Выделение вируса в клеточной культуре

Обновлено: 28.03.2024

Метод выделения вирусов гриппа человека и животных, включая высоко патогенные штаммы вирусов гриппа птиц, в клеточных культурах является высоко чувствительным тестом при использовании клинических образцов высокого качества.

Предназначен для вирусологов, микробиологов, эпидемиологов. Его использование позволяет, в первую очередь, значительно повысить эффективность изоляции эпидемических штаммов из клинических материалов (смывы, аспираты, секционный материал), а также расширить число выделяемых возбудителей с составлением более полной картины о природе вирусных популяций, циркулирующих среди людей, что необходимо для более полного понимания закономерностей распространения и эволюции возбудителей, прогнозирования эпидемий, а также быстрого распознавания появления нового пандемического вируса гриппа типа А.

Методические рекомендации подготовлены проф., д.м.н.А.А.Сомининой и к.м.н.Е.И.Бурцевой (при участии специалистов ГУ НИИ гриппа РАМН Т.Г.Лобовой, Н.И.Коноваловой, Т.М.Гудковой, к.б.н.О.М.Литвиновой, а также специалистов ГУ НИИ вирусологии РАМН проф., д.м.н.А.Н.Слепушкина и д.б.н.В.Т.Ивановой).

При подготовке настоящих Методических рекомендаций были использованы инструктивные материалы, разработанные WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza (CDC, Atlanta, USA), за предоставление которых авторы выражают свою искреннюю благодарность.

1. Введение

Важным преимуществом метода изоляции перед другими тестами является получение инфекционного вируса, который может быть далее использован для антигенного и генетического анализа, а также выяснения таких важнейших свойств возбудителя, как чувствительность к химиопрепаратам, неспецифическим ингибиторам, тропизм к разным системам хозяина и др. Ряд факторов (трудоемкость, необходимость использования высоко чувствительных клеточных линий, длительность анализа, высокая стоимость) ограничивает использование метода выделения вирусов гриппа в качестве диагностического теста. В прошлые годы для этих целей, как правило, использовали куриные эмбрионы, однако изменение тропизма современных вирусов с резким снижением частоты изоляции в них возбудителей гриппа обусловило необходимость широкого лабораторного применения клеточных культур. Одной из таких линий, которая была рекомендована экспертами ВОЗ, является перевиваемая культура клеток, полученная из почек собаки породы спаниель - MDCK. Вместе с тем, поскольку кандидаты в вакцинные штаммы должны быть изолированы на куриных эмбрионах, лабораториям, располагающим такими возможностями рекомендуется использовать для выделения вирусов гриппа обе системы. В любом случае исходные клинические материалы необходимо хранить до начала следующего эпидемического сезона при низкой температуре (-70°С) для обеспечения возможностей выделения наиболее перспективных в антигеном отношении штаммов в куриных эмбрионах в специализированных лабораториях научно-исследовательских институтов.

2. Описание метода

2.1. Формула метода

Суть метода заключается в заражении сформированного монослоя клеток MDCK, характеризующихся наиболее высокой чувствительностью к современным вирусам гриппа, клиническими материалами, полученными от больных гриппоподобными заболеваниями. Инфицированные культуры инкубируют в термостате при 37°С, контролируя под микроскопом состояние монослоя, а также периодически определяют наличие гемагглютининов в культуральной среде. При развитии специфического цитопатического действия, проявляющегося в разрушении монослоя, культуральную жидкость используют для типирования вирусного изолята в реакции торможения гемагглютинирущей активности (РТГА), а также осуществляют последующий пассаж в целях накопления вируса, который затем направляют в холодовом режиме в соответствующие Центры по гриппу (Федеральный центр по гриппу и ОРВИ на базе ГУ НИИ гриппа РАМН или Центр экологии и эпидемиологии гриппа на базе ГУ Института вирусологии им.ДИ.Ивановского РАМН) для последующей идентификации и изучения особенностей антигенной структуры возбудителя.

Непременным условием успешного выделения вирусов являются правильный сбор клинических материалов, соответствующий состав транспортных сред, соблюдение условий доставки материалов в лабораторию (на холоду и в кратчайшие сроки) и безотлагательное заражение заранее подготовленных клеточных культур.

2.2. Показания и противопоказания к применению метода

Показанием к применению метода является рост гриппа и острых респираторно-вирусных заболеваний, регистрация вспышек гриппа среди людей, а также среди птиц, обследование контактных лиц из групп риска в случае появления у них симптомов гриппа. Противопоказания к использованию метода отсутствуют.

2.3. Материально-техническое обеспечение

Для выполнения работ по изоляции вирусов гриппа в клеточной культуре MDCK необходимо иметь 2 набора реагентов, один из которых предназначен для субкультивирования клеток, а второй - непосредственно для работ по выделению вирусов из материалов от больных.

2.3.1. Перечень материалов, необходимых для субкультивирования клеток MDCK (из расчета на 10 пассажей):

Клеточная культура MDCK (7 млн.) в монослое, выращенном во флаконе Т 25*

_______________
* - как указано выше

Модифицированная среда Игла D-MEM, "GIBCO BRL", (США), кат. N 11965-092, производитель - "Биолот" (Санкт-Петербург) или среда Игла MEM с двойным набором аминокислот (Предприятие при ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) ФС 42-94 ВС-88

Альбумин бычий, фракция V, 7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011

HEPES - буфер 1М раствор, рН 7,2, "Sigma" (СШA), кат. N Н0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023

Эмбриональная сыворотка КРС, "Sigma" (США), кат. N F3018 или Ну Clone Lab.Inc, кат. N A-1111-L

Раствор для отторжения клеточной культуры (0,05% трипсин в смеси с 0,53 мМ раствором EDTA .4Na) "GIBCO BRL", США, кат. N 25300-054 или раствор химопсина (0,125 мг/мл) на 0,53 мМ растворе версена

Пенициллин, ОАО "Красфарма", ГФХ ст.95

Стрептомицин, ОАО "Биохимик", ГФХ стр.636

Флакон для культивирования клеток Т 25, "Sarstedt" (Германия), кат. N 7245082

Примечание: набор может храниться при +4°С в течение 6 месяцев (за исключением клеточной культуры MDCK, которая подлежит непрерывному субкультивированию, но не более 10-20 пассажей, после чего ее чувствительность понижается, что определяет необходимость ее повторного восстановления из криобанка). Культура получена из CDC, Atlanta (USA), хранится в Коллекциях клеточных культур при ГУ НИИ гриппа РАМН и ГУ Институт вирусологии им Д.И.Ивановского РАМН.

2.3.2. Перечень материалов, необходимых для изоляции вирусов гриппа (рассчитан на проведение 100 анализов):

А. Транспортная среда (для получения и доставки клинических материалов):

Среда 199 на растворе Хенкса, "Биолот" (Санкт-Петербург) или Предприятие при ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов (Москва)

Альбумин бычий, V фракция (7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011

HEPES - буфер 1М раствор, рН 7,2, "Sigma"(CLUA), кат. N Н0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023

Гентамицин "ХИНОИН", Венгрия, кат. N АТС: JOIGB03

Тампоны стерильные для взятия мазков

Б. Растворы для культивирования клеток (10 пассажей) и выделения вирусов (100 анализов):

Среда Игла в модификации Дальбекко (DMEM) или среда Игла MEM с двойным набором аминокислот *

_______________
* - как указано выше

Эмбриональная сыворотка КРС*

_______________
* - как указано выше

Альбумин бычий, фракция V, 7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011

Трипсин ТРСК, тип XIII, "Sigma", США, кат.N Т1426 (расфасован по 200 мкг/амп.)

Раствор для отторжения клеточной культуры*

_______________
* - как указано выше

HEPES - буфер 1М раствор, рН 7,2, "Sigma"(CUIA), кат. N Н0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023

Пенициллин* 500 ед.

_______________
* - как указано выше

Стрептомицин* 0,5 г.

_______________
* - как указано выше

Дистиллированная вода (для растворения трипсина ТРСК), ГОСТ 6709-72

Глицерин АО "Каустик" ГОСТ 6259-75 кв "Z"

В. Клеточная культура MDCK* (в монослое, флакон Т25, 7 млн.клеток)

_______________
* - как указано выше

Среда Игла с сывороткой для транспортирования клеток*

Флакон культуральный Т25*

_______________
* - как указано выше

Насадка фильтрующая шприцевая GyroDisc, размер пор 0,2 мкм, "Биолот"

Примечание: Набор хранится при +4°С в течение 6 мес. После растворения трипсин ТРСК и антибиотики хранить при температуре не выше -20°С, а остальные компоненты набора - при 4°С.

2.3.3. Материалы и оборудование для постановки реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации в целях индикации и идентификации выделенных вирусов:

Автоматическая пипетка с переменным объемом 5-50 мкл

Наконечники для автоматических пипеток до 200 или 250 мкл

Пипетки 10,0 мл; 5,0 мл и 1,0 мл

Эритроциты человека 0 (I) группы крови, 0.75%

Сыворотки диагностические гриппозные к различным субтипам вируса гриппа А и к вирусу гриппа В, ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов" при ГУ НИИ гриппа РАМН, ВФС 42-03215509-04

2.3.4. Оборудование

Бокс ламинарный II уровня защиты Холодильник бытовой (4 ± 1) °С

Рефрижератор (-70 ±2)°С

Центрифуга лабораторная (до 3000 об/мин) Термостат (36 ± 1)°С, желательно - CO инкубатор

Микроскоп биологический (МБИ-3) или инвертированный (ЛОМО, Россия или Unico 1 V 900, United Product and Instrum. Inc., США )

2.4. Описание метода

Принцип метода заключается в заражении сформированного в пенициллиновых флаконах (или пробирках) монослоя клеток MDCK клиническими образцами, полученными от больных с симптомами гриппа.

Инфицированные культуры инкубируют при 35-37°С, желательно в инкубаторе с подачей воздуха в смеси 5% СО. Ежедневно контролируют состояние монослоя. При появлении первых признаков размножения вируса вируссодержащую культуральную жидкость исследуют на наличие гемагглютининов в среде, которую используют далее для накопления вируса. Полученные изоляты направляют в холодовом режиме в соответствующие Центры по гриппу. Использование метода изоляции вирусов гриппа в клеточной культуре MDCK в дополнение к известному способу выделения вирусов гриппа на куриных эмбрионах позволяет резко расширить диапазон выделяемых возбудителей с составлением наиболее полной картины о структуре циркулирующих вирусных популяций, что необходимо для надзора за гриппом, понимания закономерностей эволюции возбудителя и прогнозирования предстоящих эпидемий, а также составления рекомендаций по штаммовому составу вакцин и диагностических препаратов на предстоящий эпидемический сезон.

Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.

Забор материала для выявления вирусов

При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.

Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций

Выделение и культивирование вирусов

Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.

Культуры клеток для выявления вирусов

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3~4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Культуры клеток пригодны для выделения большинства вирусов животных.

Для этой цели используют как первично-трипсинизированные, так и перевиваемые и диплоидные культуры клеток.

Заражение культур клеток проводят следующим образом. Из пробирок или матрасов с выросшим монослоем клеток удаляют ростовую питательную среду, отмывают монослой клеток от ростовой среды (в ней могут быть антитела к исследуемому вирусу и неспецифические ингибиторы) раствором Хенкса и вносят вируссодержащий материал. После контакта (1—1,5 ч), необходимого для адсорбции вируса на клетках, вируссодержащий материал удаляют и вносят поддерживающую питательную среду, которая не способствует размножению клеток, но обеспечивает их жизнедеятельность. Пробирки и матрасы помещают в термостат для инкубации. Адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают в клетки, репродуцируются в них и выходят в культуральную жидкость, заражают новые клетки, затем следующие и так до тех пор, пока не останется живых клеток.

Обнаружить вирус в клетках можно следующими методами (или признаками):

1) по цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическому эффекту (ЦПЭ). ЦПД — это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Для обнаружения ЦПД зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД могут быть весьма разнообразными, что зависит от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т. д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2—3 сут после заражения (энтеровирусы), другие — 1—2 нед (аденовирусы). Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация, округление клеток, симпластобразование.

Фрагментация — разрушение клеток на отдельные фрагменты (вирус везикулярного стоматита и др.).

Округление — клетки принимают шаровидную форму и отделяются от стекла (адено-, пикорнавирусы и др.).

Симпластобразование — образование гигантских клеток: цитоплазма соседних клеток сливается вследствие растворения клеточных оболочек и образуется одна большая клетка со многими ядрами (вирус ПГ-3, чумы крупного рогатого скота и др.);

2) с ее помощью в культуре клеток можно обнаружить некоторые вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами: вирусы ПГ-3, гриппа и др. реакцией гемадсорбции. Гемадсорбцией называется прилипание (адсорбция) эритроцитов крови на поверхности клеток, зараженных вирусом. Этот метод широко используется при диагностике ПГ-3 крупного рогатого скота, при этом используют эритроциты морской свинки;

4) обнаружения вируса в РИФ. В том случае, если размножение вирусов в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить при помощи флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусных инфекций, бешенства и др.;

5) иммунопероксидазной реакцией;

6) путем обнаружения внутриклеточных включений. Для выявления телец-включений культуру клеток выращивают на покровных стеклах, помещенных в пробирки, заражают испытуемым материалом и через определенные сроки инкубации (при 37 °С), стекла промывают, фиксируют и окрашивают различными методами (гематоксилин-эозином, акридиновым оранжевым и др.).

Размножающиеся в культурах клеток вирусы частично или полностью (в зависимости от степени разрушения клеток) выходят в культуральную жидкость, которая и используется как готовая суспензия вируса. Если не все клетки культуры разрушились в результате размножения в них вируса, то их разрушают путем 2—3-кратного замораживания и оттаивания или ультразвуком.

Животные модели для обнаружения вирусов. Идентификация вирусов. Качественное определение вирусов. Цитопатические эффекты вирусов. Бляшкообразование вируса. Тельца включений вирусов.

При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили клеточные культуры. Тем не менее животные модели активно используют для изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях. j

Идентификация вирусов

Животные модели для обнаружения вирусов. Идентификация вирусов. Качественное определение вирусов

Цитопатические эффекты вирусов оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.

Бляшкообразование вирусов

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Температурный режим культивирования вирусов. Накопление вируса в среде.

Температурные границы и температурный оптимум размножения вирусов контролируется вирусным геномом, хотя в известной степени они зависят и от клеточной системы. Принято считать, что оптимальная температура для размножения большинства вирусов 36—37°С. Однако из этого правила имеются исключения. Например, для риновирусов температурный оптимум размножения равен 33—34°С. Герпесвирус 2 крупного рогатого скота максимально накапливается в первичной культуре клеток телят при 32°С. Вирус гриппа С, в отличие от вирусов гриппа А и В, лучше размножается при 32—33°С, хотя накапливается медленнее. Ряд альфавирусов накапливается в постоянной линии клеток комаров при 34,5°С в значительно большем титре, чем при оптимальной температуре, требующейся для размножения этих клеток.

температура культивирования вирусов

В случаях, когда при высокой множественности заражения наблюдается торможение репродукции вируса за счет аутоинтерференции (феномен Магнуса), прибегают к удалению дефектных интерферирующих частиц (ДИЧ) или других ингибирующих субстанций. Применительно к безоболочечным вирусам хорошие результаты получают с помощью простой обработки вирусного инокулята фреоном или хлороформом.

При медленном накоплении вируса и невозможности обеспечения высокой множественности заражения вирус часто вносят в культуру одновременно с посевом клеток.
Иногда с целью повышения выхода применяют повторные сборы вируса путем смены среды в период выраженного накопления. Этот прием особенно эффективен при культивировании постоянных клеточных линий, хронически инфицированных вирусом (например ВЛ КРС) и экскретирующим его в культуральную среду. Кроме сохранения зрелого внеклеточного вируса, такая операция может способствовать его репродукции за счет уменьшения концентрации ингибиторов в культуре. Заметное влияние на репродукцию вирусов оказывает рН поддерживающей среды. Так, вирус бешенства гораздо интенсивнее размножался в культуре клеток КЭ при повышении рН поддерживающей среды от 7,4 до 8,2. Как показало изучение структуры вирусной популяции, при щелочном рН не происходит накопления ДИЧ и отсутствует аутоинтерференция.

Вирус Сендай не продуцировал инфекционных частиц в культурах клеточных линий. Обработка инфицированных клеток трипсином восстанавливала его биологическую активность благодаря расщеплению гликопротеина F (65 кД) на две субъединицы FI (51 кД) и F2 (15 кД). Для изоляции и культивирования парамиксовирусов человека весьма эффективной оказалась линия клеток NCI-H292 при использовании поддерживающих сред с добавлением трипсина (1,5 мкг/мл). Установлено, что вирус ньюкаcлской болезни содержит два предшественника гликопротеинов HNo и Fo, которые в результате протеолиза превращаются соответственно в гликопротеины HN и F С ними связана гемолитическая, гемагглютинирующая, нейраминидазная и инфекционная активность вируса. Существенные различия штаммов вируса ньюкаелской болезни по патогенности определяются структурными особенностями гликопротеинов наружной оболочки вириона, которые отличаются способностью активироваться протеолитическими ферментами. Наличие трипсина в поддерживающей среде стимулировало репродукцию вируса осповакцины. Протеолитический процессинг вирусных гликопротеинов зависит от природы вируса, а также от клеточных факторов культуральной системы. В наибольшей степени от протеолитической активизации зависит репродукция оболочечных вирусов, клетками-мишенями которых in vivo являются энтероциты. К таким вирусам прежде всего относятся ротавирусы млекопитающих и птиц, кишечные коронавирусы свиней и некоторые аденовирусы. Классическим примером протеолитической активации могут служить ротавирусы, выделение и культивирование которых стало возможным благодаря применению трипсина.

Обработка трипсином значительно способствует выделению и репродукции вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, и обеспечивает размножение в культуре клеток Vero вируса эпизоотической диареи поросят. Вирус эпизоотической диареи свиней (ВЭДС) размножался в культуре клеток Vero только в присутствии трипсина (10 мкг/мл) в поддерживающей среде. ЦПЭ проявлялся образованием синцития. После ряда пассажей в клетках Vero в присутствии трипсина удалось адаптировать вирус к культурам клеток МА 104, СРК и ESK при добавлении трипсина. Попытка адаптировать вирус к шести типам первичных культур клеток эмбриона свиньи не увенчалась успехом. Использование этой, ставшей теперь рутинной, методики позволило размножить астровирус человека в первичной культуре клеток почки эмбриона человека и обезьян. После 11 пассажей вируса в культуре его размножение оставалось трипсинзависимым. Аналогичным образом удалось адаптировать астровирус крупного рогатого скота (штамм US2, серотипа 2) к размножению в культуре клеток новорожденного теленка. Вирус размножался в серийных пассажах только в присутствии трипсина. На ранних пассажах вирус накапливался в культу-ральной среде через семь суток, а в последующем — через трое. Количество инфицированных клеток в культуре было невысоким и не превышало 10—20%. Значение штамма, клеточного субстрата и протеолитической активации в репродукции вирусов можно проследить на примере ротавирусов птиц и кишечных аденовирусов человека. Ротавирус птиц с трудом культивируется в присутствии трипсина, вызывая ЦПЭ в культуре клеток печени и почек КЭ. После трех пассажей вирус терялся в культуре клеток печени, но полностью адаптировался к клеткам почек.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Читайте также: