Вирусы и фаги их отличия от бактерий польза и вред приносимые ими
Обновлено: 24.04.2024
Бактериофаги – одни из самых загадочных препаратов аптечного ассортимента. Сейчас они переживают второе рождение – и в нашей стране, и за рубежом снова возник к ним интерес, в журналах появляется не только пересмотр старых результатов, но и масса новых публикаций. Что можно рассказать покупателю, который заинтересовался именно этими средствами?
Вехи истории
Ученые обнаруживали следы жизнедеятельности бактериофагов задолго до того, как возникла вирусология. Британский бактериолог Эрнест Ханкин еще в 1896 году обратил внимание, что некий агент, способный проходить через очень тонкий фарфоровый фильтр, убивает возбудителя холеры. Развитию науки в новом направлении помешала Первая мировая, поскольку финансирование было перенаправлено разработчикам боевых газов, взрывчатых веществ и других более актуальных вещей.
Первооткрывателями бактериофагов считаются два исследователя – британский бактериолог Фредерик Творт, описавший странный фильтрующийся агент в 1915 году, и канадский микробиолог французского происхождения Феликс Д’Эрелль, независимо от Творта сообщивший о точно такой же находке в 1917-м.
За рубежом бактериофагами интересовались в первую очередь микробиологи, так что их находки не имели прикладного значения. Очень долгое время, например, фаг считался не вирусом, а ферментом. В СССР работы изначально велись медиками, в Грузии в 1923 году был создан будущий Всесоюзный центр фаготерапии, собравший на пике своего расцвета коллекцию из более чем 3 тыс. образцов. Однако затем и у нас, и за рубежом дело фаготерапии было практически уничтожено появившимися антибиотиками. Их массовое распространение после Второй мировой создавало впечатление, что изобретена панацея против инфекций и остальные направления исследований – тупиковые.
О бактериофагах ученые вспомнили, когда перед ними в полный рост встала проблема антибиотикорезистентности. Вирусы снова стали объектом экспериментов, в них увидели реальную альтернативу морально и иногда даже физически устаревшим противомикробным препаратам.
Натуральный враг
Фаги гораздо разнообразнее, чем какие-либо другие известные вирусы, нельзя сказать, что они выглядят однотипно. Чаще всего в качестве иллюстрации используется изображение вирусов группы А по классификации Бредли, она же – группа V по классификации Тихоненко. Такие вирусы устроены сложнее всего, в них имеется головка и отросток с множеством дополнительных элементов (рис. 1). Всего групп выделяют шесть, только в одной из них геном фага представлен одноцепочечной РНК, во всех остальных случаях – это одна- или двухцепочечная ДНК.
Бактериофаги нельзя назвать гигантами, но по своим размерам они, скорее, относятся к крупным и занимают промежуточное положение между самыми большими вирусами табачной мозаики и вирусом иммунодефицита человека 1-го типа (рис. 2).
Быстро или помучиться?
По механизму действия все бактериофаги можно разделить на две большие группы. Первая – литические, или вирулентные фаги, которые в 100% случаев убивают инфицированную клетку сразу. В случае, показанном на рисунке 3, вирус сразу же уничтожает геном бактерии, используя его исключительно для целей собственной репликации. После наработки максимально возможного числа новых вирусных частиц микроб либо сразу гибнет в момент их выхода, просто разрываясь на части, либо погибает в ближайшее время из-за того, что все критически важные внутренние механизмы физически уничтожены.
Плюсы и минусы
По той же причине у фагов либо меньше побочных эффектов, либо их совсем нет. С резистентностью история схожая, она если и развивается, то только у конкретной бактерии-мишени. С помощью генной инженерии реально перепрограммировать вирус и натравить его на какого-нибудь другого возбудителя, еще не знакомого с вирусом.
Немаловажным фактором в пользу бактериофагов можно считать дешевизну и простоту их производства, особенно по сравнению с новыми перспективными антибиотиками. Действительно получается не менее, а иногда и более эффективная альтернатива с кратно меньшими вложениями.
Недостатки тоже есть, и они тесно связаны с вирусной природой фагов. Прежде всего, их сложно хранить и перевозить, они весьма требовательны к условиям содержания. Кроме того, фаги способны нападать только на свободно плавающие бактерии, внутрь человеческих клеток их никто не пустит. Агрессивная среда желудка уничтожает многие вирусы, не разбирая, кто пришел с миром, а кто нет. И главное, для достижения максимального эффекта терапии бактерию-возбудителя нужно фаготипировать, то есть выделить и в лабораторных условиях доказать, что против нее может быть применен вот этот конкретный вирус.
Факты
В СССР активно изучали медицинское применение бактериофагов, но публикации были либо на русском, либо на грузинском языках, поэтому мировая наука о них не знала и с удивлением изучает и цитирует их уже в наше время.
Работы по бактериофагам удостоены Нобелевской премии. В 1969 году она была присуждена американским исследователям Максу Дельбрюку, Альфреду Херши и Сальвадору Лурия за открытия, касающиеся механизма репликации и генетической структуры вирусов.
Бактериофаги – это вирусы, которые поражают только бактерий. В ходе инфекции они влияют на все процессы жизнедеятельности бактериальной клетки, фактически превращая ее в фабрику по производству вирусного потомства. В конце концов клетка разрушается, а вновь образованные вирусные частицы выходят наружу и могут заражать новые бактерии.
Несмотря на огромное число и разнообразие природных фагов, встречаемся мы с ними редко. Однако бывают ситуации, когда деятельность этих вирусов не остается незамеченной. Например, на предприятиях, где производят сыры, йогурты и другие молочно-кислые продукты, часто приходится сталкиваться с вирусной атакой на бактерии, сбраживающие молоко. В большинстве таких случаев фаговая инфекция распространяется молниеносно, и полезные бактерии гибнут, что приводит к значительным экономическим потерям (Neve et al., 1994).
Именно благодаря прикладным исследованиям в интересах молочной промышленности, направленным на получение устойчивых к бактериофагам штаммов молочно-кислых бактерий, был открыт ряд механизмов, с помощью которых бактерии избегают инфекции. Параллельно были изучены способы, с помощью которых вирусы, в свою очередь, преодолевают бактериальные системы защиты (Moineau et al., 1993).
Кто защищен – тот вооружен
На сегодня известно пять основных, весьма хитроумных механизмов защиты, которые бактерии выработали в непрестанной борьбе с вирусами: изменение рецептора на поверхности клетки; исключение суперинфекции; системы абортивной инфекции; системы рестрикции-модификации и, наконец, системы CRISPR-Cas.
К средствам противовирусной защиты бактерий относятся и системы рестрикции-модификации, в которые входят гены, кодирующие два белка-фермента – рестриктазу и метилазу. Рестриктаза узнает определенные последовательности ДНК длиной 4—6 нуклеотидов и вносит в них двуцепочечные разрывы. Метилаза, напротив, ковалентно модифицирует эти последовательности, добавляя к отдельным нуклеотидным основаниям метильные группы, что предотвращает их узнавание рестриктазой.
Врага нужно знать в лицо
Системы CRISPR-Cas являются уникальным примером адаптивного иммунитета бактерий. При проникновении в клетку ДНК фага специальные белки Cas встраивают фрагменты вирусной ДНК длиной 25—40 нуклеотидов в определенный участок генома бактерии (Barrangou et al., 2007). Такие фрагменты называются спейсерами (от англ. spacer – промежуток), участок, где происходит встраивание, – CRISPR-кассета (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), а сам процесс приобретения спейсеров – адаптацией.
Чтобы использовать спейсеры в борьбе с фаговой инфекцией, в клетке должен происходить еще один процесс, управляемый белками Cas, названный интерференцией. Суть его в том, что в ходе транскрипции CRISPR-кассеты образуется длинная молекула РНК, которая разрезается белками Cas на короткие фрагменты – защитные криспрРНК (крРНК), каждая из которых содержит один спейсер. Белки Cas вместе с молекулой крРНК образуют эффекторный комплекс, который сканирует всю ДНК клетки на наличие последовательностей, идентичных спейсеру (протоспейсеров). Найденные протоспейсеры расщепляются белками Cas (Westra et al., 2012; Jinek et al., 2012).
Системы CRISPR-Cas обнаружены у большинства прокариот – бактерий и архей. Хотя общий принцип действия всех известных систем CRISPR-Cas одинаков, механизмы их работы могут существенно отличаться в деталях. Наибольшие различия проявляются в строении и функционировании эффекторного комплекса, в связи с чем системы CRISPR-Cas делят на несколько типов. На сегодняшний день описаны шесть типов таких неродственных друг другу систем (Makarova et al., 2015; Shmakov et al., 2015).
Наиболее изученной является система CRISPR-Cas I типа, которой обладает излюбленный объект молекулярно-биологических исследований – бактерия кишечная палочка (Esсherichia coli). Эффекторный комплекс в этой системе состоит из нескольких небольших белков Cas, каждый из которых отвечает за разные функции: разрезание длинной некодирующей CRISPR РНК, связывание коротких крРНК, поиск, а затем разрезание ДНК-мишени.
Гонка вооружений
Бактериофаги, как факторы среды, вызывают направленные изменения в геноме бактерий, которые наследуются и дают бактериям явное преимущество, спасая от повторных инфекций. Поэтому системы CRISPR-Cas можно считать примером ламарковской эволюции, при которой происходит наследование благоприобретенных признаков (Koonin et al., 2009)
Некоторые бактериофаги реагируют на наличие в бактериальной клетке систем CRISPR-Cas выработкой особых анти CRISPR-белков, способных связываться с белками Cas и блокировать их функции (Bondy-Denomy et al., 2015). Еще одно ухищрение — обмен участков генома вируса, на которые нацелена система CRISPR-Cas, на участки геномов родственных вирусов, отличающихся по составу нуклеотидной последовательности (Paez-Espino et al., 2015).
Благодаря постоянному совершенствованию биоинформатических алгоритмов поиска, а также включению в анализ все большего количества прокариотических геномов, открытие новых типов CRISPR-Cas систем является делом недалекого будущего. Предстоит также выяснить и детальные механизмы работы многих недавно открытых систем. Так, в статье, опубликованной в 2016 г. в журнале Science и посвященной анализу системы CRISPR-Cas VI типа, описан белок С2с2, образующий эффекторный комплекс с крРНК, который нацелен на деградацию не ДНК, а РНК (Abudayyeh et al., 2016). В будущем такое необычное свойство может быть использовано в медицине для регулирования активности генов путем изменения количества кодируемых ими РНК.
Изучение стратегий борьбы бактерий с бактериофагами, несмотря на свою кажущуюся фундаментальность и отвлеченность от задач практической медицины, принесло неоценимую пользу человечеству. Примерами этого могут служить методы молекулярного клонирования и редактирования геномов – направленного внесения или удаления мутаций и изменения уровня транскрипции определенных генов.
Благодаря быстрому развитию методов молекулярной биологии всего лишь через несколько лет после открытия механизма действия систем CRISPR-Cas была создана работающая технология геномного редактирования, способная бороться с болезнями, ранее считавшимися неизлечимыми. Доступность и простота этой технологии позволяют рассматривать ее как основу для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства и биотехнологий будущего, которые будут базироваться на направленных и безопасных генных модификациях.
Нет никаких сомнений, что дальнейшее изучение взаимодействия бактерий и их вирусов может открыть перед нами такие возможности, о которых мы сейчас даже не подозреваем.
Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Konermann S. et al. C 2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector // Science. 2016. V. 353: aaf5573.
Barrangou R., Fremaux C., Deveau H. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes // Science. 2007. V. 315. P. 1709–1712.
Bikard D., Marraffini L. A. Innate and adaptive immunity in bacteria: mechanisms of programmed genetic variation to fight bacteriophages // Curr. Opin. Immunol. 2012. V. 1 P. 15–20.
Bondy-Denomy J., Garcia B., Strum S. et al. Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins // Nature. 2015. V. 526. P. 136–139.
Calendar R., Abedon S. T. The Bacteriophages // 2nd Ed., Oxford University Press. 2006.
Datsenko K. A., Pougach K., Tikhonov A. et al. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 945
Jiang W., Marraffini L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems // Annu. Rev. Microbiol. 2015. V. 69. P. 209–28.
Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. V. 337. P. 816–821.
Koonin E. V., Wolf Y. I. Is evolution Darwinian or/and Lamarckian? // Biol. Direct. 2009. V. 4. P. 42.
Lopez-Pascua L., Buckling A. Increasing productivity accelerates host-parasite coevolution // J. Evol. Biol. 2008. V. 3. P. 853–860.
Makarova K. S., Wolf Y. I., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems // Nat. Rev. Microbiol. 2015. V. 11. P. 722–736.
Moineau, S., Pandian S., Klaenhammer T. R. Restriction/modification systems and restriction endonucleases are more effective on lactococcal bacteriophages that have emerged recently in the dairy industry // Appl. Envir. Microbiol. 1993. V. 59. P. 197–202.
Neve H., Kemper U., et al. Monitoring and characterization of lactococcal bacteriophage in a dairy plant // Kiel. Milckwirtsch. Forschungsber. 1994. V. 46. P. 167–178.
Nuñez J. K., Harrington L. B., et al. Foreign DNA capture during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nature. 2015a. V. 527. P. 535–538.
Nuñez J. K., Kranzusch P. J., et al. Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nat. Struct. Mol. Biol. 2014. V. 21. P. 528–534.
Nuñez J. K., Lee A. S., Engelman A., Doudna J. A. Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nature. 2015b. V. 519. P. 193–198.
Paez-Espino D., Sharon I., et al. CRISPR Immunity Drives Rapid Phage Genome Evolution in Streptococcus thermophilus // MBio. 2015. V. 6: e00262–15.
Shmakov S., Abudayyeh O. O., Makarova K. S., et al. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. // Mol. Cell. 2015. V. 60. P. 385–397
Tan D., Svenningsen S. L., Middelboe M. Quorum sensing determines the choice of antiphage defense strategy in Vibrio anguillarum. // mBio 2015. V. 6: e00627–15.
Westra E. R., van Erp P. B., Künne T., et al. CRISPR immunity relies on the consecutive binding and degradation of negatively supercoiled invader DNA by Cascade and Cas3 // Mol. Cell. 2012. V. 46. P. 595–605.
Когда в 1930-х гг. группа ученых занялась проблемами функционирования живых систем, то в поиске простейших моделей они обратили внимание на бактериофаги – вирусы бактерий. Ведь среди биологических объектов нет ничего проще, чем бактериофаги, к тому же их можно легко и быстро выращивать и анализировать, а вирусные генетические программы невелики.
Фаг – это минимального размера природная структура, содержащая плотно упакованную генетическую программу (ДНК или РНК), в которой нет ничего лишнего. Эта программа заключена в белковую оболочку, снабженную минимальным набором устройств для ее доставки внутрь бактериальной клетки. Бактериофаги не могут размножаться сами по себе, и в этом смысле их нельзя считать полноценными живыми объектами. Их гены начинают работать только в бактерии, используя имеющиеся в бактериальной клетке биосинтетические системы и запасы молекул, необходимых для синтеза. Однако генетические программы этих вирусов принципиально не отличаются от программ более сложных организмов, поэтому эксперименты с бактериофагами позволили установить основополагающие принципы устройства и работы генома.
В дальнейшем эти знания и разработанные в ходе исследований методы стали фундаментом для развития биологической и медицинской науки, а также широкого спектра биотехнологических приложений.
Борцы с патогенами
Первые попытки использовать бактериофаги для лечения инфекционных заболеваний были предприняты практически сразу после их открытия, однако недостаток знаний и несовершенные биотехнологии того времени не позволили достичь полного успеха. Тем не менее дальнейшая клиническая практика показала принципиальную возможность успешного применения бактериофагов при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, при острых гнойно-септических состояниях больных, для лечения хирургических инфекций и т. д.
По сравнению с антибиотиками бактериофаги имеют ряд преимуществ: они не вызывают побочных эффектов, к тому же строго специфичны для определенных видов бактерий, поэтому при их использовании не нарушается нормальный микробиом человека. Однако такая высокая избирательность создает и проблемы: чтобы успешно лечить пациента, нужно точно знать инфекционный агент и подбирать бактериофаг индивидуально.
Бактериофаги – наши друзья, когда речь идет о бактериях, патогенных для человека. Однако есть и другие, дружественные нам бактерии, которые используются в современных биотехнологических производствах, а также в традиционных производствах пищевой промышленности, таких как сыроварение и т. п. В этих случаях фаги могут приносить большой вред, поскольку в больших популяциях микроорганизмов, находящихся в стадии интенсивного роста, создаются благоприятные условия для размножения фагов, что приводит к лизису производственных бактериальных культур. При производстве сыра проблема не столь серьезна, так как при этом обычно применяют закваски, состоящие из многих культур, часть которых выдержит фаговую атаку и продолжит процесс молочно-кислого брожения. Серьезные неприятности возникают, если весь процесс основан на применении одного конкретного бактериального штамма, как, например, при производстве антибиотиков или терапевтических белков
Бактериофагами лечат инфекционные болезни не только людей, но и домашних и сельскохозяйственных животных: мастит у коров, колибактериоз и эшерихиоз у телят и свиней, сальмонеллез у кур. Особенно удобно применять фаговые препараты в случае аквакультуры – для лечения промышленно выращиваемых рыб и креветок, так как в воде они долго сохраняются. Бактериофаги помогают защитить и растения, хотя применение фаговых технологий в этом случае затруднено из-за воздействия природных факторов, таких как солнечный свет и дождь, губительных для вирусов.
Фаги могут сыграть большую роль в поддержании микробиологической безопасности продуктов питания, так как применение антибиотиков и химических агентов в пищевой отрасли, не решает эту проблему, одновременно снижая уровень экологической чистоты продукции. О серьезности самой проблемы говорят статистические данные: например, в США и России ежегодно регистрируется до 40 тыс. заболевших сальмонеллезом, из которых 1 % умирает. Распространение этой инфекции в значительной степени связано с выращиванием, переработкой и потреблением различных видов птицы, и попытки применить для борьбы с ней бактериофаги дали многообещающие результаты.
Так, американская компания Intralytix производит фаговые препараты для борьбы с листериозом, cальмонеллезом и бактериальным загрязнением кишечной палочкой. Они разрешены к применению как добавки, предотвращающие размножение бактерий на продуктах питания – их распыляют на продукты из мяса и домашней птицы, а также на овощи и фрукты. Эксперименты показали, что коктейль из бактериофагов может быть успешно применен и при транспортировке и реализации живой прудовой рыбы для снижения бактериального загрязнения не только воды, но и самой рыбы.
Очевидным применением бактериофагов является дезинфекция, т. е. уничтожение бактерий в тех местах, где их не должно быть: в больницах, на пищевых производствах и т. п. Для этой цели британская компания Fixed-Phage разработала метод фиксации фаговых препаратов на поверхностях, обеспечивающий сохранение биологической активности фагов до трех лет.
Семь дней творения
Современные методы синтетической биологии позволяют не только вносить различные модификации в фаговые геномы, но и создавать полностью искусственные активные фаги. Технологически это несложно, нужно только синтезировать фаговый геном и ввести его в бактериальную клетку, а там он уже сам запустит все процессы, необходимые для синтеза белков и сборки новых фаговых частиц. В современных лабораториях на эту работу уйдет всего несколько дней.
Первым полностью секвенированным ДНК-геномом стал геном фага φ174 длиной свыше 5 тыс. нуклеотидов (Sanger et al., 1977). Эту расшифровку осуществила группа английского биохимика Ф. Сэнгера, создателя известного одноименного метода секвенирования ДНК
Генетические модификации применяют, чтобы изменить специфичность фагов и повысить эффективность их терапевтического действия. Для этого наиболее агрессивные фаги снабжают узнающими структурами, связывающими их с целевыми бактериями. Также в вирусные геномы дополнительно встраивают гены, кодирующие токсические для бактерий белки, нарушающие метаболизм, – такие фаги более смертоносны для бактерий.
Универсальный способ защиты бактерий от всех внешних воздействий – так называемые биофильмы, пленки из ДНК, полисахаридов и белков, которые бактерии создают совместными усилиями и куда не проникают ни антибиотики, ни терапевтические белки. Такие биопленки – головная боль врачей, так как они способствуют разрушению зубной эмали, образуются на поверхности имплантов, катетеров, искусственных суставов, а также в дыхательных путях, на поверхности кожи и т. п. Для борьбы с биофильмами были сконструированы особые бактериофаги, содержащие ген, кодирующий специальный литический фермент, разрушающий бактериальные полимеры.
Фаговые антибиотики
В терапевтических целях фаги необязательно использовать напрямую. За миллионы лет эволюции бактериофаги разработали арсенал специфических белков – инструментов для распознавания целевых микроорганизмов и манипуляций с биополимерами жертвы, на основе которых можно создавать противобактериальные препараты. Наиболее перспективными белками такого типа являются ферменты эндолизины, которые фаги используют для разрушения клеточной стенки при выходе из бактерии. Сами по себе эти вещества являются мощными антибактериальными средствами, нетоксичными для человека. Эффективность и направленность их действия можно повысить, изменив в них адресующие структуры – белки, специфически связывающиеся с определенными бактериями.
Большинство бактерий делятся по устройству клеточной стенки на грамположительные, мембрана которых покрыта очень толстым слоем пептидогликанов, и грамотрицательные, у которых слой пептидогликана расположен между двумя мембранами. Использование природных эндолизинов особенно эффективно в случае грамположительных бактерий (стафилококков, стрептококков и др.), поскольку пептидогликановый слой у них расположен снаружи. Грамотрицательные бактерии (cинегнойная палочка, сальмонеллы, кишечная палочка и др.) являются менее доступной мишенью, поскольку ферменту, чтобы добраться до внутреннего пептидогликанового слоя, необходимо проникнуть сквозь внешнюю бактериальную мембрану.
Для преодоления этой проблемы были созданы так называемые артилизины – модифицированные варианты природных эндолизинов, содержащие поликатионные или амфипатические пептиды, которые дестабилизируют внешнюю мембрану и обеспечивают доставку эндолизина непосредственно к пептидогликановому слою. Артилизины обладают высокой бактерицидной активностью и уже показали свою эффективность при лечении отитов у собак (Briers et al., 2014).
Примером модифицированного эндолизина, избирательно действующего на определенные бактерии, является препарат P128 канадской компании GangaGen, Inc. Он представляет собой биологически активный фрагмент эндолизина, соединенный с лизостафином – адресующей белковой молекулой, которая связывается с поверхностью клеток стафилококков. Полученный химерный белок обладает высокой активностью против разных штаммов стафилококка, в том числе обладающих множественной лекарственной устойчивостью.
Анализируя размножение фагов в присутствии целевых бактерий, можно количественно определить численность последних. Так как количество фаговых частиц в растворе возрастет пропорционально числу содержавшихся в нем бактериальных клеток, то для оценки численности бактерий достаточно определить титр бактериофага.
Специфичность и чувствительность такой аналитической реакции достаточно высока, а сами процедуры просты в исполнении и не требуют сложного оборудования. Важно, что диагностические системы, основанные на бактериофагах, сигнализируют о наличии именно живого патогена, тогда как другие методы, такие как ПЦР и иммуно-аналитические, свидетельствуют лишь о наличии биополимеров, принадлежащих этой бактерии. Такого типа диагностические методы особенно удобны для использования в экологических исследованиях, а также в пищевой индустрии и сельском хозяйстве.
Вероятно, с помощью модифицированных фагов удастся решить и давнюю задачу глобальной важности – разработать дешевые и быстрые методы детекции возбудителей туберкулеза на ранней стадии заболевания. Задача эта очень сложна, поскольку микобактерии, вызывающие туберкулез, отличаются крайне медленным ростом при культивировании в лабораторных условиях. Поэтому диагностика заболевания традиционными методами может затягиваться на срок до нескольких недель.
Фаговая технология позволяет упростить эту задачу. Суть ее в том, что к образцам анализируемой крови добавляют бактериофаг D29, способный поражать широкий спектр микобактерий. Затем бактериофаги отделяют, и образец перемешивают с быстрорастущей непатогенной культурой микобактерий, также чувствительной к этому бактериофагу. Если в крови первоначально имелись микобактерии, которые были инфицированы фагами, то в новой культуре будет также наблюдаться наработка бактериофага. Таким образом можно выявить единичные клетки микобактерий, а сам процесс диагностики с 2—3 недель сокращается до 2—5 дней (Swift & Rees, 2016).
Фаговый дисплей
Из экспериментов Смита последовало два важных вывода: во-первых, используя технологию рекомбинантных ДНК, можно создавать огромные по разнообразию популяции численностью 10 6 –10 14 фаговых частиц, каждая из которых несет на своей поверхности разные варианты белков. Такие популяции назвали комбинаторные фаговые библиотеки. Во-вторых, выделив из популяции конкретный фаг (например, обладающий способностью связываться с определенным белком или органической молекулой), можно этот фаг размножить в бактериальных клетках и получить неограниченное число потомков с заданными свойствами.
На сегодня можно выделить два основных направления применения фагового дисплея. Технология на основе пептидов используется для исследования рецепторов и картирования сайтов связывания антител, создания иммуногенов и нановакцин, а также картирования сайтов связывания субстратов у белков-ферментов. Технология на основе белков и белковых доменов – для отбора антител с заданными свойствами, изучения белок-лигандных взаимодействий, скрининга экспрессируемых фрагментов комплементарной ДНК и направленных модификаций белков.
С помощью фагового дисплея можно вносить узнающие группировки во все виды поверхностных вирусных белков, а также в основной белок, формирующий тело бактериофага. Вводя в поверхностные белки пептиды с заданными свойствами, можно получить целый спектр ценных биотехнологических продуктов. Например, если этот пептид будет имитировать белок опасного вируса или бактерии, узнаваемый иммунной системой, то такой модифицированный бактериофаг представляет собой вакцину, которую можно просто, быстро и безопасно наработать.
Одним из важных применений метода фагового дисплея белков является создание фаговых библиотек рекомбинантных антител, где антигенсвязывающие фрагменты иммуноглобулинов расположены на поверхности фаговых частиц fd или М13. Особый интерес представляют библиотеки антител человека, поскольку такие антитела могут быть использованы в терапии без ограничения. В последние годы только на фармацевтическом рынке США продается около полутора десятка терапевтических антител, сконструированных с использованием этого метода.
Так как вирус представляет собой достаточно жесткую конструкцию с определенным соотношением размерностей, это обстоятельство позволяет использовать его для получения пористых наноструктур с известной площадью поверхности и нужным распределением пор в структуре. Как известно, именно площадь поверхности катализатора является критическим параметром, определяющим его эффективность. А существующие на сегодня технологии формирования на поверхности бактериофагов тончайшего слоя металлов и их оксидов позволяют получать катализаторы с чрезвычайно развитой регулярной поверхностью заданной размерности. (Lee et al., 2012).
Путем покрытия нитчатых фагов золотом и двуокисью индия были получены электрохромные материалы – пористые нанопленки, меняющие цвет при изменении электрического поля, способные реагировать на изменение электрического поля в полтора раза быстрее известных аналогов. Подобного рода материалы перспективны для создания энергосберегающих ультратонких экранных устройств (Nam et al., 2012).
На основе комплексов бактериофага М13, двуокиси титана и одностенных углеродных нанотрубок были также созданы материалы для солнечных батарей (Dang et al., 2011).
Последние годы ознаменовались широкими исследованиями бактериофагов, которые находят себе все новые применения не только в терапии, но и в био- и нанотехнологиях. Их очевидным практическим результатом должно стать возникновение нового мощного направления персонализированной медицины, а также создание целого спектра технологий в пищевой промышленности, ветеринарии, сельском хозяйстве и в производстве современных материалов. Мы ждем, что второе столетие исследований бактериофагов принесет не меньше открытий, чем первое.
Бактериофаги: биология и применение / Ред.: Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир. 2012.
Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир. 1974. 614 с.
Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител // Аcta Naturae. 2009. № 3. C. 6—15.
Mc Grath S., van Sinderen D. Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology. Horizon Scientific Press, 2007.
На нашей планете существуют не только одноклеточные и многоклеточные организмы, но и такие организмы, у которых вообще нет клеток. К ним относятся вирусы, которые считаются переходной формой между живой и неживой природой.
Начало вирусологии было положено российским ботаником Д. И. Ивановским, который в 1852 году впервые получил экстракт из растений табака: они были поражены мозаичной болезнью. После того как экстракт был пропущен через фильтр, задерживающий бактерий, получили отфильтрованную жидкость — она сохранила инфекционные свойства.
В ходе дальнейших исследований ученые пришли к выводу, что с учетом химической природы вирусы можно считать нуклеопротеидами. Но так как размеры вирусов были слишком маленькие, то их нельзя было увидеть в световой микроскоп. По этой причине вирусы начали изучать систематически только в 30-е годы 20 века — это было связано с изобретением электронного микроскопа.
Вирусы отличаются простотой строения. Каждая вирусная частица включает РНК или ДНК, которые являются сердцевиной вируса и содержат наследственную информацию о вирусном строении, а также такого компонента как защитная белковая оболочка (капсида).
Вирион — это полностью сформированная инфекционная частичка.
У отдельных вирусов, таких как вирус герпеса или гриппа, есть дополнительная оболочка, образованная с помощью плазматической мембраны клетки-хозяина.
Еще одна особенность вирусов заключается в способности жить и размножаться только в клетках других организмов. Вне клеток других организмов вирусы жить не могут.
У большинства вирусов внешняя форма напоминает кристалл. Размеры вирусов варьируются от 20 до 300 нм.
Наилучшим образом изучен вирус табачной мозаики. Он отличается палочкообразной формой и является пустотелым цилиндром. Стенки этого вируса образованы при помощи белковых молекул, а внутри находится спираль молекулы РНК. Белковая оболочка выполняет защитную функцию — она защищает нуклеиновую кислоту от неблагоприятного внешнего воздействия и препятствует проникновению ферментов клетки-хозяина к РНК для ее расщепления.
Молекулы вирусной РНК могут самовоспроизводиться. Хотя в основном этот процесс свойственен ДНК. РНК вируса — источник генетической информации, поэтому выполняет и функции иРНК.
В результате в зараженной клетке по программе нуклеиновой кислоты вируса рибосома клетки-хозяина осуществляет синтез специфических вирусных белков. Затем вирусные белки и нуклеиновая кислота самостоятельно собираются в новые вирусные частицы. Происходит истощение и гибель клетки.
Бактериофаги
Вирусы бактерий или бактериофаги — особая группа вирусов, представители которых могут проникать внутрь бактериальной клетки и приводить к ее разрушению.
Тело фага кишечной палочки образует головка: от нее отходит полый стержень, окруженный чехлом в виде сократительного белка. На конце стержня находится базальная пластинка, на которой размещается 6 нитей. В головке содержится ДНК.
К поверхности кишечной палочки бактериофаг прикрепляется за счет отростков. В том месте, где он с этой поверхностью соединяется, он растворяет клеточную оболочку бактерии при помощи фермента. Благодаря тому, что головка сокращается, молекула ДНК проходит через канал стержня в клетку.
Под влиянием ДНК всего через 10-15 минут происходит перестройка метаболизма бактериальной клетки. В результате начинается синтез ДНК бактериофага, а не ДНК клетки. Кроме того, также осуществляется синтез фагового белка. В итоге образуется от 200 до 1000 новых фаговых частиц, а клетка бактерии погибает.
Отдельные фаги не реплицируются в клетке хозяина. Этот процесс заменяется образованием единой молекулы при помощи встраивания нуклеиновой кислоты фагов в ДНК хозяина. Такие фаги называют умеренными.
Значение вирусов
Вирусы, проникающие в клетки живых организмов, становятся причинами различных опасных заболеваний. Это касается и сельскохозяйственных растений и животных, и обитающих в дикой природе.
К таким болезням относятся:
- у растений — мозаическая болезнь томатов, табака, огурцов; скручивание листьев, желтуха, карликовость и др;
- у животных — чума птиц и свиней, бешенство, ящур инфекционная анемия лошадей и др.
Результатом таких болезней являются снижение урожайности культур и гибель животных.
У человека вирусы также вызывают различные опасные заболевания: грипп, корь, оспу, бешенство, полиомиелит, гепатит, паротит и др.
В число опасных заболеваний, вызванных вирусами, входит также СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита. Это заболевание является эпидемическим, поражающим по большей части иммунную систему человека, основная функция которой — защита организма от различных болезнетворных агентов.
В результате поражения системы клеточного иммунитета развиваются прогрессирующие инфекционные заболевания и злокачественные новообразования. Микроорганизмы, которые раньше не вызывали никаких заболеваний, становятся опасными.
В 1983 году ученые выяснили, что вирус СПИДа (ВИЧ) относится к семейству ретровирусов. Он состоит из только ему свойственного фермента, а именно — оборотной транскрпптазы (РНК-зависимая ДНК-полимераза или ревертаза). Все представители ретровирусов имеют в своем составе этот фермент. Открытие этого вируса считается революционным в биологии.
Важно, что передача генетической информации может осуществляться не только по стандартной схеме ДНК-РНК-белок, но и при помощи обратной транскрипции от РНК к ДНК.
Обзор
Автор
Редакторы
Обратите внимание!
Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.
Эволюция и происхождение вирусов
В 2007 году сотрудники биологического факультета МГУ Л. Нефедова и А. Ким описали, как мог появиться один из видов вирусов — ретровирусы. Они провели сравнительный анализ геномов дрозофилы D. melanogaster и ее эндосимбионта (микроорганизма, живущего внутри дрозофилы) — бактерии Wolbachia pipientis. Полученные данные показали, что эндогенные ретровирусы группы gypsy могли произойти от мобильных элементов генома — ретротранспозонов. Причиной этому стало появление у ретротранспозонов одного нового гена — env, — который и превратил их в вирусы. Этот ген позволяет вирусам передаваться горизонтально, от клетки к клетке и от носителя к носителю, чего ретротранспозоны делать не могли. Именно так, как показал анализ, ретровирус gypsy передался из генома дрозофилы ее симбионту — вольбахии [7]. Это открытие упомянуто здесь не случайно. Оно нам понадобится для того, чтобы понять, чем вызваны трудности борьбы с вирусами.
Из давних письменных источников, оставленных историком Фукидидом и знахарем Галеном, нам известно о первых вирусных эпидемиях, возникших в Древней Греции в 430 году до н.э. и в Риме в 166 году. Часть вирусологов предполагает, что в Риме могла произойти первая зафиксированная в источниках эпидемия оспы. Тогда от неизвестного смертоносного вируса по всей Римской империи погибло несколько миллионов человек [8]. И с того времени европейский континент уже регулярно подвергался опустошающим нашествиям всевозможных эпидемий — в первую очередь, чумы, холеры и натуральной оспы. Эпидемии внезапно приходили одна за другой вместе с перемещавшимися на дальние расстояния людьми и опустошали целые города. И так же внезапно прекращались, ничем не проявляя себя сотни лет.
Вирус натуральной оспы стал первым инфекционным носителем, который представлял действительную угрозу для человечества и от которого погибало большое количество людей. Свирепствовавшая в средние века оспа буквально выкашивала целые города, оставляя после себя огромные кладбища погибших. В 2007 году в журнале Национальной академии наук США (PNAS) вышла работа группы американских ученых — И. Дэймона и его коллег, — которым на основе геномного анализа удалось установить предположительное время возникновения вируса натуральной оспы: более 16 тысяч лет назад. Интересно, что в этой же статье ученые недоумевают по поводу своего открытия: как так случилось, что, несмотря на древний возраст вируса, эпидемии оспы не упоминаются в Библии, а также в книгах древних римлян и греков [9]?
Строение вирусов и иммунный ответ организма
Рисунок 1. Первооткрыватель вирусов Д.И. Ивановский (1864–1920) (слева) и английский врач Эдвард Дженнер (справа).
Почти все известные науке вирусы имеют свою специфическую мишень в живом организме — определенный рецептор на поверхности клетки, к которому и прикрепляется вирус. Этот вирусный механизм и предопределяет, какие именно клетки пострадают от инфекции. К примеру, вирус полиомиелита может прикрепляться лишь к нейронам и потому поражает именно их, в то время как вирусы гепатита поражают только клетки печени. Некоторые вирусы — например, вирус гриппа А-типа и риновирус — прикрепляются к рецепторам гликофорин А и ICAM-1, которые характерны для нескольких видов клеток. Вирус иммунодефицита избирает в качестве мишеней целый ряд клеток: в первую очередь, клетки иммунной системы (Т-хелперы, макрофаги), а также эозинофилы, тимоциты, дендритные клетки, астроциты и другие, несущие на своей мембране специфический рецептор СD-4 и CXCR4-корецептор [13–15].
Одновременно с этим в организме реализуется еще один, молекулярный, защитный механизм: пораженные вирусом клетки начинают производить специальные белки — интерфероны, — о которых многие слышали в связи с гриппозной инфекцией. Существует три основных вида интерферонов. Синтез интерферона-альфа (ИФ-α) стимулируют лейкоциты. Он участвует в борьбе с вирусами и обладает противоопухолевым действием. Интерферон-бета (ИФ-β) производят клетки соединительной ткани, фибробласты. Он обладает таким же действием, как и ИФ-α, только с уклоном в противоопухолевый эффект. Интерферон-гамма (ИФ-γ) синтезируют Т-клетки (Т-хелперы и (СD8+) Т-лимфоциты), что придает ему свойства иммуномодулятора, усиливающего или ослабляющего иммунитет. Как именно интерфероны борются с вирусами? Они могут, в частности, блокировать работу чужеродных нуклеиновых кислот, не давая вирусу возможности реплицироваться (размножаться).
Причины поражений в борьбе с ВИЧ
Тем не менее нельзя сказать, что ничего не делается в борьбе с ВИЧ и нет никаких подвижек в этом вопросе. Сегодня уже определены перспективные направления в исследованиях, главные из которых: использование антисмысловых молекул (антисмысловых РНК), РНК-интерференция, аптамерная и химерная технологии [12]. Но пока эти антивирусные методы — дело научных институтов, а не широкой клинической практики*. И потому более миллиона человек, по официальным данным ВОЗ, погибают ежегодно от причин, связанных с ВИЧ и СПИДом.
Подобный вирусный механизм характерен не только для ВИЧ. Он описан и при инфицировании некоторыми другими опасными вирусами: такими, как вирусы Денге и Эбола. Но при ВИЧ антителозависимое усиление инфекции сопровождается еще несколькими факторами, делая его опасным и почти неуязвимым. Так, в 1991 году американские клеточные биологи из Мэриленда (Дж. Гудсмит с коллегами), изучая иммунный ответ на ВИЧ-вакцину, обнаружили так называемый феномен антигенного импринтинга [23]. Он был описан еще в далеком 1953 году при изучении вируса гриппа. Оказалось, что иммунная система запоминает самый первый вариант вируса ВИЧ и вырабатывает к нему специфические антитела. Когда вирус видоизменяется в результате точечных мутаций, а это происходит часто и быстро, иммунная система почему-то не реагирует на эти изменения, продолжая производить антитела к самому первому варианту вируса. Именно этот феномен, как считает ряд ученых, стоит препятствием перед созданием эффективной вакцины против ВИЧ.
Открытие биологов из МГУ — Нефёдовой и Кима, — о котором упоминалось в самом начале, также говорит в пользу этой, эволюционной, версии.
Сегодня не только ВИЧ представляет опасность для человечества, хотя он, конечно, самый главный наш вирусный враг. Так сложилось, что СМИ уделяют внимание, в основном, молниеносным инфекциям, вроде атипичной пневмонии или МЕRS, которыми быстро заражается сравнительно большое количество людей (и немало гибнет). Из-за этого в тени остаются медленно текущие инфекции, которые сегодня гораздо опаснее и коварнее коронавирусов* и даже вируса Эбола. К примеру, мало кто знает о мировой эпидемии гепатита С, вирус которого был открыт в 1989 году**. А ведь по всему миру сейчас насчитывается 150 млн человек — носителей вируса гепатита С! И, по данным ВОЗ, каждый год от этой инфекции умирает 350-500 тысяч человек [33]. Для сравнения — от лихорадки Эбола в 2014-2015 гг. (на состояние по июнь 2015 г.) погибли 11 184 человека [34].
* — Коронавирусы — РНК-содержащие вирусы, поверхность которых покрыта булавовидными отростками, придающими им форму короны. Коронавирусы поражают альвеолярный эпителий (выстилку легочных альвеол), повышая проницаемость клеток, что приводит к нарушению водно-электролитного баланса и развитию пневмонии.
Рисунок 8. Электронная микрофотография воссозданного вируса H1N1, вызвавшего эпидемию в 1918 г. Рисунок с сайта phil.cdc.gov.
Почему же вдруг сложилась такая ситуация, что буквально каждый год появляются новые, всё более опасные формы вирусов? По мнению ученых, главные причины — это сомкнутость популяции, когда происходит тесный контакт людей при их большом количестве, и снижение иммунитета вследствие загрязнения среды обитания и стрессов. Научный и технический прогресс создал такие возможности и средства передвижения, что носитель опасной инфекции уже через несколько суток может добраться с одного континента на другой, преодолев тысячи километров.
Читайте также: