Заражение лабораторных животных вирусами

Обновлено: 18.04.2024

Вируссодержащий материал может быть введен лабораторным животным различными методами. Наиболее часто используются заражения: подкожное (п/к), внутрикожное (в/к), внутримышечное (в/м), внутрибрюшинное (в/б), внутривенное (в/в), интраназальное (и/н), интраце-ребральное (и/ц). Однако в каждом конкретном случае исследователь стоит перед выбором введения материала каким-то одним способом.

Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Под тропизмом вируса понимают способность его репродуцироваться в определенных типах клеток организма. Вирусы, репродуцирующиеся в нервных клетках, называются нейротропными (например, вирус бешенства), репродуцирующиеся в клетках кожи - дермотропными (например, вирус оспы), в клетках легких - пневмотропными (вирус гриппа). Вирусы, способные репродуцироваться в нескольких типах клеток, называются политропными (вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в клетках органов дыхания и размножения), а во всех типах клеток - пантропными (вирус чумы собак).

Зная тропизм вируса, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. Например, вирус гриппа вводят интраназально, вирус оспы - внутрикожно, вирус бешенства - интрацеребрально. Пантропные вирусы лучше разносятся по организму при введении их внутривенно или внутрибрюшинно.

Если же исследователь не имеет данных о тропизме находящегося в материале вируса, то заражают животных нескольких групп разными методами.

Объем заражающей дозы материала значительно варьирует в зависимости от метода внесения и вида животных (0,1-5,0 мл).

За зараженными животными ведут наблюдения, отмечая изменения в их поведении, появление специфических симптомов болезни в соответствии с инкубационным периодом данной инфекции.

Действие вируса проявляется на лабораторных и естественно-восприимчивых животных следующим образом: 1) гибелью через определенный период времени; 2) развитием клинических признаков болезни; 3) патоморфологическими изменениями в органах и тканях павших животных.

Известно, что фильтрующиеся вирусы в отличие от микробов не развиваются на искусственных питательных средах. Поэтому для культивирования их применяют другие методы: используются лабораторные модели культуры клеток, лабораторных животных и куриные эмбрионы.

В последнее время очень часто для культивирования вирусов применяют куриные эмбрионы (КЭ). Они имеет ряд преимуществ перед лабораторными животными:

Куриные эмбрионы дешевле лабораторных животных (яйцо в два - три раза дешевле белой мыши).

Не требуется затрат на содержание.

Легко фиксировать, проще работать.

Курные эмбрионы в большинстве случаев свободны от возбудителей спонтанных, скрытых вирусных заболеваний КЭ и в вирусологических лабораториях применяется с целью:

Выделения вируса из исследуемого материала.

Накопления вируса путем пассажа.

Получения живых и убитых эмбрион - вакцин.

Изучения свойств вирусов.

Куриные эмбрионы с успехом можно применять и для культивирования хламидий, риккетсий, бруцелл и других микроорганизмов.

Свежее племенное яйцо для КЭ желательно отбирать крупное с непигментированной скорлупой (лучше от кур породы Леггорн), от крупного эмбриона можно больше собрать вируссодержащего материала и в нем хорошо видны при овоскопии эмбрион и пуга. Кроме того эмбрионы породы Леггорн легко заражаются и неприхотливы к условиям инкубации.

Эмбрион должен быть не старше 7-9 суток, иначе будет большой отход при заражении.

Инкубацию производят при температуре +37°С - +38°С и относительной влажности 40-50% и яйца переворачивают 2-3 раза в день.

Схема строения КЭ в возрасте 7-9 дней

6. Хорионаллантоисная оболочка.

Под скорлупой находится перепончатая или подскорлуповая оболочка, которая у тупого конца раздваивается - один слой идет под скорлупой, окаймляя пугу (воздушную камеру), а другой над белком. Примерно в центре развивается эмбрион. Последний окружен аминионом, с противоположной стороны от аминиона находится желточная полость (мешок).

С 3-го дня начинает развиваться аллантоисная полость, где скапливаются продукты обмена КЭ, он огибает желток, распространяется к тупому концу, огибает зародыш и срастается с хорионом, располагающемся под скорлуповой оболочкой и образуется хорионаллантоисная оболочка. В остром конце яйца будет остаток белка, а в тупом пуга.

Через хорионаллантоисную оболочку осуществляется газообмен. Желток является главным резервуаром питательных веществ для зародыша. В аллантоис впервые дни выделяются продукты обмена веществ эмбриона, а по мере рассасывания белка аллантоис является поставщиком воды и минеральных веществ. Амнион служит буферной камерой для эмбриона. По мере роста и развития эмбриона объем желтка и белка уменьшается, а аллантоисная и амниотическая полость увеличивается.

Для заражения используют эмбрионы в возрасте 7-12 суток. Раньше 7 дней эмбрионы мелкие и плохо проводить заражение, а старше 12 дней КЭ не рекомендуется использовать, во- первых, потому что жидкость полостей мутнеет и при хранении ее соли оседают в виде хлопьев, на которых также может адсорбироваться вирус. Во- вторых, на коже эмбриона появляется пушок, на котором также может адсорбироваться вирус.

Важным условием при работе с КЭ является соблюдение асептики. Необходимо предотвратить попадание в яйцо микробов. Если микробы попадут в яйцо, то они быстрее разовьются, чем вирус, и эмбрион может погибнуть еще до накопления вируса. Поэтому необходимо соблюдать следующие правила:

В лаборатории должны быть бокс с бактерицидными лампами и ионизатор, перед работой с КЭ бокс следует подвергать обработке этими лампами в течение 2-3 часов.

Пользоваться только стерильными инструментами.

Работа в боксе проводится в халатах, головных уборах.

Строго соблюдать правила предварительной обработки скорлупы.

Перед заражением необходимо убедиться в жизнеспособности эмбриона. Для этого в затемненной комнате проводят овоскопию. Если эмбрион жив, то он будет смещаться, сокращаться. Можно различить туловище, глаза (темное пятно правильной округлой формы). Сосуды красные, хорошо наполненные кровью, иногда видна пульсация крупных сосудов. Если эмбрион погиб, то он не шевелится, мертвый эмбрион темнее, сосуды темные, эмбрион "болтается". При овоскопии отмечают простым карандашом контуры пути, а крестиком предлежание эмбриона - глазок. Иногда можно отметить крупные сосуды и некоторые полости.

Для выявления возбудителя инфекций вирусов простого герпеса используют вирусоскоспический, вирусологический, биологический и серологические методы.

Материал для исследования инфекций вирусов простого герпеса — содержимое пузырьков, слюна, соскобы роговицы и др.

• При микроскопии мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе, выявляют многоядерные гигантские клетки (клетки Цанка) с тельцами включений (тельца Коудри).

• Для выделения вирусов простого герпеса используют культуры клеток и проводят посев исследуемого материала на куриные эмбрионы. В культурах клеток вирусы образуют бляшки (бляшки, образованные ВПГ 2-го типа крупнее) и дают характерный цитопатический эффект на куриных эмбрионах.

• Заражение лабораторных животных вирусом простого герпеса применяют редко. При заражении мозга белых мышей развивается специфический энцефалит; при заражении роговицы кроликов — герпетический кератит. Активность возбудителей in vivo нейтрализуют стандартные иммунные антисыворотки.

• Сывороточные AT к вирусам простого герпеса выявляют при РН, РСК или ИФА; однако ввиду значительной инфицированности населения обнаружение сывороточных AT не имеет существенной диагностической ценности. Большую ценность представляет выявление Аг вирусов в исследуемом материале методами РП и иммунодиффузии. Также используют РИФ с моноклональными AT,

Лечение и профилактика инфекций вируса простого герпеса

Поражения, вызванные ВПГ 1-го типа, обычно проходят самостоятельно и требуют лишь проведения местных мероприятий, направленных на профилактику вторичного бактериального инфицирования очагов поражения.

При тяжёлых поражениях назначают ацикловир; возможно его наружное применение в составе специальных мазей и кремов. При плохой переносимости препарата назначают фамцикловир, реже вызывающий побочные эффекты.

Для специфической иммунопрофилактики разработаны инактивированные вакцины, многократная иммунизация которыми снижает частоту рецидивов герпетической инфекции.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Не все виды клеток способны расти в виде монослон, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживающей ткани.

Куриные эмбрионы при диагностике вирусных инфекций

Куриные эмбрионы (рис. 11-20) — практически идеальные модели для культивирования некоторых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проникновению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирования и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбудители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распознавать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.

Заражение вирусом на хорион-аллантоисную мембрану. Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобождают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают отверстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, свободный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обработанный бактерицидами). Заражение в амниотическую полость. Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.

Заражение вирусом в аллантоисную полость. 10-суточные эмбрионы заражают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).

Рис. 11-20. Схематическое изображение развивающегося куриного эмбриона.

Наблюдение и учет результатов заражении вирусом куриного эмбриона

В качестве вируссодержащего материала можно использовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими тканями на кусочки. Для выявления характерных поражений на хорион-аллантоисной мембране удаляют скорлупу и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.

Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.

Забор материала для выявления вирусов

При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.

Выделение и культивирование вирусов

Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.

Культуры клеток для выявления вирусов

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3~4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Установление у зараженных животных симптомов болезни. Вскрытие зараженных животных с целью обнаружения патологоанатомических изменений и получения вируссодержащего материала. Получение отпечатков мозга.

Оборудование и материалы

Суспензии вирусов эктромелии и осповакцины; кролики; белые мыши; клетки для животных; кюветы с восковым дном; стерилизаторы со стерильными инструментами (шприцами, инъекционными иглами, пинцетами анатомическими 14 и 10 см, ножницами глазными); вата; спирт; эфир для наркоза; банка вместимостью 0,5 л с крышкой; стерилизованные ватные тампоны в бумажной упаковке (ватики); стерильный физиологический раствор; фильтровальная бумага; стекла предметные; раствор пикриновой кислоты, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

Объяснение преподавателя

ПРИЗНАКИ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСА В ОРГАНИЗМЕ ЛАБОРАТОРНОГО ЖИВОТНОГО

В последующие за заражением дни ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. В случае размножения вируса в чувствительных к нему клетках организма последние повреждаются или гибнут. При значительном количестве поврежденных вирусом клеток нарушается функционирование части или всего органа. Это проявляется соответствующими изменениями в состоянии и поведении животного. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга - судороги, парезы, параличи и т. д.

Видимые изменения в состоянии и функционировании организма называют клиническими признаками болезни, а появление их после экспериментального заражения считают косвенным доказательством размножения вируса. При этом учитывают не только сам факт и характер появившихся изменений, но и продолжительность инкубационного периода, которая характерна для определенной болезни. Инкубационный период зависит не только от свойств возбудителя, но и от дозы вируса, пути его проникновения в организм и состояния самого организма.

Клинические признаки, появившиеся у лабораторных животных, зараженных с целью биопробы (обнаружения вируса), указывают на то, что в исследуемом патматериале содержался вирус. Эти признаки большей частью носят неспецифический характер (например, угнетение, снижение аппетита, одышка и т. п.), и на этом этапе исследований еще нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболевание. Для этого необходимо идентифицировать обнаруженный вирус с помощью серологических реакций. При этом неизвестным антигеном является выделенный вирус, содержащийся в материале, полученном при вскрытии использованного для биопробы животного. Нередко заболевание заканчивается гибелью, что также бывает через определенное время после заражения и служит одним из признаков размножения вируса в организме. На размножение вируса в организме указывают не только клинические признаки и гибель животного, но и видимые изменения самих органов и тканей, которые, как говорилось выше, возникают в связи с гибелью зараженных вирусом клеток. Патологоанатомические признаки выражаются изменением цвета, размера, формы и консистенции органов, а также в появлении образований, в норме не встречающихся.

Зараженное, но не проявившее признаков болезни животное убивают через интервал времени, равный двум инкубационным периодам, и берут при вскрытии патологический материал, предположительно содержащий размножившийся и накопившийся вирус.

По тому же принципу делают третий пассаж и в случае появления признаков заболевания приходят к заключению о присутствии вируса в исследуемом материале. Полученный от реагировавшего животного вируссодержащий материал считают выделенным вирусом.

При биопробе с целью обнаружения вируса на других лабораторных живых системах поступают по тому же принципу.

Вирусы же, для обнаружения и выделения которых используют естественно восприимчивых животных, не нуждаются в предварительной адаптации и проявляют себя в биопробе определенными признаками уже на первом пассаже.

Читайте также: