Латекс-агглютинация при менингококковой инфекции

Обновлено: 01.05.2024

Сбор материала для культуральных исследований и микроскопии необходимо проводить до назначения специфической противомикробной терапии. Несоблюдение данного условия может привести к ложноотрицательному результату исследования. материал берут натощак или через 3-4 ч после еды. Для более полного открытия глоточного отверстия рекомендуется по время забора материала надавливать шпателем на корень языка. Важно, чтобы при извлечении тампона он не касался зубов, щек, языка. Для сбора мазков из носоглотки и ротоглотки используются стерильные зонды, которые после сбора материала погружают в контейнеры с транспортной средой, обеспечивающей стабильность и сохранение ростовых свойств микроорганизмов. Тип зондов, состав транспортных сред, методику сбора, а также условия хранения и транспортирования клинического материала следует уточнить в инструкции к используемым реагентам.

Хранение образцов

Для культуральных исследований и микроскопии – при температуре 2–8°С не более 24 ч.
Для выявления РНК/ДНК:
при температуре 2–8°С – в течение 3 сут.;
при температуре минус 16–20°С – до 3 мес.;
длительно при температуре не выше минус 68°С.

Допускается лишь однократное замораживание–оттаивание материала.

Мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки для выявления РНК/ДНК – рекомендуется совмещать мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки в одной пробирке. Для этого сначала берут мазки разными зондами со слизистой нижнего носового хода, а затем из ротоглотки, при этом рабочие концы зондов после взятия мазков у пациента помещаются в одну пробирку с 500 мкл транспортной среды для хранения и транспортировки респираторных мазков, и исследуются как один образец. Материал берется после полоскания полости ротоглотки кипяченой водой комнатной температуры. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. В течение шести часов перед процедурой нельзя использовать медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку и препараты для рассасывания во рту. Мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2–3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину до носоглотки, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3–4 см для детей и 5–6 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной среды для хранения и транспортировки респираторных мазков до места слома, при этом гибкая часть зонда сворачивается спиралью, далее, прикрывая сверху пробирку крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают. Мазки из ротоглотки берут сухими стерильными зондами из полистирола с вискозными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки, аккуратно прижимая язык пациента шпателем. После забора материала рабочую часть зонда с тампоном помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной среды и зондом с мазком из носоглотки. Конец зонда с тампоном отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку.

Смыв из ротоглотки для диагностики эпидемического паротита (выделение РНК). Перед взятием смывов из ротоглотки проводят предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 с) 25-40 мл изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через стерильную воронку в стерильный флакон на 50 мл.

Хранение образцов

при комнатной температуре – в течение 6 ч.
при температуре от 2°С до 8°С – в течение 3 суток
при температуре минус 20°С – в течение 1 недели
при температуре минус 70°С – длительно

Мазки из ротоглотки и носа для диагностики дифтерии, пневмококковой, стафилококковой, стрептококковой инфекции (культуральные исследования) – для взятия материала используется сухой стерильный ватный тампон, вмонтированный в пробку пробирки или готовые транспортные среды, отдельным тампоном из ротоглотки и из носа. Взятие мазков осуществляют натощак или не ранее двух часов после еды, не касаясь тампоном языка, внутренних поверхностей щек и зубов.

Мазки из ротоглотки и носа для диагностики менингококковой инфекции (культуральные исследования) – тампон вводят через ротовую полость ватным концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2–3 раза по задней стенке. При извлечении из ротоглотки тампон не должен касаться окружающих тканей (зубы, слизистая щек, язык, небный язычок). После извлечения тампона содержащуюся на нем слизь засевают на чашки (сывороточный агар и сывороточный агар с линкомицином) или помещают в транспортную среду для немедленной доставки в лабораторию. Допускается применение коммерческих питательных транспортных сред разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Мазки из носоглотки для диагностики гриппа (культуральные исследования) собирают стерильными зондами с вискозными тампонами из нижнего носового хода. Зонд с тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2–3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход глубоко, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3–4 см для детей и 5–6 см для взрослых). После взятия материала тампон, не нарушая стерильности, помещают в пробирку с 2,0–5,0 мл вирусологической транспортной среды. Материал хранят в течение 24 ч при температуре 2–8°С, более длительно – при температуре не выше минус 16°С.

Мазки из носоглотки для диагностики коклюша (культуральные исследования) собирают стерильными зонд-тампонами с вискозным наконечником на алюминиевой основе, вмонтированный в пробку и пробирку с транспортной средой AMIES с активированным углем. Зонд извлекают из упаковки, вводят через носовые ходы и удерживают в носоглотке в течение 10 сек, чтобы он пропитался отделяемым слизистой носоглотки. После этого тампон извлекают, делая упор на боковую стенку носа, и немедленно помещают в пробирку с транспортной средой AMIES с активированным углем. Собранный материал необходимо исследовать в день получения (в исключительных случаях – хранить в холодильнике при температуре 2–8°С не более 12 ч).

Заднеглоточные мазки для диагностики коклюша (культуральные исследования) собирают стерильным зонд-тампоном с вискозным наконечником на алюминиевой основе, вмонтированным в пробку, вносят в пробирку с транспортной средой AMIES с активированным углем. Целесообразно использовать готовые комплекты. Зонд извлекают из упаковки, пробирку со средой вскрывают, конец зонда (на расстоянии 2 см от конца с тампоном) помещают в пробирку и изгибают под углом 135°, делая упор на внутренний край пробирки, и извлекают из пробирки. Аккуратно прижимая язык пациента шпателем, вводят изогнутый тампон в ротовую полость ниже язычка и собирают материал с задней стенки глотки, не задевая язык, слизистую оболочку щек и миндалины. Зонд с биоматериалом помещают в пробирку со средой AMIES, следя за тем, чтобы пробка, в которую вмонтирован тампон, плотно закрывала пробирку. Пробирки с транспортной средой AMIES до использования хранят при комнатной температуре. После взятия материала тампон, не нарушая стерильности, помещают в пробирку с 2,0–5,0 мл вирусологической транспортной среды. Собранный материал необходимо исследовать в день получения (в исключительных случаях – хранить в холодильнике при температуре 2–8°С не более 12 ч).

Мазки со слизистой носоглотки для диагностики кори (культуральные и исследования, выделение РНК) – для взятия материала используют стерильный ватный тампон, которым протирают слизистую оболочку носоглотки с достаточным усилием, чтобы снять часть эпителиальных клеток. Тампоны помещают в маркированные стерильные пробирки с завинчивающимися крышками, в которых содержится 2–3 мл транспортной среды для вирусов. Если образец не может быть доставлен в вирусологическую лабораторию в течение 48 часов при температуре 4–8°С, пробирку с тампоном следует энергично встряхнуть так, чтобы смыть клетки, а затем извлечь тампон. Смывы центрифугируют при температуре 4°С при 500g (1500 об./мин) в течение 5 минут, затем осадок ресуспендируют в 2 мл питательной среды для клеточных культур.

Ресуспендированный осадок и надосадочную жидкость хранят раздельно при температуре –70°С и транспортируют в лабораторию на сухом льду в герметично закрытых флаконах, чтобы избежать попадания в них углекислоты.

Мазки из носоглотки для обнаружения антигенов внутриклеточных патогенов собирают стерильными зондами с вискозными тампонами из нижнего носового хода. Зонд с тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2–3 см до нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину глубоко (вплоть до слез у пациента), делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После взятия материала тампон помещают в пробирку с 3 мл 0,1 моль/л фосфатно-солевого буферного раствора. Для получения суспензии клеток тампон в пробирке тщательно отжимают о стенки пробирки, тампон удаляют, пробирку закрывают. Проводят центрифугирование в течение 5 мин при 3000 об/мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость осторожно удаляют, а осадок клеток ресуспендируют в нескольких каплях фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на предметные стекла (не менее 3 шт.) раздельными каплями. Препарат высушивают и фиксируют 10 мин в охлажденном до 2–8°С химически чистом ацетоне. Фиксированные предметные стекла хранят при температуре 2–8°С не более 6–7 дней.

Возбудителем менингококковой инфекции является Neisseria meningitidis (менингококк). Менингококк колонизирует заднюю стенку носоглотки человека и в зависимости от вирулентности штамма и резистентности зараженного лица вызывает инфекционный процесс с широким спектром клинических проявлений: бессимптомное носительство, назофарингит и генерализованную форму – менингококцемию и/ или менингит. Менингококковая инфекция поражает лиц всех возрастов, но чаще (70%) болеют дети. Показатель летальности составляет в среднем 10%, что определяет высокую социальную значимость заболевания. Капсульные штаммы менингококка в зависимости от химического строения капсульного полисахарида делятся на ряд серологических групп: А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29-E, H, I, K, L. Более чем 90% случаев генерализованных форм менингококковой инфекции обусловлены штаммами серогрупп А, В и С, значительно реже – штаммами серогрупп X, Y и W-135, остальные серогруппы не представляют эпидемиологического интереса. Определение серогруппы – важнейшая процедура для выбора адекватного вакцинного препарата. Все менингококки экспрессируют на своей поверхности один из аллельных вариантов белков наружной мембраны 2 или 3 класса (PorB). Большинство менингококков экспрессируют белки 1 класса (PorA). Антигенная структура белка PorB определяет серотип штамма, белка PorA – серосубтип. На основании химической структуры капсульного липополисахарида определяют иммунотип. Антигенная характеристика может включать и некоторые другие АГ: Ора и Орс (белки наружной мембраны 5 класса), пили, поверхностный белок FetA.

Показания к обследованию

Диагностические исследования проводят в условиях стационара при подозрении на гнойный менингит и/или генерализованную форму менингококковой инфекции;
исследования по эпидемическим показаниям проводят в очаге генерализованной формы менингококковой инфекции среди контактировавших с больным и имеющих клинические проявления назофарингита.

Материал для исследования

Кровь – микроскопическое исследование, культуральное исследование;
СМЖ – микроскопическое исследование, культуральное исследование, выявление ДНК, выявление АГ;
мазки из ротоглотки и носа – культуральное исследование;
сыворотка крови – выявление АГ, определение специфических АТ

Дифференциальная диагностика

Возбудители гнойных менингитов другой этиологии: Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Staphylococcus aureus и др.;
при исследовании носоглотки – пигментирующие нейссерии Neisseria subflava, Neisseria flavescens, Neisseria mucosa, Neisseria sicca, Neisseria lactamica.

Лабораторная диагностика генерализованной формы менингококковой инфекции включает микроскопию биологического материала, посев биологического материала с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением антибиотикочувствительности; обнаружение специфических генетических фрагментов менингококка и его АГ, обнаружение специфических АТ.

Посев СМЖ и крови на питательные среды при дальнейшей инкубации в течение 24 ч при 37 оС в атмосфере с 5–10% СО2 и повышенной влажностью позволяет выявить характерные тинкториальные свойства патогена. Исследование рекомендуется проводить в активной фазе заболевания (первые два дня после поступления в стационар) до начала интенсивной антибактериальной терапии.

При определении сахаролитической активности проводят учет результатов посева чистой культуры на плотные питательные среды с углеводами. Метод дает возможность дифференцировать различные виды нейссерий и некоторые другие виды микроорганизмов (таблица 16). Иногда наблюдается вариабельность сахаролитической активности у различных штаммов одного и того же вида.

Уточнение биохимических свойств менингококков проводят с использованием наборов реагентов для расширенного изучения ферментативной и метаболической их активности, что в течение 2-х часов позволяет определить видовую принадлежность возбудителя.

Определение серогруппы менингококков проводят в реакции агглютинации на стекле с набором агглютинирующих серогрупповых антисывороток (серогруппы А,В,С,X,Y,Z,W-135,29E). Реакцию проводят только с чистой культурой менингококков, прошедшей все этапы идентификации. Менингококки серогрупп А, В и С наиболее часто являются причиной возникновения генерализованных форм менингококковой инфекции, реакцию агглютинации проводят в первую очередь с антисыворотками к менингококкам этих серогрупп. Отсутствие реакции с одной из основных серогрупповых АТ, указывает на необходимость продолжения проведения аналогичных исследований с другими специфическими антисыворотками (X, Y, Z, W-135, 29E). Только в том случае, если подтвержденный всеми тестами штамм менингококка не показал положительного результата в реакции агглютинации с полным набором агглютинирующих антисывороток, его следует отнести к категории неаггютинирующегося штамма (НА).

Для обнаружения АГ в СМЖ и/или сыворотке крови используют реакцию латекс- агглютинации. Исследование нативного ликвора (экспресс-метод) проводится при наличии в нем признаков гнойного воспаления и/или при микроскопическом обнаружении возбудителей. Использование реакции позволяет в кратчайшие сроки (15–20 мин) выявить специфические АГ менингококков самых распространенных серогрупп (А, В, С, У, W-135). Рекомендуется проводить исследование в активной фазе заболевания (первые два дня после поступления в стационар).

Для выявления ДНК патогена используется СМЖ и/или свежая чистая культура Neisseria meningitidis, выросших на чашки Петри. Обнаружение специфических генетических фрагментов микроорганизма выполняют с использованием ПЦР. Метод обладает высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, позволяет выявлять в клиническом образце микроорганизмы, содержащиеся в единичных количествах или в нежизнеспособном состоянии, характеризуется высокой воспроизводимостью и сжатыми сроками выполнения исследования (в течение нескольких часов).

Показаниями к проведению исследований для выявления ДНК при диагностике бактериальных менингитов являются:

отрицательные результаты диагностики иными методами, особенно в случае исследования образцов СМЖ после проведения массивной антибиотикотерапии или на поздних сроках болезни;
необходимость получения срочного ответа об этиологии возбудителя;
исследование образцов материала, доставленных в замороженном состоянии или фиксированных этанолом.

Детекция специфических АТ в сыворотке крови при диагностике менингококковой инфекции проводят с использованием РНГА. Рекомендуется проводить исследование дважды: в активной фазе заболевания (первые два дня после поступления в стационар) и на 12–14 день заболевания. Диагноз считается подтвержденным при нарастании титров АТ в четыре и более раза в пределах указанного периода.

Менингококковая инфекция – это острое инфекционное заболевание, первым признаком которого является острый назофарингит или воспаление носоглотки, протекающее с последующим развитием менингококцемии и гнойного менингита.

Возбудителем гнойного менингита и менингококцемии является Neisseria mеningitidis – грамотрицательная бактерия, которая существует в виде разных серологических типов, то есть обладает достаточно большим разнообразием антигенов, против которых иммунной системе человека в случае контакта с этой инфекцией придется вырабатывать антитела.

Большие эпидемии менингита, чаще всего, вызываются менингококком группы А. Тем не менее, большую значимость в эпидемиологии менингита имеет также менингококк группы В.

Менингококковая инфекция, пути заражения

Менингококковая инфекция передается воздушно-капельным путем. Источник инфекции – это всегда человек, больной острым назофарингитом, с острой генерализованной формой менингококковой инфекции или здоровый носитель. Обычно носителей менингококка не более 5-процентов, но в период эпидемии в очаге инфекции доля носителей может достигать 50%. При этом носительство менингококка обычно кратковременно, около недели.

Периодические подъемы заболевания происходят примерно через каждые 10 – 12 лет.

Менингококковая инфекция, признаки и симптомы

Как уже говорилось, наиболее часто встречающейся формой менингококковой инфекции является назофарингит. При попадании менингококка в верхние дыхательные пути, на слизистую оболочку носоглотки развивается местный воспалительный процесс. Инкубационный период составляет 2 – 3 дня, за ним следует продромальный или начальный период заболевания, во время которого больной менингококковой инфекцией наиболее заразен. Острый назофарингит развивается в течение 1 – 3х дней и характеризуется подъемом температуры до 38,0 С, яркой гиперемией (покраснением) и зернистостью задней стенки глотки, которая покрывается слизисто-гнойным отделяемым. Также отмечается покраснение миндалин, кашель, насморк со слизистым отделяемым с примесью зелени и гноя. Заболевание может длиться 3 – 5 дней и закончиться выздоровлением, а может перейти в генерализованную форму. В этом случае проникновение возбудителя в кровоток сопровождается появлением озноба, головной болью, подъемом температуры до 40 С. Генерализованная менингококковая инфекция может приводить к развитию гнойных очагов в различных внутренних органах: легких, сердце, суставах. Но самое страшное осложнение – это менингококцемия (менингококковый сепсис). Причем у маленьких детей менингококцемия может возникнуть внезапно на фоне полного здоровья, с повышением температуры тела до 40 – 41 градусов С за несколько часов и сопровождается головной болью, неукротимой рвотой, болями в мышцах и конечностях. Характерным признаком менингококцемии является появление звездчатой геморрагической сыпи (мелкие точечные кровоизлияния на коже, которые напоминают звездное небо).

И наконец, еще одной тяжелой формой менингококковой инфекции является менингит, который также развивается на фоне острого назофарингита. Менингококковый менингит начинается остро, с подъема температуры тела до высоких цифр, резкой мучительной головной боли, неукротимой рвоты, не связанной с приемом пищи.

Все формы генерализованной менингококковой инфекции требуют немедленной госпитализации в специализированное инфекционное отделение и проведения антибактериальной, а также интенсивной дезинтоксикационной терапии.

Менингококковая инфекция и вакцинация

Основным контингентом лиц, подлежащих вакцинации против менингококковой инфекции, являются дети, живущие в закрытых коллективах, а также отъезжающие на каникулы в организованные летние лагеря отдыха. В медицинской практике широко используются полисахаридные менингококковые вакцины, типа Менинго А+С или Менцевакс.

Данные вакцины предназначены для иммунизации детей от 2х лет и взрослых по схеме однократного введения одной дозы вакцины с последующей ревакцинацией через 2 – 3 года.

Таким образом, менингококковая инфекция, безусловно, относится к таким заболеваниям, против которых проще и дешевле сделать прививку, чтобы обезопасить себя от возможных неприятных осложнений. Естественно, целесообразность и безопасность каждой вакцинации необходимо предварительно обсудить со своим лечащим врачом, а при необходимости – со специалистом, врачом иммунологом.

Метод латексной агглютинации (ЛА) – это иммунологический метод, основанный на агрегации модифицированных латексных частиц, происходящей вследствие афинного взаимодействия антиген-антитело.

Реакцию прямой ЛА используют для определения поливалентных антигенов. Схема протекания прямой реакции латексной агглютинации показана на рис. 23.

Рис. 23. Схема протекания прямой латексной агглютинации:
а – агглютинация полимерных частиц, на которые иммобилизованы антитела, с молекулами низкомолекулярного антигена;
б – агглютинация полимерных частиц,
на которые иммобилизован антиген, с молекулами антител

При необходимости выявлять в растворе аналит антигенной природы, на полимерные микросферы иммобилизуют антитела, как это представлено на рис. 23 а. При необходимости выявлять в растворе аналит антительной природы, на полимерные микросферы иммобилизуют антигены, как это представлено на рис. 23 б.

Реакцию конкурентной латексной агглютинации используют для определения моновалентных антигенов, например, гаптенов. В этом случае антитела вступают в конкурентную реакцию со свободными антигенами и с антигенами, конъюгированными на носителе. Схема протекания обратной реакции латексной агглютинации показана
на рис. 24.

Рис. 24. Схема протекания реакции обратной латексной агглютинации:
а – в анализируемом растворе присутствует низкомолекулярный аналит, который конкурирует за сайты связывания с иммобилизованными на поверхности полимерных частиц антигенами. Антитела преимущественно связываются
со свободными антигенами с образованием низкомолекулярных;
б – а анализируемом растворе отсутствует аналит, свободные антитела связываются с иммобилизованными на поверхности полимерных частиц антигенами. Агглютинация наблюдается

Преимущества метода латексной агглютинации при скрининге наркотических веществ заключаются в следующем:

● возможность использования минимальных объемов исследуемого материала,

● возможность проведения больших партий анализов,

● быстрота проведения реакции (2–10 минут),

● простота и доступность для любых лабораторий,

● не требуется специальное оборудование и высококвалифицированный персонал,

● невысокая стоимость исследования.

Реакция латексной агглютинации считается положительной при наблюдении агглютинации микрочастиц суспензии вследствие смешивания компонентов реакционной системы. Агглютинация проявляется в слипании и осаждении полимерных частиц из первоначально стабильной суспензии. Результат латексной агглютинации выявляется простым визуальным наблюдением: раствор мутнеет или выпадает творожистый осадок белого цвета или реже – окрашенный (рис. 25).

Рис. 25. При положительной реакции на пластинках образуются видимые невооруженным глазом агглютинаты, которые затем увеличиваются в размере, а в пробирках выпадает осадок. В микропланшетах агглютинация проявляется в виде равномерного покрытия частицами поверхности лунки, тогда как в контроле на дне лунки образуется точечный латексный преципитат

При наблюдении реакции ЛА визуальным способом анализ проводят на стеклянных или полистирольных пластинках, в пробирках или 96-луночных микропланшетах с U-образными лунками, в которых смешивают равные объемы тестируемых сывороток в последовательных двукратных разведениях и латекс-теста и через определенное время (от нескольких минут до 5 часов) наблюдают реакцию.

Главное неудобство визуального наблюдения ЛА состоит в том, что часто бывает трудно точно определить конечную точку агглютинации, так как белый цвет полимерной суспензии или осадка плохо воспринимается глазом. Окрашивание латекса в голубой, красный, желтый, зеленый и другие цвета, а так же введение в микрочастицы флуоресцентных меток, позволяет преодолеть этот недостаток и облегчает наблюдение РЛА.

Результат РЛА носит только качественный характер. Для получения полуколичественных результатов (оценка степени агглютинации) используют титры. То есть количество антител в иммунной сыворотке или в других жидкостях в реакции агглютинации по выявлению антител оценивается их титром. Под титром антител понимают то наибольшее разведение сыворотки или иной жидкости, при котором реакция антиген-антитело все еще учитывается.

Для количественной оценки агглютинации применяют различные инструментальные методы. Среди них оптические методы: турбидиметрия (по изменению оптической плотности измеряют потерю интенсивности светового луча, прошедшего через суспензию частиц), нефелометрия (в этом случае анализируется интенсивность света, рассеянного под углом Q к падающему потоку; обычно, Q = 90°), сканирующая лазерная микроскопия и др.

Читайте также: