Гост на стафилококковый энтеротоксин

Обновлено: 25.04.2024

Стафилококковый энтеротоксин B по природе своей является протеином с молекулярным весом 24-30 Kd, который может выступать в качестве аллергена. Проявлениями аллергических реакций на стафилококковый энтеротоксин B могут являться атопический дерматит, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, заболевания пищеварительной системы (аллергический стоматит, хейлит, гастрит, колит, гастроэнтерит). Определение специфического иммуноглобулина Е к данному аллергену в повышенном количестве указывает на наличие сенсибилизации организма к этому аллергену.

Синонимы русские

IgE к энтеротоксину B золотистого стафилококка, бактериальные токсины.

Синонимы английские

Staphylococcal enterotoxin B, ETA, IgE (o73).

Метод исследования

Единицы измерения

МЕ/мл (международная единица на миллилитр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк) – это бактерия, колонизирующая кожу и слизистые животных и человека. Носителями золотистого стафилококка являются 10-40% людей. Стафилококк часто вызывают инфекции кожи: фолликулит, фурункулы, рожу, абсцессы. К тяжелым инфекционным заболеваниям стафилококковой природы относят остеомиелит, пневмонию, эндокардит и сепсис. Кроме того, стафилококки являются причиной заболеваний, обусловленных продукцией токсинов. Токсины могут непосредственно влиять на организм, вызывая симптомы поражения кожи: "синдром ошпаренной кожи" у младенцев, стафилококковый гастроэнтерит. Ответной реакцией на попадание в организм чужеродных клеток является быстрая выработка иммуноглобулинов класса Е. На фоне аллергической реакции на энтеротоксин происходит поражение внутренних органов и тканей, сопровождающееся следующими симптомами: чихание; диарея; зуд и покраснение кожных покровов; головокружение; сонливость; одышка; сухой кашель; першение в горле; анафилактический шок; повышенное потоотделение; повышение температуры тела; отек Квинке; сыпь; конъюнктивит; увеличение размера вилочковой железы; обострение хронических заболеваний; мигрень.

Золотистый стафилококк продуцирует энтеротоксины, которые приводят к дисфункции организма на клеточном уровне, проявляющейся в виде воспаления дыхательных путей. Особенно опасен золотистый стафилококк в период беременности и грудного вскармливания. Как показывает медицинская практика, у пациентов, страдающих полипами в области носоглотки, атопической экземой, хроническим ринитом, повышен риск диагностирования стафилококковой инфекции. Иммунологическая диагностика позволяет с высокой точностью определить устойчивость организма к аллергену данного типа. Воздействие энтеротоксинов золотистого стафилококка вызывает продукцию специфических IgE. Энтеротоксин B индуцирует поликлональное образование IgE против сотен аллергенов, включая ингаляционные аллергены и энтеротоксины. Данные иммунологические реакции способствуют развитию хронического риносинусита с образованием полипов носа, более тяжелому течению атопического дерматита и экземы, бронхиальной астмы.

Для чего используется это исследование?

Для диагностики аллергических заболеваний, связанных с сенсибилизацией к энтеротоксину B золотистого стафиллококка;
для диагностики бактериальной экземы;
для уточнения причин тяжелого течения атопического дерматита;
для уточнения генеза хронического риносинусита, полипоза носа;
для уточнения генеза бронхиальной астмы.

Когда назначается исследование?

При симптомах аллергии (зуд и высыпания на коже, тяжелое течение атопического дерматита, экзема, хронический риносинусит, полипоз носа, бронхиальная астма и др.).

Что означают результаты?

Референсные значения: 0.00 - 0.10 МЕ/мл.

аллергия на энтеротоксин B золотистого стафиллококка;
сенсибилизация к энтеротоксину B золотистого стафиллококка с высоким риском развития аллергической реакции после укуса.

отсутствие сенсибилизации к энтеротоксину B золотистого стафиллококка;
исключение контакта с аллергеном.

Кто назначает исследование?

Аллерголог, педиатр, врач общей практики, терапевт, пульмонолог, дерматовенеролог, оториноларинголог.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНТЕРОТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2429-08

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина, И.Б.Быкова, А.В.Булахов, А.А.Ананьева); ФГБУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития (А.Л.Гинцбург, Ф.С.Флуер); ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве" (О.В.Захарова, Н.Я.Салова) при участии фирмы "BioMerieux" (Т.Н.Душкина).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 26 июня 2011 г.

4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 26 июня 2011 г.

5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

Внести дополнения и изменения в МУК 4.2.2429-08:

1. Раздел 1 "Область применения" дополнить пунктом 1.5 следующего содержания:

"1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, C1, С2, С3, D, Е (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг".

2. В разделе 3 "Сущность метода" пункт 3.1 изложить в следующей редакции:

"3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов А (СЭА) или В (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235 и 42-236, ВС 89), а также энтеротоксины типов А, В, С, D и Е при совместном дифференцированном и недифференцированном определении".

3. Раздел 3 "Сущность метода" дополнить пунктами 3.5, 3.6 и 3.7 следующего содержания:

"3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза - флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой.

3.6. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферола при 450 нм и тест-наборы, в состав которых входят наконечники, сенсибилизированные антителами к СЭТ типов А, В, С, D, Е, используемые в качестве пипетирующего устройства; и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюорес-центного анализа.

4. Раздел 4 "Требования к выполнению анализов" изложить в новой редакции:

"4. Требования к выполнению анализов

4.1. Условия безопасного проведения работ

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019*, а также требования, изложенные в технической документации на приборы.

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 12.1.019-2009. - Примечание изготовителя базы данных.

Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:

не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;

не использовать поврежденные стрипы;

не использовать набор по истечении срока годности;

не смешивать реактивы из различных партий;

положительный контроль и стандарт содержат очищенный стафилококковый энтеротоксин. При работе соблюдать осторожность. Работать в защитной одежде, перчатках, очках. При попадании внутрь следует немедленно обратиться к врачу;

реактивы содержат натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления;

пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель;

анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

4.2. Требования к квалификации специалистов

Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.

4.3. Условия выполнения измерений

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях:

температура окружающего воздуха (20±5) °С;

атмосферное давление (97±10) кПа;

относительная влажность (65±15)%".

5. Раздел 5 "Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы":

Пункт 5.1 "Средства измерений и вспомогательное оборудование" дополнить следующей позицией:

"Автоматический иммуноферментный анализатор типа VIDAS BioMerieux® или mini VIDAS BioMerieux ®, Франция или аналогичного типа".

Пункт 5.2 "Лабораторная посуда и инструменты" дополнить следующими позициями:

"Шприцы на 20 мл

Пипетка одноразовая на 500 мкл

Пакет для гомогенизации с фильтром

Центрифужные пробирки на 50 мл".

Раздел 5.3 "Реактивы и материалы" дополнить следующими позициями:

"Набор реагентов типа "VIDAS®Staph enterotoxin II (SET2), BioMerieux®, Франция или с аналогичными характеристиками

Набор реагентов типа RIDASCREEN® SET Total (R-Biopharm AG, Германия) или с аналогичными характеристиками

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах

1. РАЗРАБОТАНЫ ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина); ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (А.Л.Гинцбург, Ф.С.Флуер).

4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 15 декабря 2008 г.

5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

ВНЕСЕНЫ Дополнения и изменения N 1, утвержденные и введенные в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации c 26.06.2011

Дополнения и изменения N 1 внесены изготовителем базы данных по тексту М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 год

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод качественного определения стафилококковых энтеротоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, мясе и мясопродуктах; птице и птицепродуктах) на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.

1.3. Методы предназначены для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора и контроля, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.

1.4. Согласно настоящим методическим указаниям предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов соответствует диапазону массовых концентраций от 0,2 до 2,0 мкг/кг (в зависимости от типа токсина и вида продукта), что ниже уровня 100-200 нг наиболее распространенного из числа известных иммунологических типов стафилококкового энтеротоксина типа А, обусловливающего развитие стафилотоксикоза у человека.

1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, C1, С2, С3, D, Е (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг.

2. Определения, обозначения и сокращения

СЭТ - стафилококковые энтеротоксины.

СЭА - стафилококковый энтеротоксин типа А.

СЭВ - стафилококковый энтеротоксин типа В.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ИГ, IgG - иммуноглобулины.

Кг - конъюгат.

ОП - оптическая плотность.

Стандартный образец состава - стандартный образец, воспроизводящий значения величин, характеризующих содержание определенных компонентов (ГОСТ 8.315).

Калибровочный раствор - раствор компонента, приготовленный из стандартного образца состава и необходимый для проведения испытания.

3. Сущность метода

3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов А (СЭА) или В (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235* и 42-236*, ВС 89), а также энтеротоксины типов А, В, С, D и Е при совместном дифференцированном и недифференцированном определении

* Документы является авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

3.2. Принцип метода. Определение СЭТ происходит за счет специфического взаимодействия стафилококковых иммуноглобулинов к различным типам СЭТ, адсорбированных на планшете, со стафилококковыми энтеротоксинами, содержащимися в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс "антитело + антиген" выявляют с помощью конкурирующих стафилококковых иммуноглобулинов (конъюгатов), меченых пероксидазой. Образующийся аналитический сигнал, зависящий от результатов взаимодействия комплекса "антитело + антиген" с конъюгатом на поверхности ячеек планшета и выражающийся в ферментации субстрата - ортофенилендиамина (при раздельном определении СЭТ типов А и В) или тетраметилбензидина (при совместном определении СЭТ типов А, В, С, D и Е) с изменением его окраски, измеряется по регистрируемому значению оптической плотности при длинах волн 492 и 450 нм, соответственно. Схема анализа представлена в табл.1

Последовательность этапов ИФА при определении стафилококковых энтеротоксинов

Отбор, подготовка проб и экстракция СЭА и СЭВ

Сенсибилизация планшетов иммуноглобулинами

Отмывка планшетов от непрореагировавших иммуноглобулинов

Взаимодействие иммуноглобулинов с антигеном (СЭА или СЭВ)

Отмывка планшетов от непрореагировавшего антигена

Взаимодействие комплекса "антиген-антитело" с конъюгатом

Отмывка планшетов от непрореагировавшего конъюгата

3.3. Для проведения раздельного определения используются тест-системы иммуноферментные для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В в виде лиофилизированных компонентов.

3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза - флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой.

4. Требования к выполнению анализов

4.1. Условия безопасного проведения работ

не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;

не использовать поврежденные стрипы;

не использовать набор по истечении срока годности;

не смешивать реактивы из различных партий;

4.2. Требования к квалификации специалистов

4.3. Условия выполнения измерений

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях:

температура окружающего воздуха (20±5) °С;

атмосферное давление (97±10) кПа;

относительная влажность (65±15)%.

Раздел 4. (Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

5. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

5.1. Средства измерений и вспомогательное оборудование

Фотометр вертикального типа с диапазоном измерения оптической плотности 0,0-2,5 в комплекте с интерференционным светофильтром для длин волн 490-492 нм и 450 нм

Шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий постоянство температуры (130±5) °С по НД

Шкаф холодильный любого типа, обеспечивающий постоянство температуры по НД

Весы лабораторные аналитические общего назначения и образцовые с наибольшим пределом взвешивания 200 г, не ниже 2-го класса точности

Дозаторы пипеточные автоматические с диапазоном объема доз 20-200 мкл, 200-1000 мкл и дискретности установки доз 5 мкл

* ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, являются авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Дистиллятор типа ДЭ-4-2 по НД

Гомогенизатор ножевой или перистальтический типа "Стомайкер"

Ступки фарфоровые с пестиками

Автоматический иммуноферментный анализатор типа VIDAS BioMerieux® или mini VIDAS BioMerieux ®, Франция или аналогичного типа

Питание является одним из важнейших факторов, определяющих здоровье населения. Правильное питание способствует профилактике заболеваний, повышению работоспособности, создает условия для адекватной адаптации к окружающей среде. Одним из важнейших показателей, характеризующих качество и безопасность продовольственного сырья и продуктов питания, является контаминация их микроорганизмами. Учитывая особую значимость продуктов питания в возникновении острых кишечных инфекционных заболеваний и бактериальных пищевых отравлений, уделяется пристальное внимание мониторингу за микробиологической чистотой продовольственного сырья и пищевых продуктов. Ведущее место в санитарно-бактериологических исследованиях является выполнение исследований продовольственного сырья и пищевых продуктов. Стафилококки – одна из ведущих причин микробных пищевых отравлений. Стафилококки вызывают множество инфекций в организме человека, в том числе поверхностные и глубокие гнойные инфекции, интоксикации, инфекции мочевых путей. Важнейшим патогенным стафилококком является Золотистый стафилококк – Staphylococcus aureus – стойкий, высоковирулентный, легко приобретающий устойчивость к антимикробным препаратам возбудитель инфекции. Staphylococcus aureus является одним из важнейших возбудителей инфекций человека и вызывает более 100 нозологических форм заболеваний. Золотистый стафилококк может размножаться в продуктах питания. Чаще всего, в кондитерских изделиях и молочных продуктах, в мясных изделиях (полуфабрикаты и колбасы), в рыбе (слабосоленая, консервы). Сам микроорганизм не представляет угрозы для человека. Он быстро погибает в желудке под воздействием соляной кислоты. Но в процессе жизнедеятельности золотистый стафилококк выделяет энтеротоксин, который накапливается в продуктах питания. Попадая в желудочно-кишечный тракт, этот токсин вызывает симптомы пищевого отравления.

1. Билетова Н.В., Корнелаева Р.П., Кострикина Л.Г. и др. Под ред. Любашенко и С.Я. Санитарная микробиология. - М.: Пищевая промышленность, 2010 г.

2. Корнелаева Р.П., Степаненко П.П., Павлова Е.В., Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения. - М.: 2012 г.

4. ГОСТ 31746-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.

5. Онищенко Г.Г., Абаев И.В., Дятлов И.А., Скрябин Ю.П. и соавт. Молекулярно- генетическая идентификация штамма Staphylococcus aureus — возбудителя пищевой токсикоинфекции при вспышке в Санкт-Петербурге в 2013 г. // Актуальные вопросы микробиологии. – 2014, № 9-10. – С. 33-34.

6. Пруссова В.Н., Кива М.С., Клименко В.В. Микробиологический мониторинг за пищевыми продуктами по обоснованию сроков годности и условий хранения // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2013. №2-3(52). С. 94-97.

7. Пруссова В.Н., Кива М.С. Микробиологический мониторинг за пищевыми продуктами // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2015. №4(62). С. 142-146.

Основными источниками обсеменения стафилококками пищевых продуктов являются люди и животные с гнойно-воспалительными процессами (абсцессы, фурункулы, гнойные раны и др.), а также носители этих микроорганизмов. Перенос стафилококков от людей на пищевые продукты может происходить воздушно-капельным путем, при непосредственном контакте людей с продуктами, оборудованием, в процессе убоя скота и разделки туш.

Чаще всего причиной стафилококковых токсикозов является употребление молока, мяса и мясных изделий, кондитерских изделий с заварным кремом и др., контаминированных патогенными стафилококками. Органолептические свойства продуктов, в которых размножаются стафилококки и накапливаются энтеротоксины, не изменяются [2].

Энтеротоксигенные стафилококки размножаются в пищевых продуктах даже при содержании в них около 40% влаги. Они могут развиваться в продуктах, содержащих от 7% до 12% хлорида натрия. Сахар угнетает развитие стафилококков при концентрациях 30–40%. Некоторые микроорганизмы (В. сеreus, дрожжи из рода Саndidа и др.) оказывают на стафилококки стимулирующий эффект (они усиливают образование энтеротоксина).

Энтеротоксин стафилококков обладает высокой термоустойчивостью. Инактивирование (разрушение) токсина происходит только через 2,5–3 часа кипячения. При автоклавировании (120°С) токсин разрушается через 20 мин. При благоприятных температурных условиях энтеропатогенные стафилококки быстро размножаются в продуктах и продуцируют токсин. Пищевые токсикозы, вызванные энтеропатогенными стафилококками, протекают в форме острого гастроэнтерита, сопровождающегося рвотой, реже диареей, головной болью. Инкубационный период очень короткий – от 30 мин до 6 ч. Длится заболевание один, реже – два, три дня [1].

Выявление и определение количества этих микроорганизмов в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ 31746-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды [4].

Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.

При пересеве на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном выросшие типичные колонии без подтверждения по биохимическим признакам относят к коагулазоположительным стафилококкам.

Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду [6].

Перед посевом анаэробные условия в среде создают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин, наслоением агара или парафина в каждую пробирку после посева, а также с помощью альтернативной процедуры - инкубирования пробирок в емкости или инкубаторе в анаэробных условиях.

Пробирки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков на Жиолитти-Кантони бульоне определяется по редукции теллурита калия, а на глюкозном или солевом бульоне - по помутнению среды [3].

Поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого, яично-желточно-азидного, яично-желточно-солевого агара, агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном), инокулируют из предположительно положительных пробирок после 24 ч и все оставшееся пробирки после 48 ч.

Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по редукции теллурита калия и яично-желточной реакции (лецитиназной активности) [7].

На агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном после инкубирования присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по типичным колониям, показавшим специфичную реакцию (бычий фибриноген/кроличья плазма).

Подтверждение принадлежности типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам проводят по изучению отношения выявленных микроорганизмов к окраске по Граму, определению присутствия у них каталазы и коагулазы.

Подтверждение принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению образования ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности. Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus выражают: "обнаружены" или "не обнаружены"[5].

Метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus. Навески продукта и (или) серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Наиболее вероятное число коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в 1 см или в 1 г продукта определяют для подтвержденных посевов, пользуясь НВЧ-таблицей по ГОСТ 26670.

Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта и/или разведения навески продукта на (в) агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus [4].

Проводят посев определенного количества жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции на (в) агаризованную селективно-диагностическую питательную среду на две параллельные чашки Петри. Аналогично проводят посев десятикратных разведений испытуемого продукта. Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

При посеве в (на) агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном определяют только типичные колонии и без подтверждения по биохимическим признакам их относят к коагулазоположительным стафилококкам.

При выявлении коагулазоположительных стафилококков в определенной навеске исследуемого продукта или его эквивалентном разведении с предварительным обогащением эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред [6,7].

Перед использованием Жиолитти-Кантони бульон прогревают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин для удаления воздуха. Охлаждают до 44 °С - 47 °С и с соблюдением правил асептики прибавляют раствор теллурита калия.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой нормальной концентрации 1:10. При использовании среды двойной концентрации соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:1 [3].

Если при последующем подтверждении принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus не определяют наличие термостабильной нуклеазы и гемолитической активности, то допускается проводить посев в Жиолитти-Кантони бульон без прогрева перед посевом и без наслаивания голодного агара или парафина после посева.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если появилось почернение или черный осадок в Жиолитти-Кантони бульоне или помутнение в солевом или сахарном бульоне, то проводят подтверждение принадлежности выросших микроорганизмов к коагулазоположительным стафилококкам. Если почернения, черного осадка или помутнения нет, то посевы инкубируют еще (24±2) ч [2].

Для получения изолированных колоний стерильной петлей делают пересевы культур из каждого посева на поверхность чашки Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред: Байрд-Паркер агара, Байрд-Паркер агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара или яично-желточно-солевого агара. Пересевы проводят также из пробирок, в которых нет видимых признаков роста.

Чашки Петри с пересевами инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч или (48±2) ч. После 24 ч инкубирования чашек Петри по отмечают на дне чашек присутствие типичных и атипичных для коагулазоположительных стафилококков колоний [1].

На Байрд-Паркер агаре после инкубирования в течение 24 ч коагулазоположительные стафилококки образуют типичные колонии черного или серого цвета, блестящие и выпуклые, окруженные прозрачной зоной, диаметр колоний около 1,0-1,5 мм и до 1,5-2,5 мм после инкубирования в течение 48 ч. После инкубирования в течение 24 ч непосредственно около колонии в прозрачной зоне может появиться опалесцирующее кольцо, окружающее колонию.

Принадлежность выявленных коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению их способности образовывать ацетоин и ферментировать мальтозу в аэробных условиях [5].

Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера). Культуру высевают в пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. После инкубирования посевов к 1 см отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см раствора - нафтола и 0,2 см раствора гидроокиси калия. Появление розового окрашивания через 15-60 мин указывает на положительную реакцию. S. aureus образует ацетоин.

Определение ферментации мальтозы в аэробных условиях. Способность ферментации мальтозы в аэробных условиях определяют с целью дифференциации S. aureus от других коагулазоположительных видов S. intermedius и S. hyicus. Для определения ферментации мальтозы в аэробных условиях культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. При ферментации мальтозы в аэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменяется. S. aureus ферментирует мальтозу в аэробных условиях [4].

Оценка результатов посевов в жидкие среды. При определении НВЧ коагулазоположительных стафилококков или S. aureus или при их выявлении в определенной навеске продукта посевы считают положительными (то есть коагулазоположительные стафилококки или S. aureus выявлены в испытуемой навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении типичных и (или) атипичных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной колонии будут обнаружены коагулазоположительные стафилококки или S. aureus [6].

Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков или S. aureus записывают: обнаружены (не обнаружены) в 1 г (см3) продукта; масса или объем продукта, в котором выявляли коагулазоположительные стафилококки или S. aureus.

Читайте также: