Гост 31468-2012 продукты пищевые метод выявления бактерий рода salmonella

Обновлено: 25.04.2024

ГОСТ Р 57480-2017

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ УБОЯ ПТИЦЫ, ПРОДУКЦИЯ ИЗ МЯСА ПТИЦЫ И ОБЪЕКТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ СРЕДЫ

Метод выявления сальмонелл ускоренным способом

Poultry slaughtering products, poultry meat products and environment production objects. Salmonella identification by quick method

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом птицеперерабатывающей промышленности - филиалом Федерального государственного бюджетного научного учреждения Федерального научного центра "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства" Российской академии наук (ВНИИПП)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 116 "Продукты переработки птицы, яиц и сублимационной сушки"

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Август 2018 г.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется:

- на продукты убоя птицы (тушки, части тушек, жир-сырец, кожу, субпродукты, мясо птицы механической обвалки, кость птицы пищевую, сырье коллагенсодержащее), полуфабрикаты из мяса птицы, в том числе высокой степени готовности, и яичные продукты, предназначенные для пищевых целей (далее - продукты);

- продукцию из мяса птицы и яиц сельскохозяйственной птицы, готовую к употреблению - колбасные, кулинарные изделия, консервы и др. (далее - готовые продукты);

- объекты окружающей производственной среды (технологическое оборудование, тара, инвентарь, стены и пол производственных цехов, воздух в производственных цехах, одежда и поверхность рук работников).

Настоящий стандарт устанавливает ускоренный метод качественного обнаружения сальмонелл (далее - бактерии рода Salmonella) с использованием тест-пластины, содержащей дегидратированный питательный гелеобразующий хромогенный субстрат на подложке.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 7702.2.0 Продукты убоя птицы, полуфабрикаты из мяса птицы и объекты окружающей производственной среды. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям

ГОСТ 8756.0 Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию

ГОСТ 9792 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 10444.1 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ ISO 11133 Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред

ГОСТ ISO 16140 Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов

ГОСТ 28489 Микроскопы световые. Термины и определения

ГОСТ 31468 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл

ГОСТ 31659 (ISO 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

ГОСТ Р 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р 52313 Птицеперерабатывающая промышленность. Продукты пищевые. Термины и определения

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52313, ГОСТ 7702.2.0, ГОСТ 31468, а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1 тест-пластина для определения бактерии рода Salmonella: Дегидратированная дифференциально-диагностическая среда на подложке, содержащая хромогенные субстраты и растворимое в холодной воде гелеобразующее вещество.

4 Сущность метода

Метод выявления бактерии рода Salmonella ускоренным способом основан на высеве определенного количества пробы в жидкие неселективные и селективные среды с последующим высевом на плотную дифференциально-диагностическую среду, выделении культур, имеющих типичные для бактерий рода Salmonella морфологические, культуральные признаки, с последующей их идентификацией по биохимическим свойствам и серологическим реакциям.

5 Требования безопасности

5.1 Общие требования проведения микробиологических исследований, в том числе требования безопасности к работе с микроорганизмами III и IV групп патогенности - по ГОСТ ISO 7218, [1].

5.2 При подготовке и проведении анализа необходимо соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

5.3 Помещение, в котором проводят анализ, должно быть оснащено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

5.4 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ Р 12.1.019.

5.5 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218.

6 Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды

Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды - по ГОСТ 7702.2.0 со следующими дополнениями:

- микроскоп биологический, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением 900х-1000х по ГОСТ 28489;

- тест-пластина для определения бактерии рода Salmonella по документации изготовителя;

- диск для биохимической идентификации бактерии рода Salmonella, содержащий биохимический субстрат, облегчающий биохимическое подтверждение присутствия бактерии рода Salmonella по документации изготовителя;

- среда для неселективного предварительного обогащения - забуференная пептонная вода по ГОСТ 7702.2.0;

- бульон Рапаппорта-Вассилиадиса (R-V R10) по 8.4;

- распределитель для тест-пластин по документации изготовителя;

- губка (спонж) для отбора образцов с нейтрализующим раствором по ГОСТ 7702.2.0;

- пептонно-солевой раствор для приготовления разведений по ГОСТ 7702.2.0;

- мясо-пептонный агар по ГОСТ 7702.2.0;

- сухие агглютинирующие адсорбированные поливалентные О-сыворотки; Vi-, Н-агглютинирующие сыворотки для серологической идентификации бактерии рода Salmonella по ГОСТ 7702.2.0;

- физиологический раствор по ГОСТ 7702.2.0;

- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

7 Подготовка к проведению анализа

Для отбора проб окружающей среды используют губку (спонж) с нейтрализующим раствором, не содержащую антимикробных веществ.

Размер участка пробы для проверки присутствия или отсутствия патогенов на поверхности составляет 100 см (10х10 см). Забирая пробу с помощью губки, покрывают весь участок в двух направлениях (слева направо, затем сверху вниз).

7.2 Подготовка посуды - по ГОСТ 31468.

7.3 Подготовка тест-пластин к анализу - по [2].

7.4 Температура проб перед анализом должна быть в пределах комнатной температуры от 18°С до 22°С.

8 Приготовление питательных сред, сыворотки и селективной добавки

8.1 Пептонно-солевой раствор для приготовления разведений - по ГОСТ 7702.2.0.

8.2 Среда для неселективного предварительного обогащения - забуференная пептонная вода - по ГОСТ 7702.2.0.

8.3 Селективная добавка к среде неселективного предварительного обогащения

- малахитовый зеленый оксалат;

Весовые характеристики и приготовление - в соответствии с инструкцией изготовителя.

ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002)*
____________________
* Поправка (ИУС 5-2015).

Метод выявления бактерий рода Salmonella

Food products. Method for the detection of Salmonella spp

____________________________________________________________________
Текст Сравнения ГОСТ 31659-2012 с ГОСТ Р 52814-2007 см. по ссылке.
- Примечание изготовителя базы данных.
____________________________________________________________________

Дата введения 2013-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ ВНИИКОП) на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 20 июля 2012 г. N 50)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2012 г. N 715-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31659-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ISO 6579:2002* Microbiology of food and animal feeding staffs** - Horizontal method for the detection of Salmonella spp. (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод выявления Salmonella spp.) в части пищевых продуктов. При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребности экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом***.

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей.

*** В оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие", приложении ДА и по тексту документа отмеченные знаком "**" приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом. - Примечания изготовителя базы данных.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие в ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в приложении ДА.

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

ВНЕСЕНЫ: поправка*, опубликованная в ИУС N 5, 2015 год; поправка, опубликованная в ИУС N 1, 2022 год, введенная в действие с 23.08.2021

* См. ярлык "Примечания".

Поправки внесены изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной массе или объеме продукта бактерий рода Salmonella, включая Salmonella Typhi и Salmonella Paratyphi.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления бактерий рода Salmonella.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9536-79 Спирт изобутиловый технический. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 бактерии рода Salmonella: Микроорганизмы, которые на агаризованных селективно-диагностических средах образуют типичные или не совсем типичные колонии.

Примечание - Описание и методы определения биохимических и серологических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.

3.2 выявление бактерий рода Salmonella: Определение присутствия или отсутствия бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

4 Сущность метода

4.1 Общие положения

Метод выявления бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта состоит из четырех этапов (см. 4.2; 4.3; 4.4; 4.5 и приложение А).

4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в продукте в небольшом количестве вместе с большим количеством других бактерий из семейства Enterobacteriaceae или других семейств. Поэтому предварительное обогащение необходимо для выявления небольшого числа бактерий рода Salmonella или сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella.

Навеску массой 25 г вносят в забуференную пептонную воду, затем инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч.

Для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение (см. 8.1.2).

Для большего эффекта перед внесением навески продукта забуференную пептонную воду нагревают до температуры (37±1) °С.

4.3 Обогащение в селективной жидкой среде

Среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) и одну из двух сред: Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон) или селенитовую среду - инокулируют культурой, полученной по 4.2. После посева RVS-бульон инкубируют при температуре (41,5±1,0) °С в течение (24±3) ч, а МКТ-бульон и селенитовую среду - при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.4 Пересев на чашки для идентификации

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две селективные агаризованные среды:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-arap) и

- на одну из следующих агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.5 Проведение идентификации

Колонии, предположительно относящиеся к бактериям рода Salmonella, полученные на чашках по 4.4, идентифицируют с помощью биохимических и серологических тестов.

5 Питательные среды, реактивы и сыворотки

5.1 Общие положения

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества (не ниже ч.д.а. или х.ч.).

5.2 Питательные среды и реактивы

Состав и приготовление питательных сред и реактивов указаны в приложении В.

5.2.1 Среда для неселективного предварительного обогащения: забуференная пептонная вода по В.1.

5.2.2 Первая селективная обогатительная среда: среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) по В.2.

5.2.3 Вторая селективная обогатительная среда: селенитовая среда по В.3.

5.2.4 Третья селективная обогатительная среда: тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (МКТ-бульон) по В.4.

5.2.5 Агаризованные селективные среды для чашек.

5.2.5.1 Первая среда: ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-arap) по В.5.

ГОСТ Р 57480-2017

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ УБОЯ ПТИЦЫ, ПРОДУКЦИЯ ИЗ МЯСА ПТИЦЫ И ОБЪЕКТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ СРЕДЫ

Метод выявления сальмонелл ускоренным способом

Poultry slaughtering products, poultry meat products and environment production objects. Salmonella identification by quick method

Предисловие

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Август 2018 г.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется:

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8756.0 Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию

ГОСТ 28489 Микроскопы световые. Термины и определения

ГОСТ 31468 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл

ГОСТ 31659 (ISO 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

ГОСТ Р 52313 Птицеперерабатывающая промышленность. Продукты пищевые. Термины и определения

3 Термины и определения

4 Сущность метода

5 Требования безопасности

5.4 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ Р 12.1.019.

5.5 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218.

6 Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды

Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды - по ГОСТ 7702.2.0 со следующими дополнениями:

- микроскоп биологический, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением 900х-1000х по ГОСТ 28489;

- тест-пластина для определения бактерии рода Salmonella по документации изготовителя;

- среда для неселективного предварительного обогащения - забуференная пептонная вода по ГОСТ 7702.2.0;

- бульон Рапаппорта-Вассилиадиса (R-V R10) по 8.4;

- распределитель для тест-пластин по документации изготовителя;

- губка (спонж) для отбора образцов с нейтрализующим раствором по ГОСТ 7702.2.0;

- пептонно-солевой раствор для приготовления разведений по ГОСТ 7702.2.0;

- мясо-пептонный агар по ГОСТ 7702.2.0;

- физиологический раствор по ГОСТ 7702.2.0;

- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

7 Подготовка к проведению анализа

7.2 Подготовка посуды - по ГОСТ 31468.

7.3 Подготовка тест-пластин к анализу - по [2].

7.4 Температура проб перед анализом должна быть в пределах комнатной температуры от 18°С до 22°С.

8 Приготовление питательных сред, сыворотки и селективной добавки

8.1 Пептонно-солевой раствор для приготовления разведений - по ГОСТ 7702.2.0.

8.2 Среда для неселективного предварительного обогащения - забуференная пептонная вода - по ГОСТ 7702.2.0.

8.3 Селективная добавка к среде неселективного предварительного обогащения

- малахитовый зеленый оксалат;

Весовые характеристики и приготовление - в соответствии с инструкцией изготовителя.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает методы выявления бактерий Listeria monocytogenes.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ ISO 11133-1-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть I. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории

ГОСТ ISO 11133-2-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

ГОСТ ISO 16140-2011 Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 бактерии рода Listeria: Микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на плотных селективных средах и являются грамположительными неспорообразующими короткими палочками, иногда почти коккоподобными, располагающимися одиночно или короткими цепочками, реже образующие длинные нити.

3.2 Listeria monocytogenes: Микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на плотных селективных средах и идентифицируемые по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.

Примечание - Описание и методы определения морфологических, культуральных и биохимических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.

3.3 выявление Listeria monocytogenes: Определение наличия или отсутствия Listeria monocytogenes в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

В настоящем стандарте используют следующие сокращения:

ALOA - агар Listeria по Оттавиани и Агости;

ГРМ - гидролизат рыбной муки;

ИФА - иммуноферментный анализ;

МПА - мясопептонный агар;

МПБ - мясопептонный бульон;

ПАЛ - питательный агар для выделения листерий;

ПБЛ - питательный бульон для выделения листерий;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

TSYEA - триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом;

TSYEB - триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом.

Метод выявления бактерий L. monocytogenes в определенной массе или объеме продукта состоит из четырех последовательных этапов (см. 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 и приложение А).

5.1 Первичное обогащение анализируемой пробы в жидкой среде со сниженной концентрацией селективных компонентов (полуконцентрированный бульон Фразера) при температуре 30°С в течение 24 ч.

Примечание - Бактерии рода Listeria в продукте могут находиться в небольшом количестве, очень часто на фоне значительного количества микроорганизмов других родов. Поэтому для выявления небольшого количества бактерий рода Listeria, а также "поврежденных" клеток в пробе необходим этап селективного обогащения на среде с пониженной концентрацией селективных компонентов.

5.2 Вторичное обогащение посевного материала, полученного по 5.1 в жидкой среде с полной концентрацией селективных компонентов (бульон Фразера) при температуре (37±1)°С в течение 48 ч.

5.3 Пересев посевного материала, полученного по 5.1 и 5.2, параллельно на две плотные селективные среды:

а) первая среда (обязательная): ALOA;

б) вторая среда: одна из плотных селективных сред, на выбор лаборатории, дополнительно к агару по 5.3 (а), такие как Оксфорд агар, Палкам агар или ПАЛ.

Посевы на ALOA культивируют при температуре (37±1)°С и просматривают через (24±3) ч, а при необходимости еще через (24±3) ч, контролируя наличие роста характерных для L. monocytogenes колоний.

Посевы на второй селективной среде культивируют при соответствующей температуре и просматривают на наличие роста колоний с характерным для бактерий рода Listeria ростом после определенного времени.

5.4 Идентификация отобранных колоний

Пересев колоний, полученных по 5.3, с характерным ростом для бактерий рода Listeria и вида Listeria monocytogenes на плотные питательные среды и культивирование при температуре (37±1)°С в течение (24±3) ч и их идентификация по соответствующим морфологическим, культуральным и биохимическим признакам.

6.1 Общие требования

Состав и приготовление питательных сред и реактивов - в соответствии с приложением Б.

6.2 Селективные среды первичного обогащения

В качестве селективных сред первичного обогащения могут быть использованы следующие среды.

6.2.1 Бульон Фразера полуконцентрированный - по Б.1.1.

6.2.2 Селективный накопительный бульон UVM - по Б.1.2.

6.2.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I) - по Б.1.3.

6.3 Селективные среды вторичного обогащения

В качестве селективных сред вторичного обогащения могут быть использованы следующие среды.

6.3.1 Бульон Фразера - по Б.2.1.

6.3.2 Селективный накопительный бульон (UVM II) - по Б.2.2.

6.3.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II) - по Б.2.3.

6.4 Селективные плотные среды

6.4.1 Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA) - по Б.3.1.1.

6.4.2 Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar) - поБ.3.1.2.

В качестве второй среды необходимо использовать одну из следующих:

6.4.3 Оксфорд агар - по Б.3.2.1.

6.4.4 Палкам агар - по Б.3.2.2.

6.4.5 Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ) - по Б.3.2.3.

6.5 Питательные среды для изучения культурально-морфологических свойств бактерий рода Listeria

6.5.1 Плотные питательные среды

6.5.1.1 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) - по Б.4.1.1.

6.5.1.2 Трипказо-соевый агар (TSA) - по Б.4.1.2.

6.5.1.3 Мясопептонный агар (МПА) - по Б.4.1.3.

6.5.2 Жидкие питательные среды

6.5.2.1 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) - по Б.4.2.1.

6.5.2.2 Трипказо-соевый бульон (TSB) - по Б.4.2.2.

6.5.2.3 Мясопептонный бульон (МПБ) - по Б.4.2.3.

6.6 Среды и реактивы для идентификации бактерий рода Listeria

6.6.1 Раствор с объемной долей перекиси водорода 3% - по ГОСТ 10444.1.

6.6.2 Растворы и реактивы для окраски по Граму - по ГОСТ 10444.1.

6.6.3 Коммерческие наборы для окраски по Граму - согласно инструкции изготовителя.

6.6.4 Среда для определения подвижности бактерий - по Б.8.

6.6.5 Среда для определения лецитиназной активности - по Б.10.1 и Б.10.2.

6.7 Среды и реактивы для идентификации бактерий вида Listeria monocytogenes

6.7.1 Среда и реактив для определения β-гемолитической активности

6.7.1.1 Кровяной агар - по Б.5.

6.7.1.2 Суспензия из эритроцитов барана - по Б.6.

6.7.2 Буфер фосфатно-солевой - по Б.11.

6.7.3 Среда для проведения КАМП-теста - по Б.9.

6.7.4 Среды для определения ферментативных свойств культуры - по Б.7.1 и Б.7.2.

6.7.5 Углеводы - по Б.7.1.2.

6.7.5.3 альфа-метил D-маннозид (Methyl α-D-mannopyranoside ).

Аппаратура и материалы по ГОСТ 10444.1 и ГОСТ ISO 7218 со следующими дополнениями.

рН-метр с точностью измерения ±0,1 ед. рН.

Шкаф сушильный стерилизационный для сухой стерилизации или автоклав для влажной стерилизации.

Термостат, поддерживающий температуру между (25±1)°С и (50±1)°С.

Термостаты, поддерживающие температуры: (25±1)°С, (30±1)°С, (37±1)°С.

Баня водяная, поддерживающая температуру 44°С - 47°С.

Петля, игла из платиново-иридиевого или никель-хромового сплава или пластиковая диаметром около 3 мм.

Шпатели стеклянные формы хоккейной клюшки.

Колбы и флаконы необходимой вместимости.

Дозаторы автоматические переменного объема.

Наконечники одноразовые, стерильные для дозаторов.

Чашки Петри стеклянные или пластиковые диаметром от 90 до 100 мм.

Микроскоп для фазово-контрастной микроскопии.

Примечание - Допускается применение средств измерений, аппаратуры с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не хуже указанных.

Отбор проб - по ГОСТ 26668.

Проба должна быть представительной, а также без повреждений и изменений при транспортировании и хранении.

Подготовка проб - по ГОСТ 26670.

Схема проведения испытания приведена в приложении А.

10.1 Проба для анализа и исходная суспензия

Анализируемую пробу X (г или см 3 ) вносят в селективную среду первичного обогащения, исходя из соотношения продукта и среды 1 : 9.

10.2 Первичное обогащение

Исходную суспензию (см. 10.1) культивируют при температуре (30±1)°С в течение (24±3) ч.

10.3 Вторичное обогащение

10.3.1 Посевной материал, полученный по 10.2 в объеме 0,1 см 3 , пересевают в пробирку, содержащую 10 см 3 среды обогащения (см. 6.3).

10.3.2 Посевы (см. 10.3.1) культивируют в течение (48±2) ч при температуре (37±1)°С.

10.4 Пересев на плотные селективные среды

10.4.1 Из пробирок с посевами (см. 10.2) после культивирования с помощью петли или шпателя (см. 7.5) проводят пересев на поверхность первой плотной селективной среды (см. 6.4.1) так, чтобы получить хорошо изолированные колонии.

Аналогичным образом проводят пересев и на вторую плотную селективную среду (см. 6.4.2 или 6.4.3, или 6.4.4).

10.4.2 С посевным материалом, выращенным на среде обогащения (см. 10.3.2), повторяют процедуру приведенную в 10.4.1.

10.4.3 Чашки с посевами на первой плотной селективной среде (см. 10.4.1 и 10.4.2) культивируют вверх дном в термостате при температуре (37±1)°С в течение 24 - 48 ч.

Чашки с посевами на второй плотной селективной среде инкубируют согласно инструкции производителя питательных сред.

10.4.4 Через (24±3) ч или (48±2) ч [если после (24±3) ч отмечен слабый рост культуры или его отсутствие] культивирования на первой и второй плотной селективной средах (10.4) учитывают наличие колоний с ростом характерных для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.

10.4.4.1 На первой селективной плотной среде бактерии вида L. monocytogenes и L. ivanovii растут в виде сине-зеленых колоний, окруженные непрозрачным ореолом (типичные колонии). Другие виды бактерий рода Listeria также растут в виде сине-зеленых колоний, без ореола.

1 Некоторые штаммы L. monocytogenes могут давать очень слабый ореол вокруг колонии или вовсе не иметь его. Это характерно для "поврежденных" клеток L. monocytogenes (например, вследствие воздействия кислот).

2 Некоторые штаммы L. monocytogenes характеризуются пониженной фосфатидилинозитолфосфолипазной С активностью. Для выявления таких штаммов требуется более продолжительное культивирование.

10.4.4.2 Посевы на второй плотной селективной среде просматривают на наличие колоний с ростом характерным для бактерий рода Listeria.

На Палкам агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, иногда с черным центром.

На Оксфорд агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие сероватые колонии, окруженные черным ореолом.

На ПАЛ все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-желтые колонии с черным ореолом.

10.4.4.3 При отсутствии роста характерных колоний бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes на первой и второй плотных селективных средах исследования прекращают и делают заключение об отсутствии в исследуемой пробе продукта бактерий Listeria monocytogenes.

10.5 Идентификация выделенных культур до рода Listeria

10.5.1 Выбор колоний для подтверждения

10.5.1.1 С каждой чашки с плотной селективной средой (см. 10.4.4.1 и 10.4.4.2) отбирают по пять колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.

Если на чашке выросло менее пяти типичных колоний, отбирают их все.

10.5.1.2 Отобранные колонии пересевают на поверхность подсушенного триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.1.1) или другого плотного питательного агара (см. 6.5.1.2 - 6.5.1.3) так, чтобы получить изолированные колонии.

Посевы культивируют при температуре (37±1)°С в течение (24±3) ч до появления видимого роста.

На триптон-соевом агаре с дрожжевым экстрактом бактерии рода Listeria растут в виде выпуклых, бесцветных и непрозрачных колоний в диаметре от 1,0 до 2,0 мм.

Для подтверждения принадлежности выделенной культуры к бактериям рода Listeria проводят следующие тесты.

10.5.2 Реакция на каталазу

Берут изолированную колонию, выделенную по 10.5.1.2, и вносят в каплю 3%-ного раствора перекиси водорода (см. 6.6.1). Мгновенное образование пузырьков газа указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.

10.5.3 Окраска по Граму

Культуры, выделенные по 10.5.1.2, окрашивают по Граму (по ГОСТ 30425) и микроскопируют.

Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими, короткими палочками.

10.5.4 Определение подвижности

Культуру, выделенную по 10.5.1.2, пересевают в триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.2.1) или в другую жидкую питательную среду (см. 6.5.2.2 - 6.5.2.3).

Посевы культивируют при температуре (25±1)°С от 8 до 24 ч до появления мутности в бульоне. Затем каплю культуральной жидкости помещают на предметное стекло и накрывают сверху покровным стеклом и микроскопируют.

В поле зрения микроскопа должны наблюдаться короткие палочки с опрокидывающими движениями.

При культивировании посевов в жидкой питательной среде при температуре выше (25±1)°С подвижность бактерий не наблюдается.

В качестве альтернативного теста определения подвижности можно использовать посев культуры уколом в питательную среду (см. 6.6.4).

Посевы культивируют в термостате при температуре (25±1)°С в течение 48 ч.

Бактерии рода Listeria подвижны при температуре (25±1)°С, образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик. Если рост слабый необходимо культивировать еще пять суток с ежедневным просмотром посевов.

10.5.5 Характеристика бактерий рода Listeria

Бактерий рода Listeria - это грамположительные короткие тонкие палочки, каталазоположительные, подвижные при температуре не выше (25±1)°С.

10.6 Идентификация бактерий рода Listeria (см. 10.5.5) до вида

Культуры, полученные по 10.5.1.2 и соответствующие 10.5.5, идентифицируют следующими методами.

10.6.1 Определение бета-гемолитической активности

10.6.1.1 С использованием кровяного агара

Поверхность кровяного агара (см. 6.7.1.1) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и проколоть каждый маркированный квадрат бактериальной иглой с колонией культуры отобранной с триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 10.5.1.2). На каждую чашку с кровяным агаром, кроме исследуемых культур, должны быть посеяны контрольные штаммы, такие как L. monocytogenes (положительный контроль) и L. innocua (отрицательный контроль).

Посевы культивируют при температуре (37±1)°С в течение (24±2) ч.

Зона β-гемолиза на кровяном агаре у культуры L. monocytogenes - в виде узкой, чистой, светлой зоны; L. innocua - нет зоны гемолиза вокруг укола; L. seeligeri - слабая зона гемолиза; L. ivanovii - широкая, четко обозначенная зона гемолиза.

После инкубирования проводят визуальное сравнение прозрачности зон вокруг анализируемых и контрольных культур.

Примечание - Зона β-гемолиза более четко видна при удалении колонии с поверхности агара вокруг места посева.

10.6.1.2 С использованием суспензии эритроцитов барана

В 0,15 см 3 триптон-соевого бульона с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.2.1) необходимо внести одну колонию культуры полученную по 10.5.1.2 и соответствующую 10.5.5.

Посевы культивируют при температуре (37±1)°С в течение 24 ч. Затем добавляют 0,15 см 3 суспензии эритроцитов барана (см. 6.7.1.2) и продолжают культивирование при температуре (37±1)°С от 15 до 60 мин, с последующим охлаждением при температуре (3±2)°С около 2 ч.

При наличии у культуры гемолитической активности - жидкость окрашена в соломенно-коричневый цвет и отсутствует осадок красных кровяных клеток на дне лунки.

При отсутствии гемолитической активности наблюдается осадок красных кровяных клеток на дне лунки. Клетки могут быть красно-коричневыми по цвету.

Если реакция неопределенная, следует оставить культуру при температуре (3±2)°С на 24 ч.

10.6.2 Определение лецитиназной активности

Поверхность лецитин-агара с активированным углем (см. 6.6.5) и без угля (см. 6.6.5) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и высевать на каждый маркированный квадрат бактериальной петлей колонию культуры отобранной с триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 10.5.1.2). На каждую чашку с лецитин-агаром с активированным углем и без угля, кроме исследуемых культур, должен быть посеян контрольный штамм L. monocytogenes (положительный контроль).

Посевы культивируют при температуре (37±1)°С в течение (48±2) ч.

Культура L. monocytogenes дает плотную зону помутнения шириной 3,0 - 6,0 мм на лецитин-агаре с активированным углем за счет гидролиза лецитина.

Культура L. monocytogenes не дает плотную зону помутнения на лецитин-агаре без активированного угля.

10.6.3 Определение ферментативных свойств L. monocytogenes

У культур, полученных по 10.5.1.2 и соответствующих требованиям 10.5.5, определяют ферментативные свойства.

Для этого используют суточную культуру.

Посевы следует культивировать при температуре (37±1)°С в течение пяти суток.

Положительную реакцию в отношении углеводов определяют по изменению окраски среды в желтый цвет за счет образования кислоты. Изменение цвета среды происходит, как правило, в течение 24 - 48 ч.

В таблице 1 приведены биохимические свойства различных видов бактерий рода Listeria.

Текст Сравнения ГОСТ 31659-2012 с ГОСТ Р 52814-2007 см. по ссылке.

- Примечание изготовителя базы данных.

Дата введения 2013-07-01

Сведения о стандарте

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Казахстан

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ВНЕСЕНА поправка*, опубликованная в ИУС N 5, 2015 год

* См. ярлык "Примечания".

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления бактерий рода Salmonella.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9536-79 Спирт изобутиловый технический. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

4 Сущность метода

4.1 Общие положения

4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение (см. 8.1.2).

4.3 Обогащение в селективной жидкой среде

4.4 Пересев на чашки для идентификации

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две селективные агаризованные среды:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-arap) и

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.5 Проведение идентификации

5 Питательные среды, реактивы и сыворотки

5.1 Общие положения

5.2 Питательные среды и реактивы

Состав и приготовление питательных сред и реактивов указаны в приложении В.

5.2.1 Среда для неселективного предварительного обогащения: забуференная пептонная вода по В.1.

5.2.2 Первая селективная обогатительная среда: среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) по В.2.

5.2.3 Вторая селективная обогатительная среда: селенитовая среда по В.3.

5.2.4 Третья селективная обогатительная среда: тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (МКТ-бульон) по В.4.

5.2.5 Агаризованные селективные среды для чашек.

5.2.5.1 Первая среда: ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-arap) по В.5.

5.2.5.2 Вторая среда по В.6.

5.2.6 Питательный агар по В.7.

5.2.7 Мясо-пептонный агар или ГРМ-агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов на основе гидролизата рыбной муки) по В.8.

5.2.8 Мясо-пептонный бульон с глюкозой по В.9.

5.2.9 Среды с углеводами (среды Гисса) по В.10.

5.2.10 Трехсахарный железистый агар (TSI-arap) или агар Клиглера, или агар Олькеницкого по В.11.

5.2.11 Агар с мочевиной (Кристенсена) по В.12.

5.2.12 L-лизин-декарбоксилазная среда по В.13.

-галактозидазы (или используются в соответствии с инструкцией изготовителя готовые бумажные диски) по В.14.

5.2.14 Реактив для реакции Фогес-Проскауера (VP) по В.15.

5.2.15 Реактивы для индольной реакции по В.16.

5.2.16 Триптон/триптофановая среда по В.17.

5.2.17 Бульон Хоттингера по В.18.

5.2.18 Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана по В.19.

5.2.19 Полужидкий питательный агар по В.20.

5.2.20 Полужидкий мясо-пептонный агар по В.21.

5.2.21 Физиологический раствор по В.22.

Имеется несколько типов агглютинирующих сывороток, содержащих антитела для одного или нескольких О-антигенов, т.е. антисыворотки, содержащие одну или более "О" групп (моновалентные или поливалентные анти-О-сыворотки), анти-Vi-сыворотки и антисыворотки, содержащие антитела для одного или нескольких Н-факторов (моновалентные или поливалентные анти-Н-сыворотки).

Каждое опытное определение должно давать гарантию, что используемая антисыворотка пригодна для выделения всех серотипов бактерий рода Salmonella.

Сухие агглютинирующие адсорбированные О-, Vi-, Н-сальмонеллезные сыворотки промышленного производства готовят перед употреблением по прилагаемой к ним инструкции.

6 Аппаратура, материалы и реактивы

Приемлемой альтернативой посуде многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям.

Обычное лабораторное оборудование и реактивы для микробиологических исследований по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

Аппарат для сухой стерилизации (стерилизационный сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) по ГОСТ ISO 7218 (подразделы 4.5 и 4.10).

Термостат, поддерживающий температуру (37±1) °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.6).

Водяная баня, поддерживающая температуру (41,5±1,0) °С, или термостат, поддерживающий температуру (41,5±1,0) °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.9).

Водяная баня, поддерживающая температуру 44 °С-47 °С и (37±1) °С, по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.9).

Прибор для мембранной фильтрации.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г (для взвешивания реактивов) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 мг*.

* Письмом Росстандарта от 23.06.2021 N 1637-ИК/03 разъясняется, что "в части пределов допускаемой абсолютной погрешности лабораторных весов для взвешивания реактивов допущена опечатка". Следует читать: ±0,01 г. - Примечание изготовителя базы данных.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг (для взвешивания продукта) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±20,0 мг.

Бактериологическая петля диаметром около 3 мм.

рН-метр с точностью калибровки ±0,1 рН при температуре 20 °С-25 °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.4).

Стекла предметные по ГОСТ 9284 .

Стекла покровные по ГОСТ 6672 .

Пробирки или флаконы соответствующей вместимости.

Могут быть использованы бутылки или флаконы с нетоксичными металлическими или пластиковыми завинчивающимися крышками.

Чашки Петри среднего размера (диаметр 90 или 100 мм) и/или большие (диаметр 140 мм).

Спирт изобутиловый по ГОСТ 9536 .

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709**.

Желчь бычья сухая или натуральная.

Железо (III) аммоний цитрат.

Железо (III) цитрат.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363 .

Карбамид (мочевина) по ГОСТ 6691 .

Контрольный штамм бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе.

Читайте также: