Живые или мертвые вирусы
Обновлено: 19.04.2024
Относящийся к данному классу атомно-силовой микроскоп оказался инструментом, подходящим для исследования биологических объектов и позволил не только визуализировать наноразмерные структуры, но и манипулировать ими. В частности, принципиально возможной оказалась манипуляция одиночными вирионами и прямое измерение сил, возникающих при их контакте с поверхностью клетки. Такие эксперименты позволяют получать подробные данные о самом первом и во многих случаях еще недостаточно исследованном этапе заражения клетки — адгезии вируса к ее поверхности. Данные исследования представляют и значительный практический интерес, т.к. могут дать ключ к созданию эффективных противовирусных препаратов, защищающих клетки от проникновения вирусов.
Об авторе
Вирусы являются чрезвычайно малыми объектами — их размеры лежат в диапазоне от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров. Первым и на долгое время единственным методом прямой визуализации наноразмерных частиц стала электронная микроскопия (ЭМ), которая начала развиваться в 1930-е гг. Метод, оказавшийся очень информативным, позволил не только детально охарактеризовать структуру различных вирусов, но и исследовать процессы, происходящие в зараженной клетке.
Оказалось, что форма вирусных частиц отличается большим разнообразием: от правильных сфер до сложных структур, напоминающих кирпичи, обклеенные трубочками (вирус натуральной оспы), или щетинистых червей (вирус геморрагической лихорадки Эбола).
Вне клетки любой вирус является всего лишь молекулярным контейнером с генетическим материалом (ДНК или РНК) и вряд ли может считаться полноценным живым организмом, хотя по этому вопросу в научной среде до сих пор нет окончательной терминологической определенности.
Так, исследование репликации вируса методом просвечивающей электронной микроскопии на ультратонких срезах выглядит следующим образом: зараженные клетки обрабатывают фиксирующим раствором, обезвоживают спиртом и заливают специальной смолой. После отвердевания смолы с помощью специального прибора — ультратома — делают ультратонкие (≈ 50 нм) срезы, которые затем наносят на специальную сетку и обрабатывают растворами солей тяжелых металлов. Во время самого микроскопического исследования образец находится в вакуумной камере и подвергается действию пучка электронов с энергией в несколько десятков кэВ. Очевидно, что прижизненная визуализация в данном случае принципиально невозможна.
В течение почти полувека электронная микроскопия оставалась единственным методом визуализации наноразмерных объектов. Однако в начале 1980-х гг. эта монополия была нарушена появлением сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ). Основным принципом СЗМ является сканирование — прецизионное (с высокой точностью) перемещение зонда вблизи исследуемой поверхности, сопряженное с отслеживанием определенного параметра, характеризующего взаимодействие между зондом и образцом. Результатом такого сканирования является топографическая карта рельефа поверхности образца.
Первым прибором СЗМ стал сканирующий туннельный микроскоп (СТМ), который мог лишь весьма ограниченно использоваться для визуализации биологических объектов, так как для его работы требовалась высокая электрическая проводимость исследуемой поверхности.
В 1986 г. швейцарский физик Г. Бинниг и его коллеги создали новый прибор семейства СЗМ — атомно-силовой микроскоп (АСМ). В основе его работы лежит силовое (Ван-дер-Ваальсово) взаимодействие атомов зонда и поверхности. АСМ не требуется электрическая проводимость поверхности образца, и он может осуществлять съемку в жидкой среде. Поэтому этот прибор оказался удобным инструментом для исследования биологических объектов.
Принципиальная схема работы атомно-силового микроскопа (АСМ). Чувствительным элементом АСМ является упругая консоль (кантилевер), на конце которой закреплен острый зонд. Силы, возникающие между атомами острия зонда и исследуемой поверхностью приводят к деформации кантилевера, которая в свою очередь фиксируется при помощи оптической системы, реализованной в большинстве современных АСМ на основе полупроводникового лазера и четырехсекционного фотоприемника. Размер кантилевера — 100÷300 × 20÷40 мкм при толщине около 2 мкм. Высота зонда — около 10 мкм
С момента появления атомно-силового микроскопа было опубликовано огромное число работ, посвященных АСМ-визуализации самых разнообразных биологических образцов. Следует все же признать, что в большинстве случаев в плане визуализации АСМ не дает ничего принципиально нового в сравнении с обычной электронной микроскопией, поэтому зачастую данный метод воспринимается биологами как техническая экзотика, а не как полноценный исследовательский инструмент.
Однако важнейшим, пусть и почти единственным преимуществом визуализации биологических объектов при помощи АСМ по сравнению с электронной микроскопией является возможность выполнения исследований нативных, природных образцов без какой-либо фиксации и специальной пробоподготовки, при физиологических параметрах среды.
Помимо визуализации рельефа поверхности с субнанометровым разрешением АСМ позволяет осуществлять прямое измерение сил, возникающих при взаимодействии одиночных наноразмерных объектов.
Проводятся такие измерения следующим образом: один объект закрепляется на острие зонда АСМ, а второй фиксируется на подложке, после чего зонд подводится к поверхности подложки до достижения механического контакта, а затем возвращается обратно. В ходе этого перемещения отслеживается деформация упругой консоли (кантилевера). Зависимость этого параметра от расстояния между зондом и подложкой называется силовой кривой. С ее помощью можно определить величину силы, действующей между исследуемыми объектами. Этот метод, названный атомно-силовой спектроскопией (АСС), может использоваться для исследования силовых характеристик взаимодействия самых разнообразных малых объектов: от неорганических наночастиц до вирусов и живых клеток.
Метод атомно-силовой спектроскопии позволяет определить величину силы, действующей между исследуемыми объектами. Для этого один объект закрепляется на острие зонда АСМ, а второй фиксируется на подложке. Зонд подводится к поверхности подложки и затем поднимается обратно. Зависимость деформации кантилевера от расстояния между зондом и подложкой называется силовой кривой
Начальным этапом заражения клетки вирусом является адгезия (прилипание) вирусной частицы (вириона) к клеточной поверхности с последующим проникновением генетического материала вируса внутрь клетки. Этот процесс, определяемый взаимодействием белковых рецепторов, расположенных на поверхности клетки, с поверхностными белками вириона, является критически важным для размножения вируса. И, надо отметить, в большинстве случаев изучен недостаточно.
Однако фиксация одиночной вирусной частицы на острие зонда атомно-силового микроскопа является весьма непростой задачей. Для успешного проведения эксперимента требуется большая подготовительная работа:
- получить как можно более чистый и концентрированный препарат вируса;
- подготовить на острие зонда площадку подходящего размера для посадки вириона;
- химически активировать поверхность зонда для образования ковалентных связей при контакте с белками вируса;
- убедиться в том, что на зонде закрепился действительно вирион, а не молекулы свободного белка или мелкие фрагменты клеток, всегда присутствующие в препаратах вирусов.
Оценка концентрации и степени чистоты препарата вируса обычно проводится методом просвечивающей электронной микроскопии. Площадку на острие АСМ-зонда, которое обычно изготавливают из кремния или его нитрида, формируют путем длительного сканирования кремниевой или сапфировой подложки при больших значениях развертки и силы прижатия зонда к поверхности. Наиболее наглядной иллюстрацией для этого процесса служит изменение формы острия карандаша в ходе интенсивного рисования.
Адекватным методом контроля геометрических параметров зонда атомно-силового микроскопа (а) при создании площадки для посадки вириона, является электронная микроскопия, как сканирующая, так и просвечивающая: б — площадка на острие зонда для посадки крупной вирусной частицы; в — вирусоподобная частица, закрепленная на острие зонда. Просвечивающая электронная микроскопия (JEM 1400, Jeol, Япония)
По меркам микроскопии, клетка высших организмов является относительно крупным (≈ 10 мкм) объектом, поэтому хорошо видна в световом микроскопе, при помощи которого на нее наводится кантилевер атомно-силового микроскопа. Но как быть с самим зондом, на острие которого предполагается наличие вириона? Строго говоря, вместо вириона там может оказаться все, что угодно: монослой белковых молекул, фрагмент клетки или вириона, агрегат из нескольких вирионов, случайное загрязнение и т. д. Кроме того, в процессе измерения вирион может разрушиться или оторваться от зонда. Визуализация же зонда с вирусной частицей методом электронной микроскопии до силовых измерений недопустима, так как под воздействием высушивания, вакуума и пучка электронов вирион приобретет необратимые изменения.
Наиболее эффективным методом решения данной проблемы оказалась визуализация острия зонда АСМ с помощью электронной микроскопии, осуществляемая непосредственно после силовых измерений. Если на острие будет обнаружена вирусная частица, уцелевшая в ходе эксперимента, то все сомнения развеются.
В течение последних пятидесяти лет в результате поистине титанической работы, проделанной электронными микроскопистами всего мира, накоплен огромный багаж знаний в области ультраструктурных аспектов репликации различных вирусов. Создание атомно-силового микроскопа и техники силовой спектроскопии позволило вплотную приблизиться к произвольной механической манипуляции одиночными вирусными частицами. Это выводит изучение взаимодействия вируса с клеткой на принципиально другой уровень — от структурных исследований к функциональным.
При этом атомно-силовая спектроскопия не является конкурентом для электронной микроскопии, а открывает новое самостоятельное направление исследований — наномеханику взаимодействия вирусной частицы с поверхностью клетки. Весьма вероятно, что в самом ближайшем будущем в данном направлении будут совершены фундаментальные открытия, соизмеримые по значимости с достижениями электронной микроскопии в середине прошлого века.
Изучение механизмов связывания вирусных частиц с поверхностью клетки вызывает значительный интерес не только с позиции фундаментальной науки, но и в контексте практических приложений. Более детальное понимание этих механизмов на молекулярном уровне может дать человечеству ключ к созданию эффективных противовирусных препаратов, защищающих клетки от проникновения вирусов.
В публикации использованы фото автора
* Просвечивающая электронная микроскопия с использованием специальной жидкостной ячейки и сканирующая электронная микроскопия при атмосферном давлении позволяют исследовать биологические объекты без фиксации, но из-за ряда технических трудностей и относительно низкого пространственного разрешения эти методы не получили широкого распространения.
Однако вирусы не могут синтезировать белок самостоятельно. К тому же вне клетки они перестают демонстрировать хотя бы какие-то признаки чего-то живого, превращаясь просто в набор молекул. Это уже свидетельствует о том, что перед нами – неживой объект. Так куда же их всё-таки отнести?
Спор учёных
Вопрос того, к чему отнести вирусы, терзает учёных с тех пор, как эти своеобразные организмы, если их так вообще можно назвать, были открыты в XIX веке. С одной стороны, у них отсутствует целый ряд признаков чего-то живого, они в большей степени зависят от других клеток, чем какие-либо ещё.
Разгадка кроется в происхождении вирусов
Американские учёные, проводившие в течение длительного времени исследования природы вирусов, предложили свой взгляд на проблему. В 2015 году они нашли доказательства того, что вирусы относятся к живой природе. Учёные института Карла Вёзе решили разобраться в том, откуда они вообще взялись. Благодаря анализу белковых цепей было установлено, что у вирусов и других клеток намного больше общего, чем изначально предполагалось. Однако в процессе эволюции произошло упрощение. Оно помогало вирусам выживать в тех условиях, которые были неподходящими для полноценных клеток. В итоге живая природа приняла известную нам сейчас форму.
Таким образом, данное открытие свидетельствует о том, что вирусы принадлежали к объектам живой природы. Исследователи говорят о том, что их до сих пор можно воспринимать с подобной позиции. И, возможно, точку в споре о том, чем они на самом деле являются, поставит не очередное открытие, а просто изменение взгляда на то, что стоит считать живым, а что – нет.
Совсем другие
Таким образом, как подчёркивают исследователи, то, что мы принимаем за признак неживого, может указывать как на обратное. Просто в очень незнакомом нам виде.
В последние годы в науке всё большее распространение получает точка зрения, согласно которой вирусы – это нечто промежуточное между живым и неживым. И поэтому вполне закономерно, что они обладают признаками как того, так и другого. И именно так их и нужно воспринимать. По крайней мере, пока учёные не нашли доказательств обратного.
Но и Дженнер не имел представления о том, что является причиной заболевания оспой. В XIX веке все болезнетворные организмы и вещества без разбора называли вирусами. Лишь благодаря опытам отечественного биолога Дмитрия Иосифовича Ивановского прекратилась эта путаница! Он пропускал экстракт заражённых табачной мозаикой 1 растений через бактериальные фильтры, сквозь которые не проходят даже самые мелкие бактерии. Выяснилось, что экстракт оставался по-прежнему заразным для других растений. Значит, возбудителями табачной мозаики были организмы, меньшие по размеру, чем бактерии; их назвали фильтрующимися вирусами. Вскоре бактерии перестали называть вирусами, а сами вирусы выделили в отдельное царство живых организмов. Дмитрий Ивановский же во всём мире по праву считается основателем вирусологии — науки о вирусах.
Рис. 2. Дженнер прививает Джеймса Фиппса от оспы
Но что мы пока поняли про вирусы? Только то, что они меньше бактерий. Чем же вирусы так не похожи на другие организмы? И почему понадобилось вдруг их выделять в отдельное царство? А вот почему. В отличие от других живых организмов, вирусы не имеют клеточного строения, а значит, и всех характерных для клетки структур. А ещё они единственные, кто не умеет самостоятельно производить белок, главный строительный материал всего живого. Поэтому их размножение невозможно вне заражённой клетки. Из-за этого многие учёные не без оснований считают вирусы внутриклеточными паразитами.
Жертвами различных вирусов становятся представители всех без исключения существующих царств живых организмов! Так, есть вирусы растений — вирус табачной мозаики (рис. 3, слева), вирус мозаики костра (это растение изображено на рисунке 3, справа), вирус желтухи свёклы, вызывающий иногда даже эпидемии. Кстати, в растение вирус просто так не проникнет. Заражение происходит при травмах растительных тканей. Типичный пример: тля пьёт сок из стебля и для этого протыкает покровные ткани — а вирус тут как тут.
Рис 3. Слева: листья табака, поражённые вирусом табачной мозаики. Справа: костёр (лат. Brómus) — род многолетних травянистых растений семейства Злаки. Если посмотреть на заросли костра в ветреную погоду, его крупные метёлки, склоняясь под ветром то в одну, то в другую сторону, отсвечивают красноватым светом в солнечных лучах, очень напоминая языки пламени. Отсюда, вероятно, и произошло русское название этого растения
Грибы тоже поражаются вирусами, вызывающими, например, побурение плодовых тел у шампиньонов или изменение окраски у зимнего опёнка. Причиной многих опасных заболеваний животных и человека тоже служат вирусы: вирус гриппа, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), вирус Эбола, вирус бешенства, герпеса, клещевого энцефалита и т. д.
Есть даже вирусы, поражающие бактерии, их называют бактериофагами 2 . Так, в конце XIX века исследователи из Института Пастера заметили, что вода некоторых рек Индии обладает бактерицидным действием, то есть способствует снижению роста бактерий. И достигалось это благодаря присутствию в речной воде бактериофагов.
Рис. 4. Слева: вирус табачной мозаики. В центре: вирус мозаики костра похож на футбольный мяч (справа)
Рис. 5. Слева направо: вирус герпеса, аденовирус А человека, бактериофаг
Рис. 6. Маленькие вирусы-спутники внутри гигантского мимивируса
Но не стоит думать, что вирусы причиняют исключительно вред другим организмам! Так, исследователи из Пенсильванского университета показали, что безвредный для человека вирус AAV2, встречающийся почти у всех людей, убивает самые разные виды раковых клеток. При этом здоровые клетки организма вирус не заражает.
А совсем недавно стало известно, что вирусы тоже болеют. Мимивирус, поражающий амёбу Acanthamoeba polyphaga, сам страдает от другого вируса-спутника (рис. 6). Он, кстати, так и называется — Спутник. Этот вирус-спутник использует механизмы воспроизводства мимивируса для собственного размножения, мешая ему нормально развиваться в клетке амёбы. По аналогии с бактериофагами, он был назван вирофагом, то есть пожирающим вирусы. Можно сказать, что присутствие вируса-спутника в амёбе обеспечивает ей больше шансов на выживание в борьбе с мимивирусом.
Всегда ли вирусы опасны и как использовать их на благо человечества?
- 01 Природа вирусов
- 02 Живые ли вирусы?
- 03 Что вы знаете о вирусах?
- 04 Механизмы вирусного заражения
- 05 Кого заражают вирусы?
- 06 Вирусы в организме человека
- 07 Стратегии выживания вирусов
- 08 Вирусное наследство в геноме человека
- 09 Почему вирусы так важны для эволюции?
- 10 Эндогенные вирусы
- 11 Защитные механизмы организмов
- 12 Противовирусные препараты
- 13 Сможете одолеть вирус?
- О гиде
- 01 Природа вирусов
- 02 Живые ли вирусы?
- 03 Что вы знаете о вирусах?
- 04 Механизмы вирусного заражения
- 05 Кого заражают вирусы?
- 06 Вирусы в организме человека
- 07 Стратегии выживания вирусов
- 08 Вирусное наследство в геноме человека
- 09 Почему вирусы так важны для эволюции?
- 10 Эндогенные вирусы
- 11 Защитные механизмы организмов
- 12 Противовирусные препараты
- 13 Сможете одолеть вирус?
Другие гиды и курсы ПостНауки
Психология познавательных процессов
15 лекций психолога Марии Фаликман о процессе мышления, феноменах восприятия, памяти, внимания и воображения
Фонология
Как отдельные звуки превращаются в речь
Европейская традиция частного права
12 лекций юриста Дмитрия Дождева о римских истоках современного права
Ядерное топливо будущего
Как меняется ядерная энергетика в XXI веке и какие технологии помогают ее развивать
Читайте также:
Вирусы пугают: мы их не видим, но они заставляют нас болеть. Мы воспринимаем вирусы как угрозу, однако они сыграли ключевую роль в эволюции живого на Земле, и многие функции организма мы получили именно благодаря вирусным генам в нашей ДНК. Современные вирусы тренируют нашу иммунную систему, а ученые используют их для лечения болезней и создания энергоэффективных материалов. В этом гиде мы разберемся, как устроены и какими бывают вирусы. Сколько вирусов живет в организме человека? Как иммунная система защищается от вирусной угрозы? Какие вирусы на самом деле вредны, а какие полезны? И какие существуют вирусные технологии? Гид будет дополняться, так что сохраняйте его в личном кабинете, чтобы не потерять!
доктор биологических наук, заведующий отделом межклеточного взаимодействия Национальных институтов здоровья США, профессор факультета Биоинженерии и биоинформатики МГУ им. Ломоносова
Что такое вирусы
Как открыли вирусы и чем они отличаются от других патогенов
Почувствуйте себя вирусологом
Следите за прогрессом
Вирус и хозяин
Вирусолог Леонид Марголис о том, какие бывают вирусы, как они заражают и от чего зависит их патогенность
Какие организмы подвержены вирусным заболеваниям
Вирусолог Леонид Марголис о сосуществовании с вирусами и о том, можно ли родиться с вирусом и жить с ним всю жизнь
Симбиоз человека и вируса
Вирусолог Леонид Марголис о вирусных мутациях, приспособляемости и симбиозе с человеком
Вирусолог Леонид Марголис о том, как вирусы попадают в геном человека
Как вирусы оказались одним из важнейших факторов эволюции живого
О полезных и вредных генах вирусов в нашем геноме, о том, как вирусы встраиваются в ДНК и как вирусные последовательности связаны с шизофренией и другими болезнями
Противостояние вирусам
Как вирусы проникают в организм, можем ли мы от них защититься и чем нам помогает высокая температура
Какие болезни не лечатся лекарствами и правы ли антипрививочники
Проверьте, сможете ли вы одолеть вирус.