Вирусов окраска по граму

Обновлено: 26.04.2024

wikiHow работает по принципу вики, а это значит, что многие наши статьи написаны несколькими авторами. При создании этой статьи над ее редактированием и улучшением работали, в том числе анонимно, 25 человек(а).

Количество источников, использованных в этой статье: 18. Вы найдете их список внизу страницы.

Окрашивание по Граму — это экспрессный метод исследования, позволяющий установить наличие бактерий в образце и дифференцировать их как грамположительные либо грамотрицательные. Метод основан на химических и физических свойствах клеточной оболочки. [1] X Источник информации Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. Метод Грама почти всегда применяют в качестве первого шага при диагностике бактериальных инфекций.

Метод был предложен датским ученым Г.К.Грамом, который разработал его в 1882 и опубликовал в 1884 году, как способ, позволяющий дифференцировать сходные по симптомам бактериальные инфекции: Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и Klebsiella pneumoniae. [2] X Источник информации Gram, HC (1884). "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten" (in German). Fortschritte der Medizin 2: 185–9.

Приготовьтесь к работе. Наденьте перчатки и подвяжите длинные волосы, чтобы не загрязнить исследуемый образец. Выберите рабочее место под вытяжкой или в другом хорошо проветриваемом месте и продезинфицируйте его. Прежде чем приступить к работе, проверьте, исправны ли горелка Бунзена и оптический микроскоп.

Продезинфицируйте предметное стекло. Если предметное стекло недостаточно чистое, вымойте его водой с мылом, чтобы удалить жир и грязь. После этого продезинфицируйте его этанолом, очистителем для стекол или другим способом, который принят в вашей лаборатории.

Окрашивание по Граму. Культивирование вирусов. Содержание бактерий в молоке.

С помощью фазово-контрастного микроскопа можно увидеть живые бактерии, однако чаще бактерии предварительно фиксируют и окрашивают.

Одним из методов окрашивания, позволяющим идентифицировать бактерии, является окрашивание по Граму. Впервые этот метод был предложен датским врачом Кристианом Грамом в 1884 г. До окрашивания все бактерии бесцветны. После окрашивания грамположительные бактерии становятся фиолетовыми, а грамотри-цательные бактерии — красными. Различия между этими двумя типами бактерий описаны в нашей статье (клеточная стенка).
Детали процедуры окрашивания даны в эксперименте.

Культивирование вирусов

Культивирование, или выращивание, вирусов — процедура более сложная, чем выращивание бактерий, потому что вирусы растуг и размножаются только внутри живых клеток. Можно инфицировать целый организм, например растение или животное, однако сейчас стараются, где это возможно, использовать культуры клеток или тканей. Раньше использовали метод культивирования определенных вирусов в куриных эмбрионах во время их роста внутри яйца. Сходная процедура выращивания вирусов в амниотической жидкости, окружающей куриный эмбрион, применялась при изготовлении вакцин против свинки и гриппа.

Культура клеток — это суспензия клеток в жидкой среде, а культура тканей это маленькие кусочки органа растения или животного в жидкой или на твердой среде. В культуре клеток растений обычно используют меристемы, т. е. такие участки, как кончики корня или побегов, где клетки активно делятся. Материал можно взять с зараженного растения, либо инфицировать культуру подходящим вирусом. Культуру клеток животных обычно получают путем выращивания отдельных клеток в виде одного слоя на поверхности стеклянного контейнера (моно-слойная культура). Полиовирус был впервые выращен в такой культуре, полученной из почки обезьяны. Для получения культуры ткани использовались также клетки из легких, амниона и раковых опухолей человека.

Лабораторная работа

Цель практических занятий — освоение некоторых основных бактериологических методов. В качестве относительно безопасного источника бактерий мы рекомендуем использовать молоко. Молоко служит прекрасной пищей не только для млекопитающих, но и для многих бактерий.

Содержание бактерий в молоке

Даже при максимальном соблюдении правил гигиены бактерии неминуемо попадают в молоко во время доения и последующей обработки. Парное молоко обычно сразу охлаждают, чтобы замедлить развитие бактерий. Необработанное (сырое) молоко пастеризуют, т. е. прогревают, чтобы убить патогенные бактерии. При этом многие непатогенные бактерии выживают. В молоке присутствуют следующие бактерии:

1. При 15—30 °С преобладает Streptococcus lactis (грамположительный микроорганизм) и многие другие стрептококки (тоже грамположительные), а также корине-формные (булавовидные) бактерии (напри мер, Microbacterium, Brevihacterium) f которые похожи на Lactobacillus, но имеют утолщения на концах палочек.
Streptococcus lactis хорошо растет при 10 °С, но при температуре свыше 40 °С его рост прекращается.

2. При 30—40 °С доминируют различные виды Lactobacillus (грамположительные) и кишечные бактерии (грамотрицательные), например Е. coli.
Streptococcus lactis и Lactobacillus относятся к молочнокислым бактериям. В процессе брожения (анаэробного дыхания) они образуют из лактозы (молочного сахара) молочную кислоту, которая, накапливаясь, вызывает скисание молока. Колонии S. lactis и Lactobacillus относительно малы (максимальный диаметр колонии не превышает нескольких миллиметров), не окрашены и выглядят белыми, как мел. 5. lactis образует гладкие колонии с ровными краями. Если в питательный агар добавить мелко измельченный карбонат кальция, то вокруг каждой колонии образуются прозрачные зоны, где молочная кислота растворяет карбонат кальция. Стрептококки необходимы для нормального скисания молока. Они имеют сферическую форму и образуют цепочки.

Клетки Lactobacillus имеют палочковидную форму, и легко слипаются, образуя длинные цепочки. Колонии имеют шероховатую поверхность и неровные края.

В молоке можно обнаружить и ряд других бактерий, в том числе живущую в кишечнике палочку Alcaligenes (грамотрицательная), клетки которой могут быть одиночными или образовывать цепочки. Их можно распознать на агаре Макконки по желтоватой (щелочной) зоне вокруг каждой колонии.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Для идентификации и систематизации бактерий применены критерии, отражающие особенности их физиологии, морфологии, антигенных и других свойств.

Морфологические и тинкториальные свойства бактерий

Наиболее общие критерии для важных с медицинской точки зрения бактерий: величина, форма, агрегация (образование нитей, тетрад, пакетов), наличие капсулы, эндоспор, жгутиков, пигментов и способность окрашиваться красителями (то есть тинкториальные свойства). Наиболее распространена окраска по Граму — простое по технике выполнения окрашивание, основанное на способности воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового с йодом либо терять его после обработки этанолом.

Грамположительные бактерии хорошо удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом. После обработки фуксином они окрашиваются в фиолетово-пурпурный цвет.

Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом, то есть теряют комплекс генциа-нового фиолетового с йодом, и хорошо поглощают фуксин. Б мазках они окрашиваются в малиново-красный цвет.

Кислотоустойчивые бактерии. Клеточная стенка некоторых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). Подобные бактерии называют кислотоустойчивыми, их трудно окрашивать по Граму (хотя кислотоустойчивые бактерии рассматривают как грамположительные). Для их окраски применяют метод Циля-Нильсена.

Окрашивание по Граму или Цилю-Нильсену имеет диагностическую ценность в отношении бактерий, обладающих прочной клеточной стенкой. Они неприемлемы для окраски микоплазм (нет клеточной стенки) или спирохет (клеточная стенка тонкая и легко разрушается при окрашивании). Для изучения последних применяют различные методы нанесения на их поверхность контрастных субстратов (например, серебрение).

ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления Аг некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкубирования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК — высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизиро-ваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Методы диагностики микозов ( грибковых заболеваний )

Микроскопия — один из основных методов выявления возбудителей микозов. Позволяет проводить экспресс-диагностику микозов и получать результат в течение 1—2 ч, тогда как для выделении культуры возбудителя необходимы недели. Для экспресс-диагностики препараты часто необходимо окрашивать специальными красителями, так как простая окраска гематоксилином и эозином часто не позволяет выявить клетки грибов.

Неокрашенные препараты грибов

Микроскопия методом висячей или раздавленной капли. Метод позволяет выявить структуры грибов в клинических образцах без предварительного окрашивания.

Обработка 10% едким калием (КОН). Метод используют в первую очередь для визуализации структур возбудителей в фрагментах кожи и её придатках (ногти, волосы), отделяемом очагов поражения и влагалища. В указанных образцах содержится большое количество клеток, в которых КОН разрушает кератин, оставляя неизменёнными клетки грибов.

Окрашенные препараты грибов. Окраска мазка грибов.

• Окраска мазка грибов по Граму. В мазках из клинического материала грибы представлены грамположительными клетками. Клетки Cryptococcus neoformans плохо воспринимают красители, что можно использовать как дифференциально-диагностический признак при микроскопии окрашенных мазков СМЖ.

• Окраска мазка грибов нигрозином или тушью по Бурри мазков СМЖ позволяет выявить капсулированные клетки Cryptococcus neoformans. Для идентификации этого микроорганизма можно использовать муцикармин или конго красный.

• Окраска мазка грибов по Романовскому-Гимзе или Райту мазков крови и костного мозга позволяет выявить дрожжевую форму Histoplasma capsulatum в цитоплазме фагоцитов.

• Окраска мазка грибов метенаминовым серебряным по Гомори. Метод включает предварительную обработку гистологических препаратов хромовой кислотой с последующим нанесением красителя (клетки грибов тёмно-серые или чёрные).

• Окраска мазка грибов по Гридли. Метод включает предварительную обработку препаратов хроматом лейко-фуксина с последующим нанесением фуксинового альдегида и метанилового жёлтого (клетки грибов розово-пурпурные на жёлтом фоне).

• Окрашивание перйодной кислотой и реактивом Шиффа (по Мак-Манусу). 1,2-Гликольные группировки полисахаридов клеточных стенок грибов сначала окисляются перйодной кислотой до альдегидов, реагирующих с сульфитом лейкофуксина реактива Шйффа; клетки окрашиваются в насыщенно розовый или красный цвет.

Иммунофлюоресцентная микроскопия грибов

Наибольшее распространение нашла РИФ. Применяют AT, меченные флюоресцеинами; для выявления грибковых Аг реагент наносят на гистологический препарат, инкубируют и проводят люминесцентную микроскопию.

Окрашивание бактерий по Граму – метод окраски, позволяющий разделить данную группу прокариотичеких микроорганизмов на грамотрицательные бактерии и грамположительные бактерии [2] .

Окрашивание в фиолетовый цвет
грамположительной бактерии Bacillus thuringiensis

Грамотрицательные и грамположительные бактерии отличаются строением клеточной стенки. Метод окрашивания бактерий по Граму был предложен в 1884 году датским ученым Х. Грамом [2] . К грамотрицательным бактериям, в частности, относятся кишечные палочки, сальмонеллы, бруцеллы, возбудители дизентерии, холеры, уксуснокислые бактерии, семейство Псевдомонадовые (Pseudomonadaceae).

Основы и сущность метода

Метод окрашивания бактерий по Граму основан на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке красители трифенилметанового ряда – кристаллический фиолетовый или генциановый фиолетовый. Сущность метода основана на различии в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий [2] [1] .

Как уже было указано, все бактерии по этому признаку делят на две группы:

грамположительные – красящиеся по Граму;
грамотрицательные – не красящиеся по Граму [1] .

Техника окрашивания бактерий по Граму

Методика поверки бактерий на окрашивание по Граму включает следующие операции:

На обезжиренное предметное стекло наносят в трех местах три капли воды и готовят три тонких мазка различных видовбактерий. При этом по краям располагают контрольные мазки с заведомо известным отношением к окраске по Граму. В центре – мазок исследуемой культуры [1] .
Мазки высушивают и фиксируют в пламени спиртовки [1] .
Мазки окрашивают в течение одной минуты генцианвиолентом. Для этого на предметное стекло кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, и смачивают ее водой [1] .
Бумажку с красителем удаляют, на препарат наносят раствор Люголя (водой промывать не надо) и выдерживают 60 секунд, до полного почернения мазка [1] .
Не промывая водой, препарат обрабатывают 96% спиртом в течение 15–20 с. При этом предметное стекло покачивают. Важно четко соблюдать указанное время обесцвечивания, поскольку при увеличении его продолжительности наблюдается обесцвечивание и грамположительных бактерий[1] .
Препарат промывают водой и накладывают на его поверхность полоску фильтровальной бумаги, пропитанной фуксином Пфейфера, смачивают ее водой и окрашивают в течение 60 секунд [1] .
Фильтровальную бумагу с красителем удаляют, препарат промывают водой и осушают чистой фильтровальной бумагой [1] .
На препарат наносят кедровое масло и рассматривают с иммерсионным объективом [1] .

После такой обработки грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый или синий цвет, а грамотрицательные – в красный [3] [1] .

Читайте также: