Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота

Обновлено: 24.04.2024

В.А. МИЩЕНКО, НА. ЯРЕМЕНКО, А.В. МИЩЕНКО, А.В. КОНОНОВ, В.В. ДУМОВА
ВНИИЗЖ

Высокая продуктивность крупного рогатого скота, способного с максимальной воспроизводимостью использовать элементы питания на биосинтез органических веществ организма с низкими затратами кормов на единицу продукции, обусловлена интенсивностью течения процессов обмена веществ и напряженным функционированием всех органов и систем.

Иммунная система является индикатором физиологического состояния организма, она чутко реагирует на изменения условий окружающей среды. Нарушение ее функции рассматривают как один из патогенетических механизмов патологического процесса.

Высокопродуктивные коровы с интенсивным обменом веществ и более чувствительной нейрогуморальной регулирующей системой восприимчивы даже к незначительным нарушениям условий содержания и реагируют на это более выраженным нарушением обмена веществ, затрагивающим их иммунобиологический статус.

В большинстве обследованных стад у высокопродуктивных коров отмечают несбалансированное по сахаропротеиновому отношению и микроэлементам кормление, это предрасполагает к развитию жировой дистрофии печени, ацидозу рубца и иммунодефицитному состоянию. Иммунодефициты - это нарушения иммунного статуса организма, обусловленные отклонениями в одном или нескольких механизмах иммунного ответа (Н.С. Шевырев, 1999; П.Н. Сисягин и соавт, 2005; Ю.Н. Федоров, 2005). Для крупного рогатого скота наиболее важны вторичные иммунодефицита, которые имеют приобретенный характер и обусловлены воздействием на организм вирусов, бактерий, паразитов, нарушением обмена веществ, а у новорожденных телят являются следствием нарушения передачи материнских антител с молозивом (несвоевременная выпойка, некачественное и неполноценное молозиво). Главное проявление иммунодефицита - повышенная заболеваемость инфекционными болезнями (П.Н. Сисягин и соавт, 2005; Ю.Н. Федоров, 2005).

Состояние иммунной системы у сухостойных коров и развитие вторичного иммунодефицита зависят от технологии содержания и уровня их кормления в стойловый период (В.Н. Гущин и соавт., 1999). При рождении у телят имеется физиологический иммунодефицит, вызванный отсутствием в крови иммуноглобулинов. Молозиво - единственный источник антител и клеточных факторов иммунитета для новорожденных. Наибольшую проблему для их сохранения представляют желудочно-кишечные болезни, проявляющиеся диареей, обусловливающей развитие выраженной дегидратации, токсемии, энофтальмии, мембранопатологий, нарушением обмена веществ и иммунодефицитом (А.В. Трунов и соавт, 1992; П. Урбанович, А. Попатенко, 1999; В.А. Томчук, 2000; В.А. Мищенко и соавт, 2001 - 2005; П.Н. Сисягин и соавт, 2005, и др.). Диарею регистрируют у 50 -100 % новорожденных, а гибель может достигать 30 - 50 % родившихся телят (М.А. Сидоров и соавт, 1998; В.П. Онуфриев и соавт, 1999; СВ. Миськевич и соавт, 2001). Диарея имеет сложную этиологическую структуру и ассоциируется прежде всего с ротавирусной и коронавирусной инфекциями, осложненными энтеропатогенными бактериями. Кормление телят молозивом от матерей, ранее иммунизированных инактивированной вакциной против ротавирусной и коронавирусной инфекций, позволяет профилактировать диарею новорожденных (В.П. Онуфриев и соавт, 1990; В.А. Мищенко и соавт, 2001 - 2005; Х.З. Гаффаров и соавт, 2002).

Нами установлено, что 20 - 40 % новорожденных телят, полученных от вакцинированных коров, не содержат колостральных антител. Обычно уровень последних снижается ниже защитной активности к 25 - 35-му дню после рождения. За этот период происходит расходование и естественное разрушение (катаболизм) иммуноглобулинов и клеточных элементов при недостаточном их образовании в собственном организме. В это время телят переводят на групповое содержание, происходит смена кормления, что при неблагоприятных условиях приводит их к стрессовому состоянию. При обследовании ряда животноводческих хозяйств у телят, переболевших ротавирусной или коронавирусной диареей, значительно чаще регистрируют респираторные болезни в 45 - 60-дневном возрасте. У переболевшего молодняка уровень поствакцинальных антител значительно ниже аналогичного показателя у здоровых.

Е.С. Воронин (1996) отмечал, что диарейные болезни новорожденных телят проявляются на фоне иммунодефицитов В-системы. Возникновение респираторной патологии находится в прямой зависимости от гиперчувствительности надпочечников, обусловленной технологическими издержками - стрессами. Выброс большого количества стероидных гормонов в периферическую кровь подавляет иммунную систему, в основном Т-систему, что способствует активизации инфекционных агентов, инициирующих респираторную патологию (Е.С. Воронин, 1996; СМ. Сулейманов и соавт, 1999). В свою очередь, сами респираторные вирусы вызывают иммуносупрессию, что еще более усугубляет иммунодефициты и приводит к развитию смешанных инфекций. Многие исследователи считают, что респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота являются и следствием, и причиной вторичных иммунодефицитов (СМ. Сулейманов, и соавт, 1993, 1999; П.Н. Сисягин и соавт, 2005; Ю.Н. Федоров, 2005).

В современных условиях ведения животноводства широко распространены болезни крупного рогатого скота со сложной этиологией, среди них инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3, вирусная диарея, лейкоз и др. Применение средств специфической профилактики не всегда предупреждает развитие вирусных инфекций. Некоторые исследователи считают, что одной из причин низкой эффективности вакцинопрофилактики может быть гетерогенность иммунного ответа животных (В.В. Бурдейный, 1998).

Механизмы формирования иммунодефицитных состояний разнообразны и во многом зависят от иммунодепрессантов. К последним относят следующие вирусы: вирусной диареи (В. Liess, 1990; С. Howard, 1990; В.Н. Сюрин и соавт, 1998; Н.С Шевырев, 1999; I. Brownlie etal., 2000; П.Н. Сисягин и соавт, 2005; Ю.Н. Федоров, 2005); инфекционного ринотрахеита (Р. Nyagaetal, 1979; H.D. Liggitt etal., 1985; Е. Nafi et al., 1985; T.D.G. Bryson, 1996; B. Adair et al., 1999; П.И. Сисягин и соавт, 2005; Ю.Н. Федоров, 2005); парагриппа-3 (Е. Stauber et al., 1984; H.D. Liggitt et al., 1985; D. Slauson et al., 1987; A. Bamford et al., 1995;T.D.G. Bryson, 1996; B. Adair etal., 1999; П.Н. Сисягин и соавт, 2005; Ю.Н. Федоров, 2005); респираторно-синцитиальной инфекции (T.D.G Bryson, 1996; C.L Kelling et al., 1996; В.Н. Сюрин и соавт, 1998); лейкоза (В.Л. Никифорова, 1999; Н.С. Шевырев, 1999; В.Г. Ткачук и соавт, 2005; О.Ю. Черных, 2005); иммунодефицита (В.Н. Сюрин и соавт, 1998; Н.С. Шевырев, 1999).

Неполноценное кормление приводит к супрессии Т-зависимого и Т-независимого иммунного ответа (Д.Ж. Теппермен, X. Теппермен, 1989; И.А. Николаева, 1995). Патобиохимические, патоморфологические и патофизиологические процессы в организме, возникающие в результате гипомикроэлементозов, ведут к снижению общей неспецифической резистентное™ и иммунобиологической реактивности. При этом в хозяйствах отмечают повышенную заболеваемость инфекционными болезнями (ВТ. Самохин и соавт, 2005). Иммуно-депрессантами являются и микотоксины, которыми контаминированы 25 % зерновых (Т. Папазян, 2002).

Возбудитель вирусной диареи реплицируется во всех главных субпопуляциях лимфоцитов и в других клетках иммунной системы, что приводит к лейкопении. При этом повреждаются В-клетки, отмечают двукратное снижение количества Т-супрессоров. Вирус диареи поражает первыми нейтрофилы и макрофаги. У переболевших животных отмечают гипоплазию лимфоузлов, селезенки, тимуса, пейеровых бляшек и уменьшение количества лимфоцитов и мононуклеарных клеток. Вирионы выявляют главным образом в Т-лимфоцитах и моноцитах. Возбудитель угнетает способность нейтрофилов к дегрануляции, антителозависимой клеточной цитотоксичности. При вирусной диарее подавляются нормальные защитные механизмы организма (гуморальные факторы и фагоцитарные функции), что ведет к неингибируемому циркулированию микроорганизмов в крови. После переболевания возникает иммуносупрессия и, как следствие, повышается чувствительность животных к другим патогенам.

У персистентно инфицированных особей вирус диареи присутствует в органах иммунной системы. Характерным в патогенезе вирусной диареи является блокирование иммунореактивности организма крупного рогатого скота вследствие поражения иммунокомпетентных клеток возбудителем. У инфицированных животных иммунный ответ на введение других вакцин значительно ниже, чем у интактных особей (C.I. Howard, 1990; В. Liess, 1990; В.Н. Сюрин исоавт., 1998; Ю.Н. Федоров, 2005).

Вирус инфекционного ринотрахеита в организм крупного рогатого скота обычно проникает через слизистые оболочки верхних дыхательных путей или слизистые половых путей (О.С. Штрауб, 1990). На фоне размножения возбудителя диареи усиливаются патогенные свойства вируса ИРТ. Последний размножается в моноцитах, нейтрофилах, лимфоцитах и макрофагах (преимущественно альвеолярных), ингибируя синтез интерлейкинов и слияние фагосом и лизосом. Максимальный уровень иммуносупрессии отмечают на 5-й день после заражения. У телят иммуносупрессия более выражена и продолжается дольше, чем у взрослых особей (С.А. Самуйленко и соавт, 2001). Все это обусловливает у крупного рогатого скота иммунодефицитное состояние, повышает восприимчивость его к другим инфекциям и не позволяет получать адекватный ответ на введение вакцин (P. Nyaga et al., 1979; О.С. Штрауб, 1990; T.D.G. Bryson, 1996; П.Н. Сисягин и соавт, 2005; Ю.Н. Федоров, 2005).

Вирус парагриппа-3 размножается в альвеолярных макрофагах, ингибирует синтез интерлейкинов и функцию макрофагов, что приводит к возникновению иммуноде-фицитного состояния (Е. Stauber et al., 1984; T.D.G. Bryson, 1996; В. Adair et al., 1999; П.Н. Сисягин и соавт, 2005; Ю.Н. Федоров, 2005) .

Возбудитель респираторно-синцитиальной инфекции размножается в альвеолярных макрофагах и лейкоцитах (T.D.G. Bryson, 1996; C.L. Kelling et al., 1996; B.H. Сюрин исоавт, 1998).

Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (В.Н. Сюрин и соавт, 1998), относящийся к роду Lentivirinae семейства Retroviridae, вызывает снижение показателей клеточного иммунитета, угнетает фагоцитарную активность, содержание нейтрофилов и моноцитов, а также их функциональную активность, что приводит к прогрессирующей слабости и истощению (Н.С. Шевырев, 1999).

Инфицирование вирусом лейкоза сопровождается развитием иммунодефицитного состояния в организме крупного рогатого скота (В.Н. Никифорова, 1999; Н.С. Шевырев, 1999; В.Г. Ткачук исоавт, 2005; О.Ю. Черных, 2005;).

У зараженных внутриутробно парвовирусом новорожденных телят органы иммунной системы недоразвиты (В.А. Мищенко и соавт, 2000).

Микоплазмы, взаимодействуя с лимфоцитами, изменяют их функциональную активность, индуцируя иммунодефицит (Н.Н. Андросик, 2005; И.В. Раковская, 2005). Интенсивное применение антибиотиков вызывает дисбактериозы, приводящие к возникновению иммунодефицитов, а сами эти препараты при накоплении в организме обладают иммунодепрессивными свойствами (I. Kosters, 1991; Е.С. Воронин, 1996). И.М. Донник (1999) у животных из наиболее сложных в экологическом планетерриторий, в органах и тканях которых накапливалось значительное количество ксенобиотиков разных видов, наблюдала депрессию иммунной системы. Иммунный ответ на введение инактивированной вакцины у переболевших зимней дизентерией коров на 1,5 - 2,5 log2 ниже, чем у здоровых.

Вакцинация телят на фоне нарушения обменных процессов организма, угнетения иммунной системы приводит к значительному снижению эффективности вакцин (В.А. Машеро, 2005). Иммунодефицит на фоне инфекционного заболевания может повышать восприимчивость животных к разным патогенам и снижать иммунный ответ на применяемые вакцины. Использование классической схемы профилактики инфекционных болезней животных на фоне иммунодефицитных состояний их организма, как правило, не приводит к положительному результату. Все это необходимо учитывать при разработке средств и методов профилактики инфекций.

При современном ведении животноводства в России обычно отмечают смешанные (ассоциированные) иммунодефициты, то есть патологии, обусловленные несколькими факторами, в их числе микроэлементозы, микотоксикозы, несбалансированное кормление. Этим же можно объяснить и более тяжелое течение ряда инфекционных болезней.

журнал "Ветеринария" №11 2006

Иммунодефицит крупного рогатого скота

При серологическом обследовании КРС в разных странах установлено, что иммунодефицит (ИД) довольно широко распространен. Так, в США серопозитивных животных было 4 %, в Нидерландах — 1,4, в Канаде — 5,5, в Германии — 6,6, во Франции — 4 %. ИД КРС также зарегистрировали в Великобритании, Швеции, Коста-Рике, Венесуэле, Новой Зеландии и Австралии. Количество серопозитивных животных от здорового КРС составляло 1—7 %. Однако в отдельных стадах у животных с хроническими болезнями оно достигало 50 %. Из 64 % ИД-серопозитивных животных с лимфосаркомой, лимфоаденопатией и другими нарушениями — 74 % были инфицированы ВЛ КРС.

Клиническая картина и патологоанатомические изменения. Кроме данных о проявлении клинических признаков болезни у коров, инфицированных ИД совместно с ВЛ КРС, в настоящее время нет документального подтверждения об инфекции, вызываемой вирусом ИД (ВИД) у естественно инфицированных животных.

При определении отдельных видов лейкоцитов отмечали повышение уровня лимфоцитов, снижение нейтрофилов и частично моноцитов. В течение первых 2-х лет после экспериментального заражения ВИД наблюдали незначительное изменение количества и функциональных свойств моноцитов. Результаты этих опытов поддерживают гипотезу о способности B1V изменять функцию моноцитов in vitro при его достаточной концентрации и совпадают с выводами других авторов о том, что как J и другие лентивирусы, может инфицировать макрофаги. Авторы установили тенденцию к угнетению фагоцитарной активности через 4—8 месяцев после введения АГ. ВИД активирует экспрессию BIV in vitro и может служить вирусным кофактором, способным усиливать репликацию BIV in vitro и, возможно, увеличивать патоген-ность последнего.

По структуре генома, АГ - и эволюционным аспектам ВIVзанимает место в филогенетическом древе среди других лентивирусов.

Молекулярное клонирование R-29 и 2-х его клонов — R-29—127 и R-29—106 показало значительную структурную и генетическую гомологию между ВИД КРС и ВИЧ. Показано значительное генетическое сходство между B1V и вирусом болезни Джемб-рана (IDV), недавно открытого и относящегося к ретровирусам, вызывающего болезнь с острым летальным синдромом. Степень гомологии нуклеотидных последовательностей и набора аминокислот между BIV и ЮУсоставляетсоответственно74и 76 %, что обусловливает высокий уровень перекрестной активности между возбудителями. Метод ПЦР амплифицирован и секвенирован участок длиной 183 п. н. домена обратной транскриптазы области pol вируса иммунодефицита быка из лейкоцитов коров, природно инфицированных ВИБ. Степень идентичности всех последовательностей с молекулярным клоном R129—127 изолята R29 ВИБ превышает 91 % на нуклеотид-ном и 77 % на аминокислотном уровне. Фенотипы pol полиморфны в 14 % нуклеотидных сайтов. Отношение числа несинонимических и синонимических замен равно 0,16. Это показало, что изученная область генома ВИБ, как и в случае ВИЧ-1, подвергается очищающей селекции. Анализ методом МакДональда-Крейтмана показал, что эта область подвергалась позитивной дарвиновской селекции после дивергенции ВИЧ-1 и ВИБ от общего предка. Филогенетический анализ показал также, что генотипы ВИБ географически различны.

В процессе инфекции, в основном, синтезируются AT к двум наиболее важным иммунодоминантным белкам BIV: основному белку нуклеокапсида с мол. м. 26 кД (р26) и поверхностному гликопротеину ПО кД (gpllO). У коров, экспериментально инфицированных BIV, AT к р26 выявляли к 14-му дню после заражения, уровень их достигал максимума через 6—8 недель. AT к gp 110 выявляли значительно позднее, максимальный уровень их регистрировали через много месяцев после заражения.

Антисыворотка к р26 BIV перекрестно реагировала с р24 HJV-1, а антисыворотка к EJAV (анемия лошадей) обладала перекрестной активностью с р24 и р26 BIV. BIV-специфические AT реагировали с рекомбинантным белком вируса с мол. м. 53 кД (гр53). В препаратах нативного BIV содержание р26 значительно выше, чем gpllO. Для изучения роли нейтрализующих антител (HAT) в контроле репликации бычьего вируса иммунодефицита у коров, экспериментально зараженных изолятом R29 БВИ, разработан метод анализа вирусной нейтрализации. У всех животных появлялись HAT, однако корреляция между титром HAT и ограничением репликации БВИ не на-блюдатась. Заражение БВИ не индуцировало высокого титра НАГ. Генетич. сравнение гомогенного препарата БВИ, использованного для инокуляции, и вирусов, выделенных из зараженных коров, обнаружило ограниченную вариацию БВИ in vivo на протяжении 4 лет, не связанную с селекцией вариантов. Таким образом, в отсутствие литической репликации БВИ и выраженной клинической болезни не наблюдается селекция вирусных вариантов, что приводит к антигенной и генетической стабильности БВИ во время длительной персистентной инфекции.

Вирус HIV реплицируется в культуре клеток селезенки плода КРС, легких, тимуса, тестикул, почки с образованием синцития. Он может инфицировать диплоидные и анеуплоидные клетки собаки, хорька и овцы. После 1969 г. R-29 многократно пассировали и легко адаптировали к росту в клеточной культуре тимуса собаки. Этот изолят многие ученые широко используют в качестве референтного штамма BIV.

Два новых изолята вируса выделили от BIV/BLV-серопозитивных коров во Флориде. Они отличались от референтного R-29 по репликации и степени формирования синцития в культуре клеток легких эмбриона КРС. Они имели 92,6—93,6 % гомологии с нуклеотидной последовательностью клона R-29—127.

У телят, зараженных R-29, вирус выделялся через 8 недель и в двух случаях спустя 12 недель после заражения. У всех животных регистрировали лимфопролифератив-ную реакцию, которая выражалась в значительном увеличении лимфоузлов и умеренном лимфоцитозе, включая лимфопролиферацию и нейтропению без развития явных признаков болезни в течение короткого промежутка времени. При определении степени воздействия В1Уна клетки иммунной системы in vivo с использованием различных тестов показано, что BIV не вызывает иммуносупрессию и гистопатологические изменения в организме. При экспериментальном заражении коров полевыми изоля-тами B1V, выделенными во Флориде, регистрировали только незначительный лимфоцитоз. Аналогичные результаты получили Y. Browlie и др. Ни у одного животного, в организме которых более 3 лет присутствовал BIV, не наблюдалось развития клинических признаков болезни после их экспериментального заражения. Сделали вывод о том, что невозможно ожидать проявления патогенного действия BIV до окончания инкубационного периода, который может составлять 3—5 лет. На модели новозеландских кроликов изучены свойства ранней и хронической инфекции бычьим вирусом иммунодефицита. Лентивирус БВИ генетически связан с вирусом иммунодефицита человека. Он вызывает у кроликов утрату аппетита, потерю массы, мышечную слабость, понос, понижение чувствительности, кривошеесть. Выявлена рецидивирующая дисфункция Т - и В-лимфоцитов, лимфоаденопатия, спленомегалия. Болезнь развивается также, как при инфекциях ВИЧ, вирусами иммунодефицита обезьян и кошек.

Таким образом, БВИ вызывает у кроликов те же нарушения иммунной системы, что вызывают другие вирусы иммунодефицита у естественных хозяев. У коров, инфицированных изолятом вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BHCFL112) выявлялись антитела против трансмембранного гликопротеина вируса в течение 4 недель с пиком между 10-й и 30-й неделями и у большинства животных сохранялись до 50 недель наблюдения. Антитела реагировали в твердофазном иммуноферментмом анализе с линейным и циклическим пептидами со структурными характеристиками общими с иммунодоминантным регионом других лентивирусов. В разработанном тесте сыворотки всех коров реагировали с пептидами BMCflm2 или BHCr29-

В настоящее время нельзя считать BIV патогенным агентом для человека. Он не инфицирует клетки С8166 (наиболее чувствительные для HIV-1, HIV-2, SIV) и не вызывает ЦПД. Попытки инфицировать вирусом первичные клеточные культуры человека оказались неудачными. При исследовании сыворотки крови от HIV-инфицированных пациентов перекрестная активность AT к HIVc BIV-специфическими АГ отсутствовала. У сотрудников лабораторий, имевших повреждения кожи при работе с BIV-материалом, AT не обнаружили.

Механизм передачи В1Уне изучен, возможно он подобен таковому у HIV, который передается горизонтально и вертикально. Установлено, что ВIV, как и HIV сохранялся в сперме инфицированных быков-производителей при криоконсервации и, вероятно, поражает коров при искусственном осеменении. При помощи ПЦР выявили BIV в лимфоцитах крови и молока, что, возможно, способствует инфицированию телят секретами молочной железы.

У молочных коров в Миссисипи зарегистрировали взаимосвязь между возрастом и процентом серопозитивных животных. 20 % коров исследованного молочного стада в возрасте 3—4 лет являлись BIV-серопозитивными, причем с возрастом количество их увеличивалось и достигало 50 % (в группе до 6 лет), 60 % (старше 6 лет) и 70 % (7—10 лет) от числа обследованных. При этом у серопозитивных животных 3—4-летнего возраста общее количество лейкоцитов было в норме и уменьшалось у аналогичных коров в возрасте 7—10 лет.

Колотвин Вячеслав Васильевич. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота: индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации : индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации : дис. . канд. биол. наук : 03.00.23, 16.00.03 Москва, 2007 114 с. РГБ ОД, 61:07-3/618

Содержание к диссертации

Обзор литературы 9

1.1 Краткая историческая справка 9

1.2 Классификационное положение ВБИ 11

1.3 Особенности строения и жизненного цикла ретровируса 12

1.4 Морфология и физико-химические свойства ВБИ 24

1.5 Организация генома и репликация ВБИ 26

1.6 Структурные белки ВБИ 28

1.7 Культивирование ВБИ 29

1.8 Выявление ВБИ полимеразной цепной реакцией 30

1.9 Эпизоотология ВБИ 32

1.10 Клинические симптомы и патогенез ВБИ - инфекции 34

1.11 Пути передачи ВБИ 36

1.12 Антигенная активность ВБИ 36

Собственные исследования 39

2 Материалы и методы 39

2.1 Образцы цельной крови КРС 39

2.2 Образцы мышечной ткани КРС 40

2.4 Получение первичной культуры клеток (FBL) 41

2.5 Забор цельной крови КРС и выделение ДНК 42

2.6 Подбор праймеров к геному провируса ВБИ 47

2.7 Постановка ПЦР 49

2.9 Секвенирование продуктов ПЦР 52

Результаты исследований 53

1 Подбор ДНК-мишени и конструирование праймеров для идентификации ДНК ВБИ методом ПЦР 53

2 Сравнительный анализ методов выделения ДНК из цельной крови КРС 55

3 Оптимизация процесса амплификации 56

4 Получение инфекционного вируса иммунодефицита КРС 59

5 Апробация чувствительности и специфичности сконструированной тест-системы ПЦР 61

6 Выявление распространенности ВБИ КРС в стадах Московского региона 63

7 Выявление распространенности ВБИ КРС в стадах Ставропольского края 65

8 Результаты секвенирования продуктов ПЦР 67

Практические предложения 79

Список литературы 80

Приложение 1 (Методические рекомендации по диагностике инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита КРС с помощью ПЦР) 100

Введение к работе

Вирус иммунодефицита КРС относится к семейству Retroviridae и роду Lentivirus, который включает также вирусы иммунодефицита человека, кошек, обезьян, вирус инфекционной анемии лошадей, вирусы артрита -энцефалита коз и мэди-висна овец (Van Regenmortel et al 2000). Особое внимание к вирусу бычьего иммунодефицита вызвано его филогенетической близостью к вирусу иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), что позволяет использовать ВБИ в качестве удобной модели для изучения иммунодефицитных состояний животных и человека (Gonda et al 1987).

Впервые ВБИ был выделен из крови коровы с повышенным лимфоцитозом, прогрессирующей слабостью и истощением (Van der Maaten et al 1972). При экспериментальном заражении телят у них появлялись противовирусные антитела и развивалась гиперплазия лимфатических узлов. Вирус бычьего иммунодефицита, встречается во многих странах мира и часто сопутствует другой ретровирусной инфекцией, вызываемой вирусом бычьего лейкоза (ВБЛ) (Carpenter et al 1992, Meas et al 2003, Usui et al 2003, Snider et al 2003).

Эпизоотологическая обстановка по ВБЛ-инфекции в нашей стране хорошо изучена, разработаны методы диагностики и внедрены эффективные системы противолейкозных мероприятий (Гулюкин и др. 2005, Бурба, Шишков и др. 1985, 1992.). Однако вирус бычьего иммунодефицита никогда не служил объектом исследования, а отсутствие диагностических систем не позволяло оценить степень распространения ВБИ среди крупного рогатого скота на территории Российской Федерации (Федоров, Верховский 1996).

Целью наших исследований была разработка диагностической тест-системы ПЦР и изучение распространения ВБИ в некоторых хозяйствах крупного рогатого скота на территории РФ.

- получить инфекционный вирус бычьего иммунодефицита;

создать видоспецифичные праймеры для выявления ДНК провируса ВБИ методом ПЦР;

оптимизировать процесс амплификации по температурному и временному профилю реакции;

- изучить специфичность и чувствительность разработанной тест- системы;

исследовать пробы крови крупного рогатого скота из различных хозяйств РФ на содержание провирусной ДНК ВБИ;

исследовать пробы мяса на содержание провирусной ДНК ВБИ.

Разработана ПЦР-тест-система для идентификации провирусной ДНК вируса бычьего иммунодефицита в крови крупного рогатого скота. Подобраны видоспецифичные праймеры для идентификации ДНК провируса вируса бычьего иммунодефицита. Получена клеточная линия легкого эмбриона быка (FBL), пригодная для размножения инфекционного ВБИ. Получен инфекционный ВБИ, соответствующий референтному штамму R-29. Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-системы. Проведено исследование крови крупного рогатого скота из нескольких животноводческих хозяйств на содержание провирусной ДНК. Впервые на территории Российской Федерации выявлены животные, инфицированные ВБИ. Проведена сравнительная оценка распространенности вирусов бычьего иммунодефицита и бычьего лейкоза в стадах Московской области и Ставропольского края. Показано, что варианты вируса иммунодефицита, циркулирующего в хозяйствах нашей страны, отличаются от стандартного штамма вируса R-29 по гену рої. Проведено исследование партий импортного говяжьего тримминга, полученных из стран Восточной Европы, Евросоюза, Южной Америки и показана возможность выявления ДНК-провируса ВБИ в образцах мяса КРС.

Результаты научных исследований были использованы при разработке методических рекомендаций по диагностике инфекции, вызванной ВБИ с помощью полимеразной цепной реакции (Утверждены академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М.Смирновым 07.12.2006 г.). Разработан диагностический набор для выявления провирусной ДНК ВБИ методом полимеразной цепной реакции.

Публикации по диссертационной работе и апробация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Результаты работы доложены: на молодежной международной школе-конференции молодых ученых "Биотехнология будущего" Симпозиума "ЕС-Россия: Перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе" (Санкт-Петербург, 2006); на международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006); на международной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения" (Москва, 2005 г.). Результаты работы доложены и обсуждены на заседании секции инфекционной патологии животных отделения ветеринарной медицины РАСХН 1 ноября 2006 года.

Особенности строения и жизненного цикла ретровируса

При копировании содержащейся в вирионе 70S РНК затравкой для синтеза ДНК служат клеточные тРНК, прочно связанные с вирусной РНК (Van Regenmortel 2000). Затравка (тРНК) присоединена к геномной 35S-PHK на расстоянии примерно 135 нуклеотидов от ее 5 -конца в регионе PBS. тРНК-затравка связывается специфично и с большой степенью сродства не только с 35S-PHK, но и с обратной транскриптазой. Поэтому обратная транскриптаза — это в высшей степени специализированная ДНК-полимераза, назначение которой состоит в инициации синтеза ДНК при ее связывании со специфической затравкой, которая в свою очередь связана со специфическим участком РНК-матрицы (Wooley, Bircher, Smith 1998). Конечным продуктом реакции, катализируемой обратной транскриптазой in vitro, является полная ДНК-копия вирионной 35S-PHK, дополненной по концам длинными прямыми повторами (LTR), отсутствующими в вирионной РНК.

Процесс обратной транскрипции начинается с З -конца 35S-PHK, к которому в области pbs присоединена тРНК, служащая затравкой для начала работы реверсной траскриптазы (Nagy, Bujarski 2000).

Конечная ДНК выделенная из вирусного генома содержит длинные терминальные повторы, составленные из последовательностей с 3 и 5 концов вирусной РНК - фланкирующих R-LTR-последовательности (Van Regenmortel et al, 2000) По информационному содержанию ДНК-вариант генома ретровируса отличается от РНК-варианта только тем, что ДНК содержит не короткие концевые повторы, а длинные концевые повторы LTR (Pallansch, Lackman-Smith, Gonda 1992). LTR-последовательности (long terminal repeats) включают в себя последовательности STR, являющиеся одним из вариантов минисателлитных последовательностей. Это тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы в геноме животных, которые стабильно наследуются и обладают высоким уровнем полиморфизма. Подобно другим повторам, STR обычно встречаются в не кодирующих частях генов. Обнаружена группа структурных генов, несущих тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых частях генов.

Возникновение LTR очень важно для экспрессии вирусных генов. Они содержат вирусные регуляторные транскрипционные элементы: промотор, энхансер, и другие. Например, некоторые вирусы содержат элементы, определяющие зависимость вирусной транскрипции от наличия определенных гормонов. LTR и являются теми регуляторными сигналами, которые вирус использует для эксплуатации клеточной транскрипционной машины в своих целях. Находясь в составе геномной ДНК, вирусные гены транскрибируются под контролем LTR (Bieniasz, Grdina, Bogerd et al 1999).

Забор цельной крови КРС и выделение ДНК

В пробирки объемом 2 мл вносили 0,5 мл стабилизированной и гомогенизированной встряхиванием крови и добавляли 1,5 мл деионизованной воды. Гемолиз эритроцитов проводили при комнатной температуре в течение 20 минут. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут. Супернатант сливали и к осадку добавляли в пробирку 1 мл физиологического раствора. Раствор гомогенизировали путем встряхивания пробирок на аппарате вортекс ВП2 до полного суспензирования осадка в физиологическом растворе. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут. Растворение осадка в физиологическом растворе с последующим центрифугированием повторяли трижды. К сухому осадку добавляли по 0,3 мл буфера. Освобождение ядерной ДНК от остатков ядер и других мембран проводили с помощью детергентов и протеолитического фермента протеиназа К при температуре +37С в течение 1,5 часов. Пробу ДНК смешивали с равным объемом фенола. Содержимое перемешивали до образования эмульсии. Пробы центрифугировали 3 мин при 16000 об/мин при комнатной температуре. Верхний водный слой переносили в чистую пробирку. В каждую пробу добавляли 5М раствор NaCl до концентрации 100 мМ. Добавляли в каждую пробу по 3 мкл тРНК (10 мг/мл). В каждую пробу вносили двойной объем этанола 96 % . Пробы инкубировали при низкой температуре (-20С) в течение 30 - 60 мин для осаждения ДНК. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 6 минут. Супернатант сливали, осадок промывали этанолом 70%. Осадок высушивали при комнатной температуре, растворяли в 15-50 мкл деионизованной воды. Растворение ДНК проводили при комнатной температуре в течение 1-3 часов. Раствор ДНК хранили при температуре +4 С (в случае использования в течение 1-3 дней) или - 20 С (для длительного хранения).

Подбор праймеров к геному провируса ВБИ Из представленных в базах данных EMBL, GenBank и DDBJ была создана подбаза, содержащая все известные данные о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВБИ. Следующим шагом было множественное выравнивание участков генома выбранных изолятов с помощью пакета прикладных программ LaserGene MegAlign_v6. Оценку вариабельности выбранных последовательностей ДНК и поиск консервативных участков для конструирования видоспецифичных праймеров осуществляли в режиме online с помощыо системы ClastalW Multi Sequence Alignment. При анализе генома ВБИ были обнаружены высококонсервативные участки в генах gag и рої, на основании которых были подобраны специфические праймеры. Праймеры, синтезированные на синтезаторе ASM - 102 ("Биоссет", Новосибирск) и очищенные посредством электрофореза в ПААГ, были получены от фирмы "Синтол" (Россия). Термодинамический анализ праймеров и ампликонов был произведен с помощыо программы Oligo.

Подбор ДНК-мишени и конструирование праймеров для идентификации ДНК ВБИ методом ПЦР

В настоящее время для диагностики лентивирусных инфекций применяют серологические методы и метод полимеразной цепной реакции. Выбор методики обнаружения ВБИ зависит от возможностей лаборатории и задач, стоящих перед исследователями. Одним из наиболее распространенных методов серологической диагностики ВБИ является Вестерн - блот (Whetstone et al 1990; Carpenter et al 1992; Jacobs et al 1992; Meas et al 1998; Usui et al 2003). Метод Вестерн - блота позволяет выявлять антитела сразу к нескольким антигенам ВБИ (gplOO, р32, р26, р19, р16 и р13). Метод иммуноферментного анализа для диагностики ВБИ (Isaacson JA et al. 1998) и индикация ВБИ на основе реакции иммунофлюоресценции (Orr et al 2003) используются существенно реже, что объясняется отсутствием стандартных реагентов для этих методик. При создании серологических тест-систем необходимо обладать вирусным антигеном, который можно получить из культуры клеток, зараженных инфекционным ВБИ или трансфицированной плазмидой, содержащей полный геном ВБИ. Антиген может быть получен также путем экспрессии вирусных генов в бактериях с помощью генно - инженерных подходов. При инициации исследования по распространению ВБИ - инфекции возникает необходимость в создании чувствительного и специфичного метода обнаружения ВБИ, позволяющего выявить непосредственно вирус (а не антитела) в крови животного или в культуре клеток. Наиболее универсальным методом обнаружения вирусов в биологических объектах на данный момент является полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая идентифицировать провирусную ДНК вируса. Кроме того, несомненным преимуществом ПЦР является возможность обнаружения провируса ВБИ в разнообразных физиологических жидкостях животных (кровь, сперма, молоко, мышечная ткань и т.д.) и культуре клеток инфицированных ВБИ. С помощью ПЦР возможна диагностика инфекции на ранних стадиях развития, до возникновения антительного ответа.

Благодаря своим очевидным преимуществам ПЦР используется практически всеми исследователями, занимающимися диагностикой ВБИ вне зависимости от использования других методов диагностики и источников исследуемого материала. Так, ПЦР используется для подтверждения инфекционного статуса животного, полученного при использовании серологических методов обнаружения ВБИ (Meas et al 1998; Meas et al 2000; Usui et al 2003; Meas et al 2003; Meas et al 2004); при исследовании возможности вертикальной передачи ВБИ (Meas S. Et al 2002); при установлении нуклеотидных последовательностей различных генотипов ВБИ, полученных из разных стран (Carpenter et al 2000; Patil et al 2003); при исследовании тропизма ВБИ к различным клеткам и органам КРС (Wu et al 2003), для установления способности ВБИ преодолевать межвидовые барьеры и инфицировать клетки других млекопитающих (Pifat et al 1992).

Ключевым моментом при создании тест - системы ЦПР является подбор олигонуклеотидных зондов (праймеров), функция которых состоит в специфическом образовании водородных связей с ДНК-мишенью. Подбор праймеров, как правило, осуществляется с использованием мировых баз данных EMBL, GenBank и DDBJ, содержащих все известные данные о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВБИ. На основании этой информации разными исследователями подбирались различные участки генома ВБИ, чтобы в последствие использовать их в качестве ДНК - мишени для праймеров. Как правило, исследователи находили несколько консервативных последовательностей в разных генах ВБИ (env, gag, рої) и впоследствии опробовали чувствительность и специфичность каждой подобранной пары праймеров (Patil et al 2003; Gonzalez et al 2000; Limanskaya et al 2005). Согласно публикациям, наиболее консервативые последовательности находили в разных участках генома ВБИ. Так, в ряде случаев наиболее удачными оказались праймеры: к гену pol (Meas et al 2004; Limanskaya et al 2005), к гену env (Carpenter et al 2000) и к гену gag (Patil et al 2003). В некоторых случаях также применялся двухраундный (гнездовой) ПЦР, позволяющий повысить чувствительность реакции (Gonzalez G. Et al 2001; Meas S. Et al 2004).

ИД КРС также зарегистрировали в Англии, Швеции, Коста-Рике, Венесуэле, Новой Зеландии и Австралии. Количество серопозитивных животных от здорового КРС составляло 1-7%. Однако в отдельных стадах у животных с хроническими болезнями оно достигало 50%. Из 64% ИД- серопози-тивных животных с лимфосаркомой, лимфоаденопатией и другими нарушениями - 74% были инфицированы ВЛКРС.

Клиническая картина и патологоанатомические изменения. Кроме данных о проявлении клинических признаков болезни у коров, инфицированных ИД совместно с ВЛКРС, в настоящее время нет документального подтверждения об инфекции, вызываемой вирусом ИД (ВИД) у естественно инфицированных животных (21,22).

Патогенез. При определении отдельных видов лейкоцитов отмечали повышение уровня лимфоцитов, снижение нейтрофилов и частично моноцитов. В течение первых 2-х лет после экспериментального заражения ВИД наблюдали незначительное изменение количества и функциональных свойств моноцитов (16). Результаты этих опытов поддерживают гипотезу о способности BIV изменять функцию моноцитов in vitro при его достаточной концентрации и совпадают с выводами других авторов о том, что как и другие лентивирусы, может инфицировать макрофаги. Авторы установили тенденцию к угнетению фагоцитарной активности через 4-8 мес после введения АГ. ВИД активирует экспрессию BIV in vitro и может служить вирусным кофактором, способным усиливать репликацию BIV in vitro и, возможно, увеличивать патогенность последнего (9).

ВИД КРС впервые изолировали в США в 1969 г. от коров с персистентным моноцито- зом, прогрессирующей слабостью и истощением. Этот изолят был обозначен как R29 (20).

Интерес к данному возбудителю возрос после выделения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV). Название “иммунодефицитоподобный вирус КРС” предложил в 1987 г. М. A.Gonda (11,12). В настоящее время, согласно рекомендациям международного комитета по таксономии вирусов, возбудитель носит название “вирус иммунодефицита КРС” (8). Данные секвенирования и серологического анализа показали, что BIV принадлежит к семейству Retroviridae и роду Lentivirus. К последнему, помимо BIV и HIV, относятся вирусы инфекционной анемии лошадей (EIAV), висны и маэди овец (MW), артрита-энцефалита коз (CAEV), иммунодефицита кошек (FIV) и иммунодефицита обезьян (SIV). С помощью клонирования определена нуклеотидная последовательность провируса (10). Молекулярная биология вируса ИД КРС обладала многочисленными параллелями с ВИЧ (11).

Морфология и химический состав. По структуре генома, АГ- и эволюционным аспектам BIV занимает место в филогенетическом древе среди других лентивирусов (11).

Антигенная вариабельность и родство. Молекулярное клонирование R-29 и 2-х его клонов - R-29-127 и R-29-106 показало значительную структурную и генетическую гомологию между ВИД КРС и ВИЧ. Показано значительное генетическое сходство между BIV и вирусом болезни Джембрана (IDV) недавно открытого и относящегося к ретровирусам, вызывающего болезнь с острым летальным синдромом (4, 13). Степень гомологии нуклеотидных последовательностей и набора аминокислот между BIV и IDV составляет соответственно 74 и 76%, что обусловливает высокий уровень перекрестной активности между возбудителями.

Антигенная активность. В процессе инфекции, в основном, синтезируются АТ к 2 наиболее важным иммунодоминантньм белкам BIV: основному белку нуклеокапсида с мол.м. 26 кД (р26) и поверхностному гликопротеину 110 кД (gpllO). У коров, экспериментально инфицированных BIV, АТ к р26 выявляли к 14-му дню после заражения, уровень их достигал максимума через 6-8 нед. АТ к gpllO выявляли значительно позднее, максимальный уровень их регистрировали через много месяцев после заражения (21, 22).

Антисыворотка к р26 BIV перекрестно реагировала с р24 HJV-1, а антисыворотка к EJAV (анемия лошадей) обладала перекрестной активностью с р24 и р26 BIV (12, 21). BIV- специфические АТ реагировали с рекомбинантным белком вируса с мол.м. 53 кД (гр53). В препаратах нативного BIV содержание р26 значительно выше, чем gpl 10 (17,18,19).

Культивирование. Вирус HIV реплицируется в культуре клеток селезенки плода КРС, легких, тимуса, тестикул, почки с образованием синцития (2, 12). Он может инфицировать диплоидные и анеуплоидные клетки собаки, хорька и овцы. После 1969 г. R-29 многократно пассировали и легко адаптировали к росту в клеточной культуре тимуса собаки. Этот изолят многие ученые широко используют в качестве референтного штамма BIV.

Два новых изолята вируса выделили от BIV/BLV-серопозитивных коров во Флориде. Они отличались от референтного R-29 по репликации и степени формирования синцития в культуре клеток легких эмбриона КРС. Они имели 92,6-93,6% гомологии с нуклеотидной последовательностью клона R-29-127 (17,18,19).

Экспериментальная инфекция. У телят, зараженных R-29, вирус выделялся через 8 нед и в 2-х случаях спустя 12 нед после заражения. У всех животных регистрировали лим- фопролиферативную реакцию, которая выражалась в значительном увеличении лимфоузлов и умеренном лимфоцитозе, включая лимфопролиферацию и нейтропению без развития явных признаков болезни в течение короткого промежутка времени (6, 7). Эти же авторы при определении степени воздействия BIV на клетки иммунной системы in vivo с использованием различных тестов показали, что BIV ие вызывает иммуносупрессию и гистопатологиче- ские изменения в организме. При экспериментальном заражении коров полевьми изолята- ми BIV, выделенными во Флориде, регистрировали только незначительный лимфоцитоз (19). Аналогичные результаты получили Y. Browlie и др. (3). Ни у одного животного, в организме которых более 3-х лет присутствовал BIV, авторы не наблюдали развития клинических признаков болезни после их экспериментального заражения.

Они сделали вывод о том, что невозможно ожидать проявления патогенного действия BIV до окончания инкубационного периода, который может составлять 3-5 лет.

В настоящее время нельзя считать BIV патогенньм агентом для человека. Он не инфицирует клетки С8166 (наиболее чувствительные для HIV-1, HIV-2, SIV) и не вызывает ЦПД.

Попытки инфицировать вирусом первичные клеточные культуры человека оказались неудачными. При исследовании сыворотки крови от HIV-инфицированных пациентов перекрестная активность АТ к HIV с BIV-специфическими АГ отсутствовала. У сотрудников лабораторий, имевших повреждения кожи при работе с BIV-материалом, АТ не обнаружили. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источники и пути передачи инфекции. Механизм передачи BIV не изучен, возможно он подобен таковому у HIV, который передается горизонтально и вертикально. Установлено, что BIV, как и HIV сохранялся в сперме инфицированных быков-производителей при криоконсервации и, вероятно, поражает коров при искусственном осеменении (14,15). Эти же авторы, используя ПЦР, выявили BIV в лимфоцитах крови и молока, что, возможно, способствует инфицированию телят секретами молочной железы (1).

У молочных коров в Миссисипи зарегистрировали взаимосвязь между возрастом и процентом серопозитивных животных (5). 20% коров исследованного молочного стада в возрасте 3-4 лет являлись BIV-серопозитивными, причем, с возрастом количество их увеличивалось и достигало 50% (в группе до 6 лет), 60% (старше 6 лет) и 70% (7-10 лет) от числа обследованных. При этом у серопозитивных животных 3-4-летнего возраста общее количество лейкоцитов было в норме и уменьшалось у аналогичных коров в возрасте 7-10 лет. ДИАГНОСТИКА

В настоящее время широко используют высокочувствительные и специфические диагностические тесты, направленные на идентификацию BIV или выявление АТ к нему. К первым относится ПЦР, ко вторым - иммуноблоттинг, непрямые варианты ИФА и ИФ. BIV- антигены, в отличие от антигенов других представителей лентивирусов, не взаимодействуют со специфическими АТ в реакции преципитации.

Выделение BIV, его структурное и генетическое сходство с HIV затрагивает вопрос о его роли в патологии животных и человека.

Считать BIV патогенным пока преждевременно, хотя возможно, что BIV, подобно HIV и другим лентивирусам, может вызывать заболевание у инфицированных животных. В то же время BIV может играть и незначительную роль в патологии КРС или быть сопутствующим фактором, усиливающим клиническое проявление других болезней, например лейкоза (табл. XI. 10.).

С помощью ПЦР амплифицирован фрагмент в 235 пар оснований высококонсервативного участка гена pol вируса ИД КРС при использовании ДНК лейкоцитов крови и молока серопозитивных коров. Амплификации этого фрагмента не отмечали у серонегативных коров. Эти данные подтверждают наличие и возможность идентификации ВИД КРС в молоке и указывает на потенциальную возможность лактогенной его передачи (15).

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА Не изучены.

:2. 9.Geng Y. et.al. Virol, 1992 :187. lO.Corvey K.J. et.al. Virol., 1990 :175. U.Gonda M.A. et.al. Food Microbiol, 1994, 2 :149. 12.Gonda M.A. et.al. Nature, 1987, 330. 13.Kertayandya G. et.al. J Gen Virol., 1993 :74. 14.Nash J.W. et.al. Am J Vet Res, 1995, 56 : 5. 15.Nash J.W. et.al. Am J Vet Res, 1995, 56, 4 :445. l?.Rovid A.H. et.al. Vet Imm Immunopath, 1995, 45 :1. 17.Suares D.L. et.al. J Virol, 1993, 67 :8. 18.Suares D.L. et.al. Am J Vet Res, 1995, 56 :55. 19.Suares D.L. et.al. Am J Vet Res, 1995, 56 :5. 20.VanDer Maaten M.J. et.al. J Nath Cancer Inst, 1972 :49. 21.Whetstone C.A. et.al. Arch Virol, 1991 :116. 22.Whetstone C.A. et.al. J Virol, 1990 :64. Таблица XI.

8 Повышенное количество лейкоцитов.

(12 -18 тыс/мкл) Количество сероположительных животных, % легальности 13-52% сероположительных животных в неблагополучных по лейкозу стадах. У 0,5-5% развивается опухолевая форма 4-16% сероположительных животных в странах с развитым животноводством. Пути выделения, передача вируса Присутствует в лейкоцитах молока и молозива инфицированных коров. Основной путь передачи - ятротенный. Имеет место передача вируса через плаценту, а также с молоком и молозивом. Предположительно во многих параметрах сходны с BLV. Лабораторная диагностика РСК, РИФ, РИП, ELISA и др. Но наиболее распространённой в практике стала РИД ELISA с различными видами антигена, иммуноблот, РИФ. Штаммы, изоляты Клеточно-ассоциированный nrr. FLK- BLV (США) R-29 (США, штат Айова) FL-491 (США, штат Флорида) Культивирование BLV может инфицировать in vitro клетки КРС и мелкого рогатого скота, человека, обезьяны, лошади, летучей мыши, линию клеток FLK-BLV и ТЭК-МВА, 76 (тимус эмбриона коровы) Первичные культуры клеток эмбриона коровы - лёгкого, селезёнки, роговицы, клеточные линии других животных - тимус собаки, эпидермальные клетки плода кролика

Иммунодефициты молодняка крупного рогатого скота и их коррекция

Жизнь ставит перед ветеринарной наукой и практикой все новые сложные задачи. В животноводстве растет падеж молодняка, участились случаи распространения хронических инфекционных заболеваний до масштабов экологического бедствия. Это обусловлено несовершенством диагностики, недостаточным уровнем профилактики болезней, снижением иммунобиологической реактивности организма (особенно у молодых животных).

Патология, в развитии которой важное место занимает снижение иммунобиологического статуса, получила название иммунодефицитных состояний (ИДС). Их можно разделить на две большие группы: первичные и вторичные.

Под ИДС первичного происхождения следует понимать генетически обусловленную неспособность организма продуцировать то или иное звено иммунного ответа. Первичные иммунодефициты называют также врожденными, так как они обычно имеют четко выраженный наследственный характер. Факторами, способствующими развитию первичных иммунодефицитов, являются сложная экологическая обстановка и отсутствие жесткой селекции на устойчивость животных к различным заболеваниям. В результате, для воспроизводства стада используются особи с низким иммунобиологическим статусом, генетически закрепляются несовершенства иммунной системы и рождаются животные с врожденными ИДС.

Вторичные иммунодефициты возникают и развиваются после определенного воздействия, способного нарушить функционирование иммунной системы, поэтому их называют еще приобретенными.

У 90% новорожденных телят регистрируется дефицит В-звена иммунитета. Перевод телят на другой режим выращивания при перегруппировке всегда сопровождается стрессом, который приводит к дефициту Т-системы иммунитета. Внедрение на этом фоне вирусной и бактериальной микрофлоры ведет к заболеваниям. Молозивный иммунодефицит наблюдается во всех хозяйствах, но особенно часто - в хозяйствах с низкой культурой ведения животноводства, где грубо нарушается технология получения и выращивания телят.

Большинство заболеваний сопровождается различными нарушениями функционирования иммунной системы. Основные факторы, приводящие к этому, - недостаток кормов, отдельных витаминов и микроэлементов; инфекции, микотоксины, химиотерапевтические вещества, гербициды, инсектициды, стрессы различной этиологии.

Для выявления ИДС используют определение различных групп клеток (в том числе и иммунокомпетентных) по лейкоформуле; содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови; уровня фагоцитарной активности эффекторных клеток и других показателей неспецифической резистентности организма. В практике ветеринарной медицины для диагностики ИДС у новорожденных животных предложено определять соотношение подклассов иммуноглобулина G-G1, G2

В ряде хозяйств Северо-Кавказского региона нами проведены исследования иммунологического статуса молодняка крупного рогатого скота.

У телок более старшего возраста (20-30 дней и 4-5 месяцев) дефицит отдельных звеньев иммунитета сохраняется, хотя и не так резко выражен. Уровень иммунокомпетентных клеток остается низким, также снижена и концентрация лизоцима в сыворотке крови.

Соотношение подклассов иммуноглобулина G резко отличается от нормы независимо от возраста животных.

Таким образом, у молодых животных имеет место дефицит факторов неспецифической резистентности, клеточного и гуморального иммунитета, сохраняющийся в течение пяти месяцев постнатального развития. Соответственно возникает необходимость коррекции иммунной системы и восстановления активности ее отдельных звеньев.

В современных условиях фармакология представляет широкий спектр иммуномодулирующих препаратов. Предпочтение следует отдавать веществам, которые обладают избирательным действием, способны корректировать нарушения иммунного гомеостаза. Этим критериям отвечают препараты, получаемые из органов иммунной системы животных, в частности Т- и В-активины.

Т-активин - это экстракт тимуса крупного рогатого скота, представляющий собой смесь полипептидов с молекулярной массой 1500-6000 дальтон, в продажу выпускается в форме стерильного 0,01%-ного раствора. Оказывает влияние на Т-систему иммунитета: повышает содержание общего белка и гамма-глобулиновой фракции, эритроцитов, гемоглобина и Т-лимфоцитов.

В-активин выделен из культуры клеток костного мозга свиней, имеет молекулярную массу 1000-3000 дальтон, представляет собой порошок белого цвета с желтоватым оттенком, выпускается во флаконах по 3 мг. Восстанавливает количественные и функциональные показатели В- и Т-систем иммунитета, стимулирует продуцирование антител и фагоцитов.

Нами были определены оптимальные дозы этих препаратов для коррекции ИДС и схема их применения. Установлено, что наиболее выраженное действие проявляется после трехкратного введения Т-активина в дозе 0,04 мл/кг массы тела и В-активина в дозе 6 мг новорожденным и 20-30-дневным телятам и 9 мг на животное с интервалом 24 часа - 4-5-месячным.

Применение этих иммуномодуляторов способствует повышению количества иммунокомпетентных клеток, нормализует соотношение G1- и G2-глобулинов, повышает фагоцитарную активность и другие показатели неспецифической резистентности. Стимулирующее влияние более выражено проявилось у животных младших возрастов, что, очевидно, связано с пластичностью иммунной системы. У 4-5-месячных телок эффект от использования препаратов был менее выражен.

Также заслуживает внимания влияние Т- и В-активинов на привесы подопытных животных. Среднесуточные привесы составили:

428 ± 19,4 г - контрольные животные;

428 ± 29,0 г - животные, которым применяли иммуномодуляторы в 4-5-месячном возрасте;

456 ± 6,3 г - животные, которым применяли иммуномодуляторы в 20-30-дневном возрасте;

547 ± 24,4 г - животные, которым применяли иммуномодуляторы в 1-3-суточном возрасте.

Роль Т- и В-активинов как низкомолекулярных пептидов связана с накоплением мононуклеарных клеток, особенно макрофагов, участвующих в первой стадии иммунного ответа как антигенпредставляющие клетки. Подтверждением может служить скорость наступления реакции иммуных органов на введение препаратов. Уже через сутки в крови возрастает содержание не только Т- и В-лимфоцитов, но и иммуноглобулинов.

Таким образом, для коррекции иммунодефицитных состояний у молодняка крупного рогатого скота с 1-3 суточного возраста можно рекомендовать природные иммуномодуляторы Т- и В-активины.

Читайте также: