Вирус классической чумы свиней наборы

Обновлено: 24.04.2024

5. БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ

5.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

УТВЕРЖДЕНЫ 30 декабря 1996 г., N 13-4-2/809

1. Общие положения

1.1. Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на:

- обнаружении антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в клетках мазков-отпечатков проб органов;

- выделении эпизоотического вируса КЧС из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) и его идентификации реакцией прямой иммунофлуоресценции;

- обнаружении специфических антител в сыворотках крови переболевших классической чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих микробляшек или реакцией непрямой иммунофлуоресценции;

- выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на животных.

Для постановки иммунофлуоресцентных реакций используют "Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней".

1.2. При проведении лабораторной диагностики руководствуются "Правилами работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях", утвержденными Министерством сельского хозяйства СССР 14 января 1975 г.

2. Схема проведения лабораторных исследований

2.1. Отбор проб органов и подготовка патологического материала для исследования.

2.2. Приготовление мазков-отпечатков для постановки реакции прямой иммунофлуоресценции и экстрактов проб исследуемых органов для инокуляции культуры клеток (проводится одновременно).

2.3. Постановка реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) с целью обнаружения специфического антигена вируса КЧС в мазках-отпечатках из проб органов. По положительным или отрицательным результатам реакции ставят предварительный диагноз.

2.4. Инокуляция культуры клеток РК-15 экстрактами суспензий проб исследуемых органов с последующей постановкой РПИФ для обнаружения и идентификации эпизоотического вируса КЧС.

2.5. Исследование сывороток крови свиней в реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РНФМ) или реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Серологические исследования проводят в тех случаях, когда пробы крови получены от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой (ретроспективные исследования из хозяйств, не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2 лет.

2.6. Постановку биопробы проводят только по указанию Департамента ветеринарии, когда при подозрении на КЧС на основании эпизоотологического обследования получены отрицательные результаты лабораторных исследований.

3. Отбор и подготовка проб к исследованию

3.1. Для исследования берут лимфатические узлы (подчелюстные и мезентериальные), части миндалин, селезенки, легкого, почки, кровь и костный мозг (из грудной или трубчатой кости) от 3. 5 животных, убитых в стадии агонии, или не позже чем через 2. 3 ч после гибели.

3.2. Пробы отбирают в стерильные флаконы массой 5. 10 г каждый, герметически укупоривают резиновыми пробками.

Флаконы снаружи обрабатывают 5%-ным раствором едкого натра или осветленным 20%-ным раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной тем же раствором, укладывают в полиэтиленовый пакет и помещают в термос со льдом. В случае длительной транспортировки (более 2 сут) пробы органов замораживают. Термос помещают в металлический контейнер, опечатывают и доставляют с нарочным в лабораторию с сопроводительным документом.

3.3. При ретроспективной диагностике направляют 5. 10 проб крови (по 5. 8 см) от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой. Кровь берут не ранее чем через 15. 20 сут после установления признаков болезни.

3.4. В лаборатории пробы селезенки, лимфатических узлов, легкого, почки каждого животного очищают от жировой и соединительной тканей и готовят по 2 мазка-отпечатка каждого органа для РПИФ. Для этого обезжиренные спирт-эфиром (1:1) покровные стекла укрепляют в расщепах деревянных палочек с условными номерами и делают мазок-отпечаток, прикладывая стекло к поверхности среза исследуемого органа (каждый отпечаток делается новым срезом органа). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе при комнатной температуре (30. 60 мин) и помещают в химический стакан с холодным (2. 4°С) ацетоном. Фиксацию проводят в камере бытового холодильника при (4±2)°С в течение 10. 15 мин. Затем мазки-отпечатки извлекают из ацетона, высушивают и используют для постановки РПИФ. Хранят мазки-отпечатки при (4±2)°С не более 3 сут.

Контрольные отрицательные мазки-отпечатки готовят заранее, используя пробы органов от здоровых животных.

3.5. Навески каждого органа (примерно по 2 г) отдельно растирают в ступке со стерильным порошком из стекла или песком и готовят 20%-ную суспензию на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Приготовленные суспензии дважды замораживают при -10. -12°С, оттаивают при 30. 37°С и центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 2500. 3000 об/мин в течение 10. 15 мин. Надосадочную жидкость (экстракт) отсасывают, вносят 100 ЕД/см пенициллина и 100 мг/см стрептомицина (конечная концентрация), выдерживают 1 ч при (37±0,5)°С и готовят разведения 1:5 и 1:10 на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Для инокуляции культуры клеток используют как исходные (неразведенные) экстракты, так и разведенные.

3.6. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают 1 ч в термостате при (37±0,5)°С или при комнатной температуре до образования сгустка. Сгусток обводят и пробы переносят в камеру бытового холодильника на 10. 14 ч. Сыворотку отсасывают и используют для исследования.

4. Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в мазках-отпечатках.

4.1. Содержимое ампулы ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС растворяют 0,5 см дистиллированной воды и готовят рабочее разведение препарата на 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе - ФСБ (приготовление буферного раствора в Приложении, п.1), указанное на ампуле.

4.2. Препараты мазков-отпечатков, приготовленные по п.3.4, помещают на капли ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС, нанесенные в рабочем разведении на края предметных стекол, находящихся во влажной камере, и выдерживают при (37±0,5)°С в течение 30 мин.

4.3. Препараты снимают с предметных стекол, ополаскивают ФСБ и свободными концами спичек укрепляют в гнездах отмывочного штатива. Штатив помешают в цилиндрическую банку с раствором ФСБ, установленную на магнитную мешалку. Отмывание мазков-отпечатков от несвязавшихся или неспецифически связавшихся ФИТЦ-иммуноглобулинов ведут в течение 20 мин в темном месте, сменяя буферный раствор через 10 мин.

4.4. После отмывания препараты ополаскивают дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и помещают на капли нефлуоресцирующего глицерина, разведенного раствором ФСБ в соотношении 9:1, нанесенные на прозрачные обезжиренные предметные стекла. Края препаратов заливают расплавленным парафином.

4.5. Люминесцентную микроскопию препаратов проводят в сине-фиолетовом свете при освещении их сверху, через объектив на микроскопах типа "ЛЮМАМ". Возбуждающий светофильтр ФС-1-2 или СС-15-2; запирающий ЖС-18+ЖЗС-19. Препараты последовательно просматривают при увеличении 7x10, 7x40 ("сухая" микроскопия), затем при необходимости в иммерсионной системе при увеличении 7x90, используя неразведанный нефлуоресцирующий глицерин.

4.6. Специфическую флуоресценцию учитывают в лимфоидных клетках паренхимы селезенки, лимфатических узлов, легкого, расположенных группами, а также в эпителиальных клетках миндалин и клетках эпителия почечных канальцев, расположенных группами. Флуоресценцию обнаруживают в виде яркого, зеленого, диффузного свечения цитоплазмы антигенсодержащих клеток.

4.7. Учет и оценка результатов.

Проводят по условной четырехкрестовой шкале при увеличении 5x40: (++++, +++, ++, +) обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с яркой зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат положительный; (±) обнаружение в 5. 10 полях зрения единичных групп, состоящих из 3. 5 клеток с зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат сомнительный; отсутствие в мазках-отпечатках клеток с цитоплазматической флуоресценцией. Свечение клеток тускло-зеленое - результат отрицательный.

Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учитывают.

5. БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ

5.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

УТВЕРЖДЕНЫ 30 декабря 1996 г., N 13-4-2/809

1. Общие положения

1.1. Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на:

- выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на животных.

2. Схема проведения лабораторных исследований

2.1. Отбор проб органов и подготовка патологического материала для исследования.

3. Отбор и подготовка проб к исследованию

3.2. Пробы отбирают в стерильные флаконы массой 5. 10 г каждый, герметически укупоривают резиновыми пробками.

Контрольные отрицательные мазки-отпечатки готовят заранее, используя пробы органов от здоровых животных.

4. Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в мазках-отпечатках.

4.7. Учет и оценка результатов.

Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учитывают.

5.2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

УТВЕРЖДЕНЫ 8 июня 1978 г., б/н

1. Общие положения

1.1. Лабораторная диагностика классической чумы свиней заключается в обнаружении в патологическом материале специфического антигена методом иммунофлуореоценции, реакции связывания комплемента (РСК), а также в постановке биологической пробы.

1.2. Лабораторный диагноз на классическую чуму свиней ставят на основании получения положительных результатов ИФ и РСК.

Окончательный диагноз устанавливается на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов лабораторного исследования.

1.3. Для лабораторной диагностики КЧС в лабораторию направляют патологический материал (кусочки печени, селезенки, подчелюстных, мезентеральных лимфоузлов), взятый от вынужденно убитых в агональном состоянии животных, у которых в течение 4. 5 дней отмечалось повышение температуры тела. Патологический материал в свежем или замороженном состоянии доставляют в лабораторию. Его можно хранить в замороженном состоянии в течение 8. 10 дней, материал от павших животных к исследованию не пригоден.

1.4. Метод иммунофлуоресценции и реакцию связывания комплемента для обнаружения специфического антигена в патологическом материале применяют при исследовании материала от невакцинированных свиней или от свиней, привитых вирус-вакциной против чумы за 30 и более дней до вынужденного убоя. В связи с этим в сопроводительной описи к патологическому материалу указывают дату последней вакцинации свиней.

2. Индикация антигена вируса классической чумы свиней в патологическом материале

2.1. Индикация антигена проводится с помощью реакции ИФ (прямой вариант и с применением контрастирующего красителя). Из патологического материала готовят мазки-отпечатки или гистологические срезы. Препараты подсушивают на воздухе и фиксируют метиловым спиртом в течение 3. 4 мин при комнатной температуре или смесью (1:1) метилового спирта и ацетона, предварительно охлажденной до -10. -20°С.

2.2.1. Оценка результатов. ИФ считается положительной при наличии в препаратах округлых клеток с ярко-зеленым свечением цитоплазмы или цитоплазмы и ядра. Специфическое свечение должно быть обнаружено в препарате не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом из них 3. 5 и более светящихся клеток.

Не учитывают свечения дегенеративно измененных клеток и лейкоцитов, которые отличают по структуре ядра и выраженной гранулярной флуоресценции цитоплазмы.

2.2.2. Для контроля специфичности свечения наносят на препараты специфическую к вирусу сыворотку с последующей окраской флуоресцирующей сывороткой, а также окрашивают препараты нормальной меченой сывороткой. В контрольных препаратах свечение не отмечается.

2.3. Реакция ИФ с применением контрастирующего красителя. На препараты наносят смесь флуоресцирующей сыворотки и раствора Эванса голубого (3 части сыворотки и 1 часть 0,25%-ного раствора синьки Эванса) и выдерживают при комнатной температуре во влажной камере в течение 10. 12 ч. Затем препарат погружают в подогретый до 60. 70°С 20%-ный раствор триэтиленгликоля на 30. 90 с до появления нежно-голубого оттенка, промывают, подсушивают, заключают в забуференный глицерин под покровное стекло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

2.3.1. Оценка результатов. Реакция ИФ считается положительной, если на оранжево-красном фоне препарата наблюдается светло-зеленое свечение цитоплазмы. Контрольные препараты дают красное свечение. Некротические участки ткани, клеточный детрит светятся зеленовато-желтым цветом, но они отличаются от специфического свечения отсутствием у них клеточной структуры.

2.4. Реакция связывания комплемента. Для обнаружения в патологическом материале КС-антигена готовят из растертых в ступке органов 20%-ную суспензию на забуференном физиологическом растворе с рН 7. Суспензию экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, затем трехкратно замораживают при температуре -20°С, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость вновь центрифугируют при 10000. 15000 об/мин в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость используют в РСК как испытуемый антиген.

2.4.1. Титрование гемолизина. Для титрования готовят основное разведение гемолизина 1:100 (0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора), а затем готовят все последующие разведения по схеме 1.

Классическая чума свиней (КЧС, чума свиней) — высококонтагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтеритическим воспалением толстого кишечника.

Первые описания болезни относятся к 1810 г. в Северной Америке, к 1822 г. во Франции, к 1833 г. в Германии. Позже ее регистрировали в Южной Америке и Южной Африке. В настоящее время она встречается повсеместно, за исключением США, Канады, Австралии, Исландии, Новой Зеландии, Норвегии, Швеции. Вирусную природу КЧС установили Швейниц и Дорсет в 1903 г.

Характеристика возбудителя. Вирус классической чумы свиней (ВКЧС) — PHK-содержащий; относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus. Геном вируса — односпиральная РНК положительной полярности. Он кодирует четыре структурных белка (три гликопротеина — VP1, VP2, VP3 и один капсидный белок — СР) и 3—7 неструктурных белков. Вирионы вируса диаметром 40—60 нм, с суперкапсидной оболочкой. Диаметр нуклеокапсида вириона 29 нм.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. В сыворотке крови больных животных вирус сохраняет активность при температуре 38 °С до 18—20 сут. Кипячение инактивирует его моментально. На стенах свинарников, на полях вирус остается вирулентным в течение года, а в свиных тушах при температуре минус 20—25°С — до 6 мес. Лучшие дезинфицирующие средства для него — 2%-ный раствор NaOH, раствор хлорной извести 1 : 20 и 3—6%-ное крезоловое масло.

Антигенная вариабельность. По вирулентности различают А-, В-, С-варианты вируса. К варианту А относят вирулентные эпизоотические штаммы, вызывающие у свиней всех возрастов остропротекающую болезнь. Вирусы варианта В вирулентны только для поросят, и при циркуляции в стаде вызывают атипичную или хроническую чуму. К варианту С относится американский слабовирулентный штамм.

Антигенная вариабельность вируса не установлена. В то же время имеется антигенное различие среди штаммов ВКЧС. Установлено одностороннее родство между вирусами КЧС и диареи крупного рогатого скота: антитела к вирусу диареи нейтрализуют ВКЧС, но антитела к вирусу КЧС не нейтрализуют вирус диареи.

Антигенная активность. В сыворотке свиней-реконвалесцентов обнаруживают вируснейтрализующие и комплементсвязывающие антитела. Вируснейтрализующие антитела достигают максимума через 3—4 нед после инфицирования или иммунизации и сохраняются более года.

Культивирование вируса. В лаборатории его можно довольно легко проводить на неимунных свиньях. Однако это дорого и небезопасно. Лабораторные животные к ВКЧС невосприимчивы. В то же время возможна адаптация вируса к организму кролика.

ВКЧС удается репродуцировать в первичной культуре клеток легких, селезенки, почки, тестикул и лейкоцитов свиней, однако без выраженного ЦПД. В перевиваемой линии клеток почки поросенка (РК-15) размножение вируса сопровождается проявлением ЦПД. Для репродукции вируса оптимальной является температура 39 °С. В случае отсутствия ЦПД инфекционная активность вируса может быть определена с помощью РИФ методом флуоресцирующих бляшек, учета негативных колоний под агаровым покрытием, с помощью феномена экзальтации вируса ньюкаслской болезни. Для промышленного выращивания вируса может быть использована перевиваемая линия клеток почки эмбриона кролика (ПЭКр).

Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства. У ВКЧС они не установлены.

Клинические признаки. Инкубационный период в зависимости от вирулентности вируса и резистентности животного длится 3—9, иногда до 20 дней. Болезнь может протекать сверхостро, остро, подостро и хронически.

Сверхострое течение болезни наблюдают редко и у молодых животных. Оно характеризуется повышением температуры тела до 41—42°С, угнетением, отсутствием аппетита и рвотой, появлением ярко-красных пятен на коже. Гибель наступает через 1 —2 дня.

Острое течение помимо наблюдаемых при сверхостром течении неспецифических признаков болезни сопровождается запором, затем поносом, а также слизисто-гнойным ринитом. На коже живота, внутренней поверхности бедер, шеи и в основании ушных раковин появляются пустулы, заполненные желтоватым экссудатом. Позже на коже можно видеть точечные кровоизлияния, сливающиеся затем в темно-багровые пятна и не исчезающие при надавливании. Дыхание затрудненное, учащенное; в результате сердечной недостаточности пятачок, ушные раковины, кожа живота и конечностей приобретает синюшную окраску. Развивается лейкопения. Больные животные погибают на 7—10-й день.

При остром течении болезни нередко наблюдают нервную форму с судорожными сокращениями групп мышц, манежными движениями, параличами задних конечностей, нервным возбуждением и гибелью через 1—2 дня.

Подострое течение нередко бывает после острого переболевания. При этом болезнь длится до трех недель, иногда животные выздоравливают. Состояние свиней отягощается наслоением вторичных бактериальных инфекций: сальмонеллеза и пастереллеза. В случае осложнения чумы сальмонеллезом вторичные поражения наблюдают в желудочно-кишечном тракте (кишечная форма чумы). Запор сменяется поносом. Животные худеют и гибнут.

Осложнение чумы пастереллезом ведет к развитию легочной формы чумы, сопровождаемой кашлем, признаками бронхопневмонии и заканчивающейся, как правило, гибелью животного.

Хроническое течение болезни наблюдается в течение нескольких месяцев. Проявляется оно тяжелым крупозно-дифтероидным поражением желудочно-кишечного тракта, гнойно-фибринозным воспалением легких и плевритом. Поносы сменяются запорами, прогрессирует исхудание. Температура тела повышена. Осложнение вторичными инфекциями (сальмонеллезом и пастереллезом) ведет к обострению болезни и гибели животного. Возможны аборты, мертворождаемость. Плоды заражаются через плаценту, и у поросят развивается хронически протекающая болезнь с гибелью в возрасте 1—2 мес.

Причина хронического течения чумы — размножение вирулентных штаммов в недостаточно иммунном организме, при использовании инактивированных вакцин.

Латентное течение наблюдают при внутриутробном заражении. У поросят отмечаются угнетение, конъюнктивиты, дерматиты, двигательные нарушения. Гибель наступает через 2—11 мес. На вскрытии отмечают увеличение лимфоузлов и атрофию тимуса. КЧС передается алиментарно, аэрогенно, трансмиссивно (комарами). Мертворождаемость, отставание в росте свидетельствуют о внутриутробном заражении плодов и установлении у них персистентной виремии.

Воротами инфекции чаще являются миндалины и носоглотка. В их лимфоидно-ретикулярной ткани происходят первичная локализация и размножение вируса. Через 16—24 ч вирус проникает в регионарные лимфатические узлы.

Для вируса характерна пантропность, однако он преимущественно репродуцируется и накапливается в органах, богатых лимфоидно-ретикулярными клетками (селезенка, лимфатические узлы, костный мозг, пейеровы бляшки слизистой кишечника, эндотелий кровеносных сосудов). В местах размножения вируса происходят дистрофические и некротические изменения. Патологический процесс в стенках кровеносных сосудов микроциркуляторного русла значительно повышает их проницаемость и приводит к возникновению кровоизлияний, отеков, некродистрофических и воспалительных процессов в различных тканях и органах. Появление геморрагий связывают также с нарушениями в системе свертывания крови.

В результате поражения кроветворных органов развиваются анемия и лейкопения (2500—3000 лейкоцитов/мм 3 ), угнетение опсоно-фагоцитарной реакции и резкое снижение бактерицидности сыворотки крови. Разрушение клеток иммунной системы в результате размножения в них вируса и повышения литической активности макрофагов снижает уровень иммунитета.

Ослабленный организм не может противостоять секундарной бактериальной микрофлоре. Развивается вторичная инфекция, которая отягощает состояние организма.

Воспалительные процессы в мозговой ткани сопровождаются появлением в ней периваскулярных инфильтратов и как следствие — нервных явлений (депрессии, возбуждения, припадков). Смерть наступает в результате поражения клеток, нарушения функции всех систем организма, особенно органов кроветворения и кровообращения.

Виремия и выделения вируса с секретами и экскретами происходят в течение всего периода болезни. У хронически больных животных вирус выделяется до трех месяцев.

Патологоанатомические изменения. При КЧС они очень разнообразны и зависят от течения болезни и наличия осложнений секундарной инфекцией. Кожа ушей, шеи, живота, внутренней стороны бедер багрово-красная с точечно-пятнистыми кровоизлияниями. Лимфатические узлы, особенно головы, шеи, мраморные на разрезе; в различных органах выраженные явления геморрагического диатеза. Кровоизлияния встречаются в корковом слое почек, в слизистой оболочке лоханки, мочеточников и мочевого пузыря. По краям селезенки часто наблюдают инфаркты. На слизистой кишечника и легких — серозно-катаральные или крупозно-геморрагические воспаления.

При чуме, осложненной пастереллезом (грудная форма), основные изменения наблюдают в органах грудной полости: крупозно-геморрагическая пневмония, плеврит, перикардит, кровоизлияния на слизистой гортани, трахеи, в почках и кишечнике.

Гистологические изменения при КЧС неспецифичны. В селезенке, в зоне инфаркта, отмечают некроз ткани, а вне зоны — кровоизлияния, группы незрелых клеток лимфоидного ряда. В ЦНС обнаруживают признаки негнойного лимфоцитарного энцефаломиелита.

Локализация вируса. Вирус пантропен, накапливается во всех органах и тканях, но преимущественно в лимфоузлах, костном мозге, слизистой оболочке кишечника и эндотелии кровеносных сосудов. Наибольшая его концентрация отмечается в тонзиллярных лимфоузлах.

Вирус размножается в лейкоцитах периферической крови и накапливается в крови в максимальной концентрации уже на третий день после подъема температуры тела. Он выявлен также в эпителии миндалин, подчелюстных, заглоточных, мезентериальных и других лимфоузлах, в респираторных путях и кишечном тракте, слизистой мочевого и желчного пузыря, поджелудочной, щитовидной и слюнных железах. Наивысшие титры вируса обнаруживают в период с 3-го по 7-й день болезни.

Трансплацентарная передача ВКЧС приводит к рождению клинически здоровых, но инфицированных поросят, которые в течение 4—6 мес выделяют вирус в больших количествах.

Источник инфекции — больные свиньи и вирусоносители. К КЧС восприимчивы только свиньи независимо от возраста. Особую опасность представляют свиньи с хроническим, инаппарантным и атипичным течением болезни, а также вирусоносители в инкубационном периоде болезни и реконвалесценты. Вирусоносительство сохраняется до гибели животного. Рассеивание вируса происходит с экскретами и секретами.

Главный путь распространения чумы — реализация продуктов убоя свиней-вирусоносителей. Есть данные о передаче вируса комарами. Циркуляция в природе главным образом осуществляется трансплацентарной передачей, обеспечивающей врожденную персистенцию вируса у плодов и новорожденных поросят.

Большое значение для распространения болезни имеет существование резервуаров инфекции среди диких кабанов. Передача вируса от диких свиней домашним происходит в случаях пользования ими одних и тех же кормов (корнеплодов в буртах, соломы в скирдах). Заражению же диких кабанов способствует несоблюдение ветеринарно-санитарных правил в неблагополучных по КЧС хозяйствах (отсутствие скотомогильников, убойных площадок).

Природная очаговость КЧС определяется активным расселением кабанов. Распространению вируса способствует миграция отдельных кабанов на расстояние до 20 км в день, поэтому необходим регулярный эпизоотологический надзор за дикими кабанами.

Чума свиней не имеет сезонности и периодичности. При заносе вируса протекает она в виде эпизоотий. В свежих очагах при наличии неиммунного поголовья через 10—14 дней заболевают почти все. В случае заноса вируса с инфицированным кормом поголовное заболевание наблюдают через 2—3 дня. Заболеваемость составляет 95—100 %, летальность — 60—100 %.

Диагностика. Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований. Частая вакцинация свиней против чумы создает иммунный фон, который влияет на клинико-эпизоотологические характеристики болезни, поэтому только лабораторная диагностика позволяет установить правильный диагноз.

Патологическим материалом для лабораторной диагностики служат полученные от больных животных пробы крови, взятой с антикоагулянтом, и от вынужденно убитых животных или трупов — кусочки селезенки, миндалин, лимфатических узлов, почек, легких, поджелудочной железы, грудная кость.

Лабораторная диагностика. Обнаружение вирусной нуклеиновой кислоты. Методы ПЦР и ДНК-зонда позволяют дифференцировать пестивирусы (КЧС и вирусы диареи КРС).

ПЦР. Выделяют рибонуклеиновую кислоту из образцов тканей животных фенольным методом, подвергают обратной транскрипции и амплифицируют. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

ДНК-зонд. В качестве гибридизационного зонда используют комплементарную ДНК к участку гена белка Р125, меченную 22 Р.

Обнаружение вирусного антигена (белка).

РИФ. Из лейкоцитарного концентрата проб крови больных или подозрительных по заболеванию животных, а также из костного мозга грудной кости делают мазки, а из их органов — срезы. На наличие вируса КЧС указывает специфическое свечение цитоплазмы. Следует иметь в виду, что вакцинный вирус сохраняется в организме свиней до 15 дней после вакцинации и в этот период не дифференцируется в РИФ от полевого вируса.

РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом. Вирус считается обнаруженным при наличии гемагглютинации в суспензии из патологического материала в разведениях не менее чем 1 : 8.

ИФА. В иммуноферментных конъюгатах используют иммуноглобулины баранов, инфицированных ВКЧС. Метод позволяет при постмортальной диагностике выявлять вирус со 100%-ной эффективностью без предварительного биологического накопления. Обнаруживают вирус также в культуре клеток и в объектах ветеринарного надзора (зерне, почве, воде). На основе моноклональных антител разработана тест-система, позволяющая дифференцировать вакцинный и полевые штаммы ВКЧС, а также вирус диареи КРС.

РДП слабочувствительна, дает положительный результат в 50 % случаев.

РИОЭФ (реакция иммуноэлектроосмофореза), в которой антигены и антитела движутся строго навстречу друг другу под действием электрического поля. РИЭОФ значительно чувствительнее, чем РДП, и скорее (за 30 мин) выявляет вирус в мезентериальных лимфоузлах и суспензии ткани поджелудочной железы.

Обнаружение вируса биопробой. Биопробу при диагностике КЧС ставят в сомнительных случаях. Она позволяет, с одной стороны, обнаружить ВКЧС, с другой — дифференцировать его от сходно протекающей африканской чумы свиней. Биопробу ставят по схеме иммунологической биопробы.

Из благополучного по инфекционным болезням хозяйства берут иммунизированных и неиммунизированных против КЧС поросят в возрасте 2—3 мес массой 20—30 кг. В качестве материала для заражения используют 10%-ную суспензию органов (селезенки, лимфоузлов, костного мозга) или кровь от павших животных. Материал вводят подкожно. Диагноз на КЧС считают установленным, если неиммунизированные животные на 2—5-й день заболевают и в течение 7—10 дней погибают, а иммунизированные остаются здоровыми. Если же в результате заражения заболевают и иммунизированные животные, то имеются основания для установления африканской чумы свиней, что должно быть подтверждено выделением вируса и его идентификацией.

Выделение вируса проводят на перевиваемой линии культуры клеток РК-15 (почки поросенка), выращенной на покровных стеклах в пробирках. Вирус КЧС в культуре клеток РК-15 не вызывает ЦПД; поэтому индикацию его проводят методом РИФ.

Идентификацию вируса проводят с помощью серологических реакций РИФ и РИГА.

Ретроспективная серологическая диагностика. В настоящее время в лабораторной диагностике используют три метода обнаружения специфических к вирусу КЧС антител:

твердофазный непрямой вариант ИФА. Метод легок в выполнении, дешев, высокочувствителен и рекомендован к использованию при крупномасштабных обследованиях;

непрямой метод РИФ;

PH в сочетании с РИФ. PH ставят в культуре клеток РК-15, выращенной на покровных стеклах в пробирках. Учет реакции проводят через 48 ч. Присутствие вируса обнаруживают в люминесцентном микроскопе — видны флуоресцирующие фокусы (бляшки), состоящие из 20—30 инфицированных клеток. Присутствие антител нейтрализует вирус и вызываемый им эффект. Поэтому реакцию часто называют РНФБ (PH флуоресцирующих микробляшек). Реакция очень трудоемка.

Дифференциальная диагностика. КЧС необходимо отличать от африканской чумы свиней, болезни Ауэски, вирусной диареи, парагриппа и бактериальных инфекций (пастереллеза, сальмонеллеза, рожи).

При африканской чуме свиней все клинические и патологоанатомические признаки выражены ярче. Для дифференциации ставят иммунологическую биопробу. Вирусную диарею у инфицированных свиней устанавливают с помощью ПЦР. Другие предполагаемые вирусные болезни свиней исключают вирусологическими исследованиями.

Бактериальные инфекции дифференцируют по эпизоотологическим особенностям (возрастная чувствительность), клиническим и патологоанатомическим признакам, результатам бактериологических исследований и эффективности лечения антибиотиками.

Иммунитет и специфическая профилактика. Животные-реконвалесценты приобретают стойкий иммунитет, продолжающийся несколько лет. Пассивный иммунитет непродолжителен — до 10— 12 дней.

Иммунитет при КЧС обусловлен вируснейтрализующими антителами. Однако формирование резистентности к заражению вакцинированных свиней происходит до выявления вируснейтрализующих антител. Вероятно, вирус нейтрализуется клетками, в частности естественными киллерами и цитотоксическими лимфоцитами.

С 1980 г. специфическая профилактика КЧС с успехом осуществляется живыми вакцинами из штаммов К и ЛК-ВНИИВВиМ. С помощью живой вакцины ЛК-ВНИИВВиМ можно создавать специфическую защиту от заболевания свиней уже через 48 ч после однократного внутримышечного ее введения. Новорожденных поросят вакцинируют перорально тотчас после рождения до приема молозива. Получена живая вакцина для пероральной иммунизации диких кабанов. Инактивированные вакцины в настоящее время не применяют. Разработаны генно-инженерные вакцины против КЧС, но и они пока не имеют широкого применения.

Лечение поросят осуществлялось гипериммунными сыворотками с различной эффективностью, что зависело от стадии болезни в момент серотерапии.

НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ

Название (рус.) НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ Состав и форма выпуска Планшет для иммуноферментного анализа с иммобилизованным рекомбинантным антигеном E2 вируса КЧС - 1 шт. Положительная сыворотка свиньи (К+), 0,5 мл - 1 фл. (прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость желто-красного цвета). 20 - кратный концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывки планшетов (ФСБТ), 50 мл - 2 фл. по 25 мл. Буфер для разведения сывороток (БР), 10 мл - 1 фл. Конъюгат моноклональных антител к вирусу КЧС с пероксидазой хрена (Конъюгат), 10 мл - 1 фл (прозрачная жидкость розового цвета). Субстратный раствор с перекисью водорода для разведения хромогена (СР), 5 мл - 1 фл. Хромоген, тетраметилбензидин (ТМБ), 5 мл - 1 фл. 1 N Серная кислота (топ-раствор), 5 мл - 1 фл. В наборе содержатся все необходимые для проведения анализа реактивы, за исключением дистиллированной воды. В качестве дополнительного оборудования необходимы микропипетки вместимостью 10, 100, 200 и 1000 мкл, мерная лабораторная посуда, суховоздушный термостат с температурой 37 °C, спектрофотометр с длинной волны 450 нм. Фармакологические свойства Метод основан на конкурентном взаимодействия конъюгированных с пероксидазой моноклональных антител к оболочечному белку E2 вируса КЧС и сывороточной вирусспецифических антител с иммобилизованным на поверхности иммунологического планшета рекомбинантным белком E2. При отсутствии в исследуемой сыворотке вирусспецифических антител, моноклональный конъюгат свободно взаимодействует с иммобилизованным E2 и после добавления субстрата и хромогена в лунке развивается окраска. Если исследуемая сыворотка содержит вирусспецифические антитела, происходит их взаимодействие с иммобилизованным E2, его частичная или полная блокировка, в результате чего связывается конъюгата с антигеном, и, соответственно, интенсивность окраски снижается. Таким образом, интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству антител в исследуемой сыворотке. Показания Для выявления антител к вирусу классической чумы свиней (КЧС) в сыворотке крови иммуноферментным методом с целью диагностики КЧС у невакцинированных животных и оценки напряженности иммунитета после вакцинации. Набор реагентов рассчитан для проведения на одном планшете одновременного анализа 46 исследуемых (в 2 повторах) и двух контрольных сывороток (в 2 повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала. Дозы и способ применения Подготовка биологического материла. Для анализа используют сыворотку крови. Образцы биоматериала хранят при температуре 4 °C, если анализ проводят не позднее 24 ч после отбора. Для более длительного хранения образцы замораживают и хранят при минус 20 °C. Замороженные образцы перед исследованием быстро (в течение 5 - 10 минут) размораживают нагреванием в водяной бане при температуре 37 °C. В случае выпадения осадка пробы обязательно осветляют центрифугированием 10 минут при 2000 g. Многократное замораживание и оттаивание образцов не допускается. Подготовка рабочих растворов. Перед началом работы все реагенты выдерживают не менее 0,5 ч при комнатной температуре и тщательно перемешивают. Рабочий раствор буфера для отмывания планшетов ФСБТ. Содержимое флакона № 4 разводят в 20 раз свежеприготовленной дистиллированной водой. Пример: к 20 мл концентрата добавляют 380 мл воды. При необходимости использования части компонентов следует иметь ввиду, что для обработки одного стрипа требуется примерно 20 мл рабочего раствора. Готовый рабочий раствор стабилен при температуре 4 °C в течение 7 суток. Рабочий хромоген-субстратный раствор. Раствор хромогена (ТМБ - флакон № 8) разводят субстратным раствором (СР, флакон № 7) в соотношении 1 к 1 и перемешивают. Пример: Для получения 2 мл рабочего хромоген-субстратного раствора к 1 мл раствора ТМБ добавляют 1 мл субстратного раствора. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Буфер для разведения сыворотки (БР), № 5. Положительная сыворотка (K+), № 2. Отрицательная сыворотка (K-), № 3. Раствор конъюгата (Конъюгат), № 6. Стоп-раствор (1 Серная кислота), № 9 - готовы к употреблению. Проведения анализа. В лунки планшета вносят по 0,75 мл БР (из расчета по две лунки на каждый образец сыворотки и по 2 лунки для положительных и отрицательных контролей). В лунки A1 - B1 вносят по 0,05 мл K+.В лунки C1 - D1 вносят по 0,05 мл K - .В остальные лунки планшета с буфером БР вносят по 0,05 мл исследуемой сыворотки (по две лунки на каждый образец сыворотки). Закрывают планшет липкой пленкой и инкубируют 1,5 час при комнатной температуре. Планшет 5 раз промывают буфером ФСБТ (300 мкл/лунку), каждый раз полностью удаляя жидкость из лунок постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге. При этой операции возможно выпадение стрипов из рамки! Рекомендуется отмаркировать каждый стрип для восстановления из первоначального расположения. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл раствора конъюгата. Планшет закрывают липкой пленкой и инкубируют 45 минут при 37 °C. Планшет 5 раз промывают буфером ФСБТ (из расчета 300 мкл/лунку), каждый раз полностью удаляя жидкость из лунок путем постукивания перевернутого планшета по фильтровальной бумаге. Добавляют в каждую лунку по 0,1 мл рабочего хромоген-субстратного раствора. Планшет инкубируют в темноте 20 минут при температуре 18 - 22 °C. Останавливают реакцию добавлением 0,05 мл стоп-раствора (1NH₂SO₄). После остановки реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (A₄₅₀). Учет и интерпретация результатов. Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (A₄₅₀) для всех проб K + (A₄₅₀K + _ср). Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (A₄₅₀) для всех проб K - (A₄₅₀K + _ср). Вычисляют среднее значение оптической плотности (A₄₅₀) для каждой опытной пробы (ОП) (A₄₅₀ОП_ср).Вычисляют коэффициент ингибирования (K_инг) связывания конъюгата сывороточными антителами по формуле:
K_инг = (A₄₅₀K - _ср - A₄₅₀ОП_ср) / (A₄₅₀K - _ср - A₄₅₀K + _ср) x 100
Величина (A₄₅₀K - _ср - A₄₅₀K + _ср) является характеристикой работоспособности набора и должна составлять не менее 0,3. Если эта величина мене 0,3, к полученным результатам следует относиться как к сомнительным и, по возможности, повторить анализ. Пробу считают отрицательной, если величина K_инг менее 50 %. Если величина K_инг более 50 % пробу считают положительной. Если в сыворотке невакцинированного животного (исключая невакцинированных поросят от вакцинированных свиноматок, которые имеют колостральный иммунитет до 60 дневного возраста) обнаруживают антитела к вирусу КСЧ (K_инг выше50 %), это свидетельствует о контакте с вирусом и возможном заболевании. При исследовании напряженности поствакцинального иммунитета необходимо учитывать, что уровень вируснейтрализующих антител в сыворотке обеспечивает устойчивость животного к заражению вирулентным вирусом при K_инг выше 60 %. Так как развитие гуморального иммунитета начинается на 25 - 30 день после вакцинации, такой анализ рекомендуется проводить не ранее 25 дня после вакцинации. Особые указания Уровень антител к вирусу КЧС у животных может иметь существенные индивидуальные отличия. Для получения достоверных результатов, рекомендуется исследовать группы животных (не менее 10 голов), одинаковых по условиям содержания, возрасту и т. д. Не используйте объединенные сыворотки от разных животных. В случае сомнительных результатов рекомендуется повторить анализ тех же образцов сыворотки и применить другие методы анализа антител (реакцию нейтрализации или цитохимический вариант иммуноферментного анализа). Условия хранения В сухом, темном месте при температуре от 2 до 8 °C и относительной влажности не более 80 %. Срок годности набора - 12 месяцев. Замораживание ингредиентов комплекта не допускается. Все исходные компоненты набора стабильны до истечения срока годности. Оставшиеся после частичного использования компоненты должны храниться плотно закрытыми в заводской упаковке. Не переливать в другую посуду. Не смешивать компоненты из наборов разных серий. Производитель НАРВАК НПО ЗАО, Россия

Читайте также: