Определение бактерий рода salmonella в пищевых продуктах

Обновлено: 25.04.2024

Текст Сравнения ГОСТ 31659-2012 с ГОСТ Р 52814-2007 см. по ссылке.

- Примечание изготовителя базы данных.

Дата введения 2013-07-01

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ ВНИИКОП) на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 20 июля 2012 г. N 50)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2012 г. N 715-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31659-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ISO 6579:2002* Microbiology of food and animal feeding staffs** - Horizontal method for the detection of Salmonella spp. (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод выявления Salmonella spp.) в части пищевых продуктов. При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребности экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом***.

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей.

*** В оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие", приложении ДА и по тексту документа отмеченные знаком "**" приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом. - Примечания изготовителя базы данных.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие в ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в приложении ДА.

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

ВНЕСЕНА поправка*, опубликованная в ИУС N 5, 2015 год

* См. ярлык "Примечания".

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной массе или объеме продукта бактерий рода Salmonella, включая Salmonella Typhi и Salmonella Paratyphi.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления бактерий рода Salmonella.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9536-79 Спирт изобутиловый технический. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 бактерии рода Salmonella: Микроорганизмы, которые на агаризованных селективно-диагностических средах образуют типичные или не совсем типичные колонии.

Примечание - Описание и методы определения биохимических и серологических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.

3.2 выявление бактерий рода Salmonella: Определение присутствия или отсутствия бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

4 Сущность метода

4.1 Общие положения

Метод выявления бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта состоит из четырех этапов (см. 4.2; 4.3; 4.4; 4.5 и приложение А).

4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в продукте в небольшом количестве вместе с большим количеством других бактерий из семейства Enterobacteriaceae или других семейств. Поэтому предварительное обогащение необходимо для выявления небольшого числа бактерий рода Salmonella или сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella.

Навеску массой 25 г вносят в забуференную пептонную воду, затем инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч.

Для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение (см. 8.1.2).

Для большего эффекта перед внесением навески продукта забуференную пептонную воду нагревают до температуры (37±1) °С.

4.3 Обогащение в селективной жидкой среде

Среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) и одну из двух сред: Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон) или селенитовую среду - инокулируют культурой, полученной по 4.2. После посева RVS-бульон инкубируют при температуре (41,5±1,0) °С в течение (24±3) ч, а МКТ-бульон и селенитовую среду - при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.4 Пересев на чашки для идентификации

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две селективные агаризованные среды:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-arap) и

- на одну из следующих агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.5 Проведение идентификации

Колонии, предположительно относящиеся к бактериям рода Salmonella, полученные на чашках по 4.4, идентифицируют с помощью биохимических и серологических тестов.

5 Питательные среды, реактивы и сыворотки

5.1 Общие положения

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества (не ниже ч.д.а. или х.ч.).

5.2 Питательные среды и реактивы

Состав и приготовление питательных сред и реактивов указаны в приложении В.

5.2.1 Среда для неселективного предварительного обогащения: забуференная пептонная вода по В.1.

5.2.2 Первая селективная обогатительная среда: среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) по В.2.

5.2.3 Вторая селективная обогатительная среда: селенитовая среда по В.3.

5.2.4 Третья селективная обогатительная среда: тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (МКТ-бульон) по В.4.

5.2.5 Агаризованные селективные среды для чашек.

5.2.5.1 Первая среда: ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-arap) по В.5.

5.2.5.2 Вторая среда по В.6.

5.2.6 Питательный агар по В.7.

5.2.7 Мясо-пептонный агар или ГРМ-агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов на основе гидролизата рыбной муки) по В.8.

5.2.8 Мясо-пептонный бульон с глюкозой по В.9.

5.2.9 Среды с углеводами (среды Гисса) по В.10.

5.2.10 Трехсахарный железистый агар (TSI-arap) или агар Клиглера, или агар Олькеницкого по В.11.

5.2.11 Агар с мочевиной (Кристенсена) по В.12.

5.2.12 L-лизин-декарбоксилазная среда по В.13.

-галактозидазы (или используются в соответствии с инструкцией изготовителя готовые бумажные диски) по В.14.

5.2.14 Реактив для реакции Фогес-Проскауера (VP) по В.15.

5.2.15 Реактивы для индольной реакции по В.16.

5.2.16 Триптон/триптофановая среда по В.17.

5.2.17 Бульон Хоттингера по В.18.

5.2.18 Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана по В.19.

5.2.19 Полужидкий питательный агар по В.20.

5.2.20 Полужидкий мясо-пептонный агар по В.21.

5.2.21 Физиологический раствор по В.22.

Имеется несколько типов агглютинирующих сывороток, содержащих антитела для одного или нескольких О-антигенов, т.е. антисыворотки, содержащие одну или более "О" групп (моновалентные или поливалентные анти-О-сыворотки), анти-Vi-сыворотки и антисыворотки, содержащие антитела для одного или нескольких Н-факторов (моновалентные или поливалентные анти-Н-сыворотки).

Каждое опытное определение должно давать гарантию, что используемая антисыворотка пригодна для выделения всех серотипов бактерий рода Salmonella.

Сухие агглютинирующие адсорбированные О-, Vi-, Н-сальмонеллезные сыворотки промышленного производства готовят перед употреблением по прилагаемой к ним инструкции.

6 Аппаратура, материалы и реактивы

Приемлемой альтернативой посуде многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям.

Обычное лабораторное оборудование и реактивы для микробиологических исследований по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

Аппарат для сухой стерилизации (стерилизационный сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) по ГОСТ ISO 7218 (подразделы 4.5 и 4.10).

Термостат, поддерживающий температуру (37±1) °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.6).

Водяная баня, поддерживающая температуру (41,5±1,0) °С, или термостат, поддерживающий температуру (41,5±1,0) °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.9).

Водяная баня, поддерживающая температуру 44 °С-47 °С и (37±1) °С, по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.9).

Прибор для мембранной фильтрации.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г (для взвешивания реактивов) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 мг*.

* Письмом Росстандарта от 23.06.2021 N 1637-ИК/03 разъясняется, что "в части пределов допускаемой абсолютной погрешности лабораторных весов для взвешивания реактивов допущена опечатка". Следует читать: ±0,01 г. - Примечание изготовителя базы данных.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг (для взвешивания продукта) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±20,0 мг.

Бактериологическая петля диаметром около 3 мм.

рН-метр с точностью калибровки ±0,1 рН при температуре 20 °С-25 °С по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.4).

Стекла предметные по ГОСТ 9284 .

Стекла покровные по ГОСТ 6672 .

Пробирки или флаконы соответствующей вместимости.

Могут быть использованы бутылки или флаконы с нетоксичными металлическими или пластиковыми завинчивающимися крышками.

Чашки Петри среднего размера (диаметр 90 или 100 мм) и/или большие (диаметр 140 мм).

Спирт изобутиловый по ГОСТ 9536 .

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709**.

Желчь бычья сухая или натуральная.

Железо (III) аммоний цитрат.

Железо (III) цитрат.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363 .

Карбамид (мочевина) по ГОСТ 6691 .

Контрольный штамм бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе.

ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002)*
____________________
* Поправка (ИУС 5-2015).

Метод выявления бактерий рода Salmonella

Food products. Method for the detection of Salmonella spp

____________________________________________________________________
Текст Сравнения ГОСТ 31659-2012 с ГОСТ Р 52814-2007 см. по ссылке.
- Примечание изготовителя базы данных.
____________________________________________________________________

Дата введения 2013-07-01

Предисловие

Сведения о стандарте

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Казахстан

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ВНЕСЕНЫ: поправка*, опубликованная в ИУС N 5, 2015 год; поправка, опубликованная в ИУС N 1, 2022 год, введенная в действие с 23.08.2021

* См. ярлык "Примечания".

Поправки внесены изготовителем базы данных

1 Область применения

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления бактерий рода Salmonella.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9536-79 Спирт изобутиловый технический. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

4 Сущность метода

4.1 Общие положения

4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение (см. 8.1.2).

4.3 Обогащение в селективной жидкой среде

4.4 Пересев на чашки для идентификации

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две селективные агаризованные среды:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-arap) и

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.5 Проведение идентификации

5 Питательные среды, реактивы и сыворотки

5.1 Общие положения

5.2 Питательные среды и реактивы

Состав и приготовление питательных сред и реактивов указаны в приложении В.

5.2.1 Среда для неселективного предварительного обогащения: забуференная пептонная вода по В.1.

5.2.2 Первая селективная обогатительная среда: среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) по В.2.

5.2.3 Вторая селективная обогатительная среда: селенитовая среда по В.3.

5.2.4 Третья селективная обогатительная среда: тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (МКТ-бульон) по В.4.

5.2.5 Агаризованные селективные среды для чашек.

5.2.5.1 Первая среда: ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-arap) по В.5.

ГОСТ Р 52814-2007
(ИСО 6579:2002)

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Метод выявления бактерий рода Salmonella

Food products. Method for the detection of Salmonella

____________________________________________________________________
Текст Сравнения ГОСТ Р 52814-2007 с ГОСТ 31659-2012ссм. по ссылке.
- Примечание изготовителя базы данных.
____________________________________________________________________

Дата введения 2009-01-01

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 года N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ ВНИИКОП) на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки фруктов, овощей и грибов"

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 6579:2002 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод выявления Salmonella spp." (ISO 6579:2002 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp.") в части пищевых продуктов. При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004* (подраздел 3.5).

* На территории Российской Федерации в части разд.8 и приложений Ж, И, К действует ГОСТ Р 1.7-2008.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в приложении Г

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления бактерий рода Salmonella в масложировой продукции.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9536-79 Спирт изобутиловый технический. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования*
________________

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, а также по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

4 Сущность метода

4.1 Общие положения

4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Забуференную пептонную воду инокулируют при комнатной температуре навеской продукта, затем инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч.

Для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение (см. 8.1.2).

4.3 Обогащение в селективной жидкой среде

4.4 Пересев на чашки для идентификации

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две селективные агаризованные среды:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-aгap) и

- на одну из следующих агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч.

4.5 Проведение идентификации

5 Питательные среды, реактивы и сыворотки

5.1 Общие положения

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества.

5.2 Питательные среды и реактивы

Состав и приготовление питательных сред и реактивов указаны в приложении В.

5.2.1 Среда для неселективного предварительного обогащения: забуференная пептонная вода по В.1.

5.2.2 Первая селективная обогатительная среда: среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) по В.2.

5.2.3 Вторая селективная обогатительная среда: селенитовая среда по В.3.

5.2.4 Третья селективная обогатительная среда: тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (МКТ-бульон) по В.4.

5.2.5 Агаризованные селективные среды для чашек.

5.2.5.1 Первая среда: ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-aгap) по В.5.

5.2.5.2 Вторая среда по В.6.

5.2.6 Питательный агар по В.7.

5.2.8 Мясо-пептонный бульон с глюкозой по В.9.

5.2.9 Среды с углеводами (среды Гисса) по В.10.

5.2.10 Трехсахарный железистый агар (TSI-aгap) или агар Клиглера, или агар Олькеницкого по В.11.

5.2.11 Агар с мочевиной (Кристенсена) по В.12.

5.2.12 L-лизин-декарбоксилазная среда по В.13.

5.2.13 Реактив для определения -галактозидазы (или используются в соответствии с инструкцией изготовителя готовые бумажные диски) по В.14.

4.2. Биологические и микробиологические факторы

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА САЛЬМОНЕЛЛЕЗОВ, ОБНАРУЖЕНИЕ САЛЬМОНЕЛЛ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Дата введения 2010-09-02

1. Методические указания разработаны ФГУН "ЦНИИ эпидемиологии" Роспотребнадзора (С.Ш.Рожнова, А.Т.Подколзин).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 13.08.2010 г.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами организаций здравоохранения и других заинтересованных организаций.

1.2. В настоящих методических указаниях определен порядок проведения лабораторных исследований в целях обнаружения сальмонелл в клиническом материале, пищевых продуктах и объектах окружающей среды.

1.3. Настоящие методические указания распространяются только на лаборатории, имеющие право на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и удовлетворяющие требованиям к помещениям и оборудованию в соответствии с СанПиН 1.3.2322-08.

2. Термины и сокращения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Н-антиген - жгутиковый антиген, представляющий собой термолабильный белок

О-антиген - соматический антиген, представляющий собой липополисахарид клеточных мембран

Смесь О-сывороток - диагностические адсорбированные сыворотки сальмонеллезные

R-форма - шероховатая форма

RAPD - амплификация с произвольными (случайными) праймерами

ISO-6579 - международная организация стандартизации

MLST - мультилокусное секвенирование-типирование

PFGE - электрофорез в пульсирующем поле

VNTR - амплификация тандемных повторов с переменной копийностью

S-форма - гладкая форма

SS-агар - сальмонелла-шигелла агар

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

AFLP - оценка полиморфизма длины фрагментов амплификации

3. Нормативные ссылки

МУ по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями - 1984 г.

ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella.

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологического анализа.

ГОСТ Р 50455-92 Мясо и мясные продукты. Обнаружение сальмонелл (арбитражный метод).

ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".

ГОСТ 7702.20-95 "Субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб".

ГОСТ Р 52833-2007 (ИСО 22174-2005). Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения.

ГОСТ 30705-2000 "Продукты молочные для детского питания. Методы микробиологического анализа".

МУ 4.2.1884-04 Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов.

МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют МУ 1.3.2569-09, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

Информационное письмо МЗ РСФСР N 10/11-3223 от 28.08.1987 г.

"Методы контроля бактериологических питательных сред". Методические указания. МУК 4.2.2316-08.

"Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней". Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08.

"Методы контроля. Бактериологические и микробиологические факторы. Техника сбора и транспортировки биоматериала в микробиологические лаборатории" МУ 4.2.2039-0.

Инструкция по применению набора реагентов "Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный О-антигенный жидкий" от 22.08.2008 N 6854-Пр/08.

Laboratory Protocol "Isolation of Salmonella spp. From Food and Animal Faeces" 5 Ed June 2010. WHO Global Foodborhe Infections Network.

Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 2007, 9 edition WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella.

4. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы

4.1. Аппаратура и инструментарий

Наименование аппаратуры и материалов

Названия нормативных документов (ГОСТ, ТУ)

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH±0,01

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160±5) °С

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °С с отклонением от заданной ±1 °С

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °С с отклонением от заданной ±1 °С

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ТУ 3-3.404-83, ТУ 3-3.154-80, ТУ 3-3.190-80, ТУ 3-3.193-80, ТУ 3-3.986-81, являющиеся авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 51935-2002. - Примечание изготовителя базы данных.

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды в соответствии с

Гомогенизатор перистальтического типа "Микс-2", "Стомайкер", или других наименований

AES Lab., Cat.N AESAP 1066

Гомогенизатор типа "вортекс"

Микропипетки на 200-1000 мкл

BIOHIT, Cat.N 720040 или "Ленпипет"

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

Холодильник бытовой электрический

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 21239-93. - Примечание изготовителя базы данных.

Скальпель хирургический, 15 см

Часы механические сигнальные

Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания)

4.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 9412-93. - Примечание изготовителя базы данных.

Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости

Вата медицинская гигроскопическая

Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см

Пробирки типов II1, II2

Стекла предметные для микропрепаратов

Спиртовки лабораторные стеклянные

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С)

Медицинская микробиология:

Выявление бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах

Метод предназначен для выявления в определенной навеске продукта бактерий рода Salmonella. Для этого определенное количество продукта высевают в жидкую неселективную среду, после инкубирования которой производят посев в жидкие селективные среды. Затем полученные культуры пересевают на плотные дифференциально-диагностические среды. Выросшие на этих средах характерные колонии исследуют, выявляя характерные для сальмонелл биохимические и серологические признаки.

Доводят pH до 7,0(±0,2) жидких высококислотных продуктов — перед посевом, а твердых высококислотных продуктов — в посевах. Для этого используют стерильные растворы гидроокиси натрия и соляной кислоты.

В ряде случаев предварительное неселективное обогащение можно не производить (при анализе колбасных изделий и продуктов из мяса, яичных продуктов, мяса).

б) Селективное обогащение. По 10 см 3 полученных в результате предварительного обогащения культуры пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого используют по 100 см 3 магниевой и тетратионатной сред или по 100 см 3 селенитовой и тетратионатной среды. В ряде случаев помимо перечисленных сред допускается использование среды Мюллера (при анализе яичных продуктов). Посевы культивируют в течение 24-48 ч при 36(±1)°С (магниевая и селенитовая среда) и 43(+1)°С (тетратионатная среда).

в) Выделение культур на плотных дифференциально-диагностических средах. Через 24 и 48 ч инкубирования микроорганизмы из селективных сред пересевают методом истощающего штриха на три агаризованные дифференциально-диагностические среды—висмут-сульфит агар, среду Плоскирева и среду Эндо (или Левина). В ряде случаев помимо перечисленных сред допускается использование агара с бриллиантовым зеленым и феноловым красным (при анализе мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих). Посевы культивируют при 36(±1)°С в течение 24-48 ч. Предварительный учет производят через 24 ч, окончательный—через 48 ч.

На дифференциально-диагностических средах отмечают наличие колоний, характерных для сальмонелл. При отсутствии в посевах характерных колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продукта.

Если хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде обнаружены колонии, характерные для Salmonella, проводят их дальнейшее изучение.

г) Биохимическое подтверждение принадлежности к Salmonella. Не менее трех характерных колоний с каждой дифференциально-диагностической среды пересевают на поверхность скошенного МГ1А и параллельно на трехсахарный агар (штрихом по поверхности и уколом в столбик). Посевы культивируют при 36(±1) °С в течение 24 ч.

После того как произведен посев, из материала отобранных колоний готовят мазки и окрашивают их по Граму. Бактерии рода Salmonella являются не образующими спор грамотрицательными палочками с закругленными концами.

Учет результатов культивирования на трехсахарном агаре позволяет установить способность бактерий к ферментации лактозы, сахарозы и глюкозы, а также способность к образованию сероводорода. В ряде случаев допускается использование сред Ресселя, Клиглера (при анализе яичных продуктов, мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих), Крумвиде-Олькеницкого (при анализе яичных продуктов, мяса, колбасных изделий и продуктов из мяса). Типичные культуры Salmonella ферментируют глюкозу (с образованием или без образования газа), не ферментируют лактозу и сахарозу, образуют сероводород.

Дальнейшим исследованиям подвергают бактерии, удовлетворяющие этим требованиям, а также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа). Эти культуры пересевают на поверхность скошенного МПА и инкубируют при 36(±1)°С в течение 24 ч. Выросшие бактерии используют для определения способности к расщеплению мочевины, образованию индола и ацетоина, ферментации сахарозы и маннита, подвижности.

Для установления способности расщеплять мочевину культуру высевают штрихом на среду Кристенсена с мочевиной и культивируют при 36(± 1) °С в течение 24 ч. При росте уреазоположительных бактерий среда достаточно быстро (часто даже после 2 ч инкубации) приобретает цвет от розового до темно-вишневого. Сальмонеллы мочевину не расщепляют.

Для определения образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) культуры пересевают в мясопептонный бульон с глюкозой. Посевы инкубируют при 36(±1) °С в течение 48 ч. Затем отбирают в стерильную пробирку 1 см 3 культуральной жидкости, прибавляют 0,6 см 3 раствора α-нафтола. Пробирку встряхивают и прибавляют 0,2 см 3 раствора гидроокиси калия в концентрации 400 г/дм 3 . Смесь хорошо встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию. Учет результатов реакции можно проводить не ранее чем через 15 мин и не позднее чем через 2 ч. Сальмонеллы не образуют ацетоина (реакция отрицательная).

Для определения образования индола культуры пересевают в мясопептонный бульон с триптофаном. Посевы инкубируют при 36(±1)°С в течение 24 ч. Затем к посевам прибавляют по 1 см 3 реактива Эрлиха или Ковача. При наличии индола (положительная реакция) в пограничном слое в течение 5 мин появляется красное окрашивание. Сальмонеллы индол не образуют.

Для установления способности к ферментации маннита и сахарозы культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой. Посевы культивируют при 36(±1)°С в течение 24 ч. При сбраживании указанных субстратов изменяется цвет среды, образуется или не образуется газ. Сальмонеллы не сбраживают маннит и сахарозу.

Для определения подвижности культуры пересевают уколом в полужидкий МПА. Посевы инкубируют при 36(±1)°С в течение 24 ч. При росте подвижных бактерий наблюдается диффузный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных бактерий—только вдоль места укола. Большинство сальмонелл подвижно.

Полученные результаты оценивают пользуясь таблицей.

В ряде случаев (например, при анализе мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих) дополнительно выявляют способность выделенных культур к дезаминированию фенилаланина. Сальмонеллы дают отрицательную реакцию.

д) Серологическое подтверждение принадлежности к Salmonella. Культуры, проявившие типичные биохимические свойства, пересевают на поверхность скошенного МПА и инкубируют при 36(±1) °С в течение 24 ч.

Определение самоагглютинирующих штаммов. Каплю физраствора помещают на предметное стекло и диспергируют в ней часть исследуемой культуры так, чтобы получилась густая гомогенная суспензия. Стекло осторожно покачивают 30-60 с. Затем отмечают результаты на темном фоне (лучше при помощи увеличительного стекла). Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, т. е. образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией. Эти штаммы не подвергают дальнейшей серологической идентификации.

Определение О-антигенов проводят в реакциях с поливалентными сальмонеллезными сыворотками основных групп А, Б, С, Д, Е, а затем, если не выявлено О-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп. Ход определения указан в прилагаемых к сывороткам инструкциях.

е) Оценка результатов. К Salmonella относят культуры, показавшие типичные биохимические и серологические реакции. Предположительно к Salmonella относят культуры с типичными биохимическими реакциями, но не имеющих самоагглютинации и О-антигенов, а также культуры с типичными биохимическими реакциями и самоагглютинацией.

Читайте также: