует замочить на 1 ч в 4%-ном растворе NaOH, а затем тщательно промыть дистиллированной водой.

5. Вирусная суспензия может содержать вещества, специфически или неспецифически ингибирующие гемагглютинацию. Эта проблема особенно серьезна при титровании вируса в культуральной жидкости, поскольку входящая в состав питательных сред сыворотка крови содержит подобные ингибиторы. Многие из них могут быть инактивированы прогреванием сыворотки при 56 °С 30 мин; подробнее этот вопрос обсуждается в работе Хойла. В некоторых случаях, однако, возникает противоположная ситуация: некоторые препараты сывороток содержат факторы, вызывающие гемагглютинацию в отсутствие вируса. Поэтому необходимо одновременно с вирусом титровать образец среды от незараженных клеток.

6. Следует помнить, что и вирусы других семейств агглютинируют эритроциты и могут препятствовать проведению специфической реакции. Природу исследуемого вируса можно, разумеется, установить в реакции торможения гемагглютинации с использованием специфической антисыворотки против интересующего исследователя вируса.

Реакция торможения гемагтлютинации.

Способность вируса гриппа связывать и агглютинировать эритроциты можно использовать и для определения концентрации противовирусных антител в образцах сыворотки. Для этого проводят реакцию между последовательными разведениями сыворотки и известным количеством вируса, а затем добавляют суспензию эритроцитов; концентрацию антител определяют, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

1. Готовят последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки на физиологическом растворе. В зависимости от того, выполняется анализ в стандартных планшетах или в микропланшетах, объем каждого разведения должен составлять соответственно 0,25 или 0,05 мл.

2. В каждую лунку вносят по 4 ГАЕ стандартного вируса '. Антитела инкубируют с вирусом 30 мин при комнатной температуре.

3. В каждую лунку вносят нужное количество 1%-ной суспензии эритроцитов, перемешивают и продолжают инкубацию еще 30 мин.

4. Учитывают результаты и определяют концентрацию антител, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

Примечание. Следует включать в опыт соответствующие контроли, чтобы убедиться в правильности определения концентрации вируса, в том, что сыворотка сама по себе не вызывает гемагглютинации и что в отсутствие вируса эритроциты нормально оседают.

Читайте также: