Му по лабораторной диагностике инфекционной анаэробной энтеротоксемии животных

Обновлено: 25.04.2024

Энтеротоксемия - остропротекающая инфекционная болезнь овец, ягнят, телят, поросят, пушных зверей, птицы, характеризующаяся тяжелой интоксикацией. Возбудитель - С. рerfringens, продуцирующий токсины типов В, С, D реже А и Е.

Лабораторная диагностика основана на обнаружении токсина в содержимом кишечника, выделении культуры возбудителя и определении токсигенных свойств.

Для исследованияв лабораторию направляют труп животного целиком или наиболее пораженные отрезки тонкого отдела кишечника (с содержимым), перевязанные с обоих концов, а также часть печени, селезенку и почку, экссудат брюшной полости, отечной подкожной клетчатки, трубчатую кость, мезентериальные лимфоузлы. Патматериал берут не позже 3-4 часов после гибели животного. От больного животного для исследования направляют фекалии (150-200г).

Микроскопическое исследование исходного материала.Из мукозы кишечника, органов готовят мазки, окрашивают по Граму. При микроскопии в положительных случаях находят крупные, короткие (0,6- 0,8х 1,2-4 мкм) со слегка закругленными концами, грамположительные, палочковидные клетки, имеющие капсулу. Необходимо принимать во внимание наличие С. perfringens в кишечнике клинически здоровых животных.

Токсические субстанции (а, β, έ, i) С. perfringens различных
типов (А, В, С, D, Е)

Тип C. perfringens	А	В	С	D	Е
Наличие токсина	а	а, β, έ	а, β	а έ	а, i

а -токсин - лецитиназа (фосфолипаза), разрушает мембрану клеток, вызывавает

(альфа-токсин) на кровяном агаре зону неполного гемолиза

( β -токсин - обладает летальным и некротизирующим действием, легко разрушается

έ -токсин - выделяется как протоксин, активизируется в кишечнике под

(эпсилон-токсин) влиянием протеаз

i -токсин - выделяется как протоксин, активизируется трипсином, обладает

(йота-токсин) летальным и некротизирующим действием

Идентификация токсинов С. perfringens. После обнаружения токсина его идентифицируют в реакции нейтрализации во внутрикожном тесте на морских свинках альбиносах или внутривенном (внутрибрюшинном) на белых мышах. Тест на мышах считается менее информативным, так как его результаты более подвержены неспецифическим воздействиям.

Внутрикожный тест па морских свинках. Смешивают 0,5 мл токсического материала с 0,2 мл питательного бульона и 0,1 мл антитоксической сыворотки. Общий объем должен составлять 0,8 мл. Если смешивают более чем одну сыворотку, то уменьшают количество бульона при сохранении общего объема смеси 0,8 мл. Аналогичные смеси готовят с трипсинизированным фильтратом: в фильтрат добавляют 1% трипсина (Дифко 1:250) и выдерживают один час при 37° С. Трипсин активирует эпсилон-прото-ксин и разрушает бета-токсин. Смесь инъецируют внутрикожно морским свинкам в объеме 0,2 мл. Реакцию учитывают через 24 и 48 часов (табл. 47).

Тест нейтрализации на мышах. Смеси готовят так же, как для теста на морских свинках, и инъецируют двум мышам. Результат учитывают в течение трех дней. О наличии или отсутствии токсина судят по смерти или выживанию животных. При наличии токсина в достаточном количестве смерть обычно наступает в течение 10 часов. Схема постановки реакции нейтрализации представлена в таблице 54.

1.1. Смешанная кишечная инфекция - остропротекающая инфекционная болезнь молодняка разных видов сельскохозяйственных животных, которая имеет полиэтиологическую природу и вызывается двумя-тремя и более видами патогенных энтеробактерий, относящимся к родам Escherichia, Citrobacter, Proteus, Morganella, Klebsiella, Salmonella. Помимо указанных микроорганизмов возбудителями болезни могут быть также бактерии других родов и семейств - Yersinia, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium и пр. Наряду с бактериальными агентами нередко (особенно на крупных фермах) болезнь обусловливают корона- и ротавирусы.

1.2. Болезнь возникает в первые дни и недели жизни животных и проявляется чаще в виде энзоотической вспышки, развитию которой способствуют различные факторы, связанные с несоблюдением технологических и ветеринарно-санитарных требований воспроизводства стада, а также нарушением режимов содержания и кормления молодняка.

1.3. Смешанная кишечная инфекция может протекать в кишечной (энтеритной) и септической формах. При кишечной форме возбудители болезни локализуются только в желудочно-кишечном тракте и брыжеечных лимфоузлах, регионарных поражённым участкам кишечника; при септической форме - в паренхиматозных органах, различных тканях, а также в кишечнике и брыжеечных лимфоузлах. Основными клиническими признаками болезни являются: потеря аппетита, понос, переходящий в профузный, нарастающая слабость, депрессия, учащенное дыхание и сердцебиение, обезвоживание организма (при затяжном течении); нередко наблюдается поражение центральной нервной системы (возбуждение, судороги), иногда пневмония, артриты; температура тела в пределах нормы, в отдельных случаях повышена на 0,5 - 1 °С, в предагональном состоянии она снижается ниже нормы.

1.4. Патологоанатомические изменения у погибших животных имеют картину катарального или катарально-геморрагического гастроэнтерита, на слизистой желудка, тонкого отдела кишечника и слепой кишки могут встречаться язвы, нередко отмечаются множественные точечные, полосчатые и пятнистые кровоизлияния на слизистой желудка, толстого и тонкого отделов кишечника, под капсулой селезенки, эпи- и эндокарде (клапанах); иногда отмечается очаговая катаральная пневмония и отек легких, дистрофия печени; регионарные брыжеечные лимфатические узлы как правило увеличены, отечны, на разрезе розового или красно-вишневого цвета; при вскрытии черепной коробки - гиперемия кровеносных сосудов и отек ткани головного мозга. Указанные изменения могут быть в отдельных или одновременно в нескольких органах.

1.5. Диагноз на смешанную кишечную инфекцию в хозяйствах устанавливают на основании совокупности эпизоотологических данных (возраст заболевших животных, массовость поражения, стационарность и др.), клинических признаков болезни, патологоанатомической картины и результатов бактериологического (при необходимости еще и вирусологического) исследования патологического материала от больных или погибших животных.

2.1. Для посмертной бактериологической диагностики в лабораторию направляют 2 - 4 свежих трупа погибших или убитых с диагностической целью больных животных (желательно не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами). В случае невозможности доставки целого трупа посылают следующий патологический материал: голову, трубчатую кость, сердце, перевязанное лигатурой вблизи разреза сосудов и аорты, селезенку, долю печени с желчным пузырем, брыжеечные лимфатические узлы, регионарные воспаленному участку кишечника, а также пораженный отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух концов лигатурой (в отдельной таре или полиэтиленовом пакете). Указанный патологический материал исследуют в день поступления его в лабораторию.

2.2. Для прижизненной бактериологической диагностики в лабораторию направляют фекалии больных диареей животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Пробы фекалий берут от 5 - 6 больных животных одной фермы в стерильные пробирки по 2 - 3 г непосредственно из прямой кишки с помощью прокипяченного резинового катетера. Пробирки вместе с сопроводительной запиской упаковывают в полиэтиленовый пакет или картонную коробку.

При невозможности быстрой доставки проб фекалий в лабораторию (через 3 - 4 часа после взятия) их консервируют стерильным 30 %-ным глицериновым раствором в соотношении 1:2 (см. приложение).

2.3. Пробы фекалий и содержимого тонкого отдела кишечника (в количестве не более 0,5 г) разводят в 10 см 3 стерильного 0,85 %-ного раствора хлорида натрия, тщательно размешивают и затем выдерживают 10 - 15 минут при комнатной температуре для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость используют для посева на питательные среды не позднее 1 - 2 часов после приготовления взвесей. При исследовании консервированных фекалий, их тщательно размешивают, после чего разводят физиологическим раствором в 5 - 10 раз.

3.1. Патологический материал (за исключением содержимого тонкого отдела кишечника и фекалий) засевают в пробирки с МПБ и на плотные дифференциально-диагностические среды в чашках: Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-сульфит агар). Содержимое тонкого отдела кишечника и фекалий засевают только на указанные выше плотные среды в чашках. Кроме того для выделения из фекалий сальмонелл неразведенные пробы фекалий засевают еще в одну из сред обогащения (селенитовый бульон, магниевую, Мюллера или др.) в соотношении 1:5.

3.1.1. Посев материала в МПБ проводят пастеровской пипеткой. Посевы на плотные среды в чашках из внутренних органов и тканей, указанных в п. 2.3, делают путем отпечатков разрезанной поверхностью кусочка органа из предварительно профламбированного участка на подсушенную питательную среду или вносят материал пастеровской пипеткой на поверхность среды, а затем равномерно растирают его стеклянным шпателем.

3.1.2. Содержимое тонкого отдела кишечника, взятое путем соскоба с пораженного участка слизистой оболочки, суспендируют в 10 см 3 стерильного 0,85 %-ного раствора хлорида натрия, затем засевают суспензию бактериологической петлей на подсушенные в термостате плотные дифференциально-диагностические среды в чашках широким частым штрихом по всей поверхности среды. Аналогичным образом проводят посев разведенных фекалий.

3.2. Пробирки с посевами в МПБ из внутренних органов и тканей инкубируют при температуре 37 - 38 °С в течение 18 - 24 часов. При наличии в МПБ помутнения среды культуру микроскопируют и в случае обнаружения мелких грамотрицательных палочек пересевают ее на агар Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-сульфит агар) в чашках, которые помещают в термостат (37 - 38 °С ) на 18 - 24 часа.

Пересев культур, полученных в МПБ, на плотные селективные среды проводят в том случае, если отсутствует рост колоний на этих средах в первичных посевах из соответствующих органов и тканей.

При наличии на агаре Эндо (или Левина) роящегося налета, характерного для протея, пересевают его на скошенный МПА (культуры из двух-трех внутренних органов, тканей или фекалий). Чашки и пробирки с посевами инкубируют 18 - 20 часов при той же температуре.

3.4. Чашки с первичными посевами на агаре Плоскирева инкубируют при температуре 37 - 38 °С в течение 24 - 36 часов. После просмотра культур пересевают мелкие круглые колонии S-формы полупрозрачные, сероватого цвета с голубым оттенком в пробирки со скошенным МПА (по 1 - 2 колонии с культур из двух-трех внутренних органов, тканей или фекалий, каждую колонию в отдельную пробирку), которые помещают в термостат на 18 - 24 часа.

В том случае, если пересев проводят на комбинированную среду (Олькеницкого, Клиглера), то каждую колонию пересевают в одну пробирку с этой средой и в одну пробирку со скошенным МПА.

3.5. Суточные культуры бактерий на скошенном МПА или комбинированной среде, выделенные из внутренних органов, тканей или фекалий, микроскопируют (окраска по Граму) и при наличии в мазках однородных мелких грамотрицательных палочек, не образующих спор и капсул (бактерии вида Klebsiella pneumoniae образуют капсулу), используют для изучения ферментативных, патогенных, антигенных свойств, а также (при необходимости) определения подвижности в полужидком МПА. Для выявления у культур клебсиелл капсулы окраску мазков проводят по методу Гинса (тушью).

3.6. Ферментативные свойства изучают у 2 - 6 агаровых (в порядке исключения у бульонных) культур бактерий, выделенных из одного патологического материала, на наборе сред с углеводами и индикатором Андреде или полужидких средах с индикатором ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на средах с мочевиной, сернокислым железом (определение сероводорода), агаре Симонса, в бульоне Хоттингера или МПБ (определение индола), мясопептонной желатине, среде с фенилаланином.

При использовании комбинированной среды Олькеницкого или Клиглера учитывают изменения, вызываемые представителями разных родов энтеробактерий в этой среде, после чего данную культуру изучают по другим необходимым биохимическим тестам.

Засеянные пробирки инкубируют при температуре 37 - 38 °С.

Предварительные результаты изучения ферментативных свойств культур учитывают через 24 часа, окончательные результаты - через 48 часов. Изучение ферментативных свойств культур энтеробактерий можно проводить также с помощью тест-системы для биохимической идентификации энтеробактерий. Родовую и видовую принадлежность культур устанавливают по показателям таблицы.

Следует учитывать, что у бактерий рода Proteus встречаются нероящиеся штаммы, образующие при росте на плотных питательных средах мелкие круглые колонии S-формы сероватого цвета. Важными признаками родовой идентификации таких штаммов является их способность дезаминировать фенилаланин и разжижать желатин.

При наличии у культур отклонений от основных показателей таблицы используют дополнительные тесты: реакции с метилротом и Фогес-Проскауэра, наличия образования оксидазы, определение подвижности и др.

СХЕМА
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА НА СМЕШАННУЮ КИШЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ

Дифференциальные признаки энтеробактерий по ферментативным свойствам

Токсические субстанции (а, β, έ, i) С. perfringens различных
типов (А, В, С, D, Е)

Тип C. perfringens	А	В	С	D	Е
Наличие токсина	а	а, β, έ	а, β	а έ	а, i

а -токсин - лецитиназа (фосфолипаза), разрушает мембрану клеток, вызывавает

(альфа-токсин) на кровяном агаре зону неполного гемолиза

( β -токсин - обладает летальным и некротизирующим действием, легко разрушается

έ -токсин - выделяется как протоксин, активизируется в кишечнике под

(эпсилон-токсин) влиянием протеаз

i -токсин - выделяется как протоксин, активизируется трипсином, обладает

(йота-токсин) летальным и некротизирующим действием

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями

Методические указания разработаны:

Центральным Ордена Ленина институтом усовершенствования врачей Минздрава СССР (С.Д.Татаринова);

Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии Минздрава СССР (В.А.Килессо, Н.С.Прямухина, Ю.Я.Тендетник, Г.В.Ющенко);

Центральным научно-исследовательским институтом вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова Минздрава СССР (И.В.Голубева, Б.С.Киселева, Н.А.Хоменко);

Санитарно-эпидемиологической станцией Московской железной дороги (Ю.М.Крюков)

Килессо В.А., д.м.н., профессор

Прямухина Н.С., к.м.н. (заместитель председателя)

Татаринова С.Д., к.м.н., доцент (председатель)

Томашевич В.А., к.м.н. (секретарь)

Заместитель министра здравоохранения СССР П.Н.Бургасов 17.12.1984.

ВВЕДЕНИЕ

За последние 15-20 лет в научных и практических учреждениях нашей страны предложены и апробированы эффективные и научно обоснованные методы выделения и идентификации энтеробактерий. Разработаны и частично внедрены в производство новые диагностические препараты: питательные среды, сыворотки, высокоспецифические диагностикумы, системы для ускоренной идентификации, препараты бактериофагов и некоторые другие реагенты.

В представленный документ включены методы классической бактериологической диагностики заболеваний, вызываемых энтеробактериями, ускоренные методы идентификации и выявления антигенов энтеробактерий, а также методы серологической диагностики соответствующих заболеваний и сведения о приготовлении ряда необходимых питательных сред.

"Методические указания. " преследуют цель унификации методов проведения лабораторной диагностики с применением современных приемов, позволяющих идентифицировать любые из известных в данное время представителей энтеробактерий*. Внедрение в практику данных методических указаний будет способствовать повышению уровня микробиологической диагностики в стране.

* "Инструкцию по микробиологической диагностике кишечных заболеваний, вызванных шигеллами, сальмонеллами и энтеропатогенными кишечными палочками", утв. нач. ГСЭУ Минздрава СССР 11.05.66 г. N 629-66, считать утратившей силу.

В "Методических указаниях. " представлены также разделы по определению эпидемиологических маркеров штаммов энтеробактерий.

Принятые в тексте сокращения:

УПЭ - условно патогенные энтеробактерии;

ЭПЭ - энтеропатогенные эшерихии;

ЭМС - агар с эозин-метиленовым синим;

ВСА - висмут-сульфит агар;

ИХН - изотонический раствор хлорида натрия;

СПА - слабощелочной питательный агар;

СПБ - слабощелочной питательный бульон;

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации.

1. Идентификацию выделенных энтеробактерий по биохимическим свойствам до уровня рода и вида проводят во всех бактериологических лабораториях санитарно-эпидемиологических станций и лечебно-профилактических учреждений.

2. Серологическую идентификацию шигелл до уровня сероваров (и подсероваров), сальмонелл - до сероваров, энтеропатогенных эшерихий - до ОК-серогрупп проводят во всех указанных лабораториях.

3. Исследования с целью серологической диагностики заболеваний (бактерионосительства) проводят по указанию клинициста или эпидемиолога во всех указанных лабораториях.

4. Определение эпидемиологических маркеров штаммов упомянутых патогенных энтеробактерий - биоваров, сероваров (энтеропатогенных эшерихий), фаговаров, колициногеноваров, колициноваров - проводят по эпидемиологическим показаниям и наличии соответствующих условий в лабораториях республиканских, краевых, областных, городских (в городах с районным делением) санитарно-эпидемиологических станций.

5. Определение сероваров и биоваров условно патогенных энтеробактерий проводят по эпидемиологическим показаниям в лабораториях, перечисленных в п.4.

1. КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

В настоящее время определение таксономических категорий в бактериологии основано на сочетании морфологических, тинкториальных, биохимических, генетических и других биологических характеристик.

* На русском языке издан его сокращенный вариант - Краткий определитель бактерий Берги (1980).

С целью унификации и правильности написания названий бактерий Международным кодексом номенклатуры бактерий (1975) сформулированы определенные правила. В частности, наименование бактерий следует писать только по-латыни, при этом род - с заглавной буквы, а видовой эпитет - со строчной. Например: Salmonella typhi, или сокращенно S. typhi. Рекомендовано также при внутривидовой дифференциации употреблять термины фаговар вместо фаготип, серовар вместо серотип и т.д.

Семейство Enterobacteriaceae объединяет обширную группу грамотрицательных палочек подвижных или неподвижных, образующих или не образующих капсулы, некислотоустойчивых, не образующих спор, аэробов или факультативных анаэробов. Они образуют кислоту при ферментации глюкозы, цитохромоксидазоотрицательны, восстанавливают нитраты до нитритов (кроме некоторых штаммов Erwinia). Характеристики отдельных родов и видов приведены далее.

В таблице 1 представлены основные таксономические категории и номенклатура энтеробактерий.

Таблица 1. Классификация семейства Enterobacteriaceae
(по Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1974)

Группа (особое обозначение)

2. O. intermedius

1. B. dysenteriae

3. K. rhinoscleromatia

5. P. inconstans
(Providencia)

2. Y. pseudotuberculosis

3. Y. enterocolitica

Классификация семейства Enterobateriaceae, предложенная Юингом (W.Ewing, 1967-1972) и имеющая признание до настоящего времени, по некоторым позициям расходится с Определителем бактерий Берги. Поэтому считаем необходимым указать на наиболее существенные расхождения.

Так, в Определителе Берги не упоминается Klebsiella oxytoca, фактически представляющая биовар K. pneumoniae, отличающийся по тестам на индол и желатин. В классификации Юинга K. oxytoca рассматривают как самостоятельный вид. В роду Serratia по Берги имеется единственный вид - S. maroescens, а Юингом в этот род включены еще два вида: S. liquefaciens и позднее S. rubideae. У Берги имеется вид Proteus inconstans, по Юингу это род Providencia. В Определителе Берги в род Citrobacter включены два вида: C.freundii и C.intermedius. У Юинга имеется третий вид - C. diversus, который является биоваром C. intermedius.

Эти сопоставления приведены лишь для справок, так как в "Методических указаниях. " принята классификация по Берги.

2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Бактериологическому исследованию на наличие энтеробактерий может быть подвергнут различный материал, получаемый от людей; показания к его исследованию, правила взятия, подготовки к посеву и выбор питательных сред различны. Однако, начиная с отбора колоний на пластинчатых средах, последующие этапы бактериологического исследования (определение родовой, видовой принадлежности выделенных культур, их серологических характеристик и др.) идентичны (см. схему 1).

2.1. Материал для исследования

Обоснованные показания к проведению бактериологического исследования того или иного материала и правильное его взятие в значительной мере определяют эффективность действий бактериолога. В определении характера подлежащих исследованию материалов, сроков их взятия ведущее значение принадлежит врачам-клиницистам и эпидемиологам. Основные показания к исследованию различных клинических материалов приведены в табл.2.

Таблица 2. Показания к бактериологическим исследованиям различного клинического материала

Засеянные пробирки инкубируют при температуре 37 - 38 °С.

СХЕМА
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА НА СМЕШАННУЮ КИШЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ

Дифференциальные признаки энтеробактерий по ферментативным свойствам

Читайте также: