Основа агара для выделения стафилококков и бацилл

Обновлено: 25.04.2024

Медицинская микробиология:

Среды для выделения и изучения стафилококков

а) Желточно-солевой агар. Среда предназначена для выделения стафилококков и выявления пигмента.

Для приготовления используют мясопептонный агар (pH 7,3±0,1) с добавлением 10% натрия хлорида. После розлива во флаконы по 100,0-200,0 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 121°С.

Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и добавляют 20% (по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Среду быстро перемешивают, разливают в чашки, которые продолжительное время могут оставаться в холодильнике в полиэтиленовых пакетах. Готовая среда полупрозрачна, имеет беловатый цвет с легким кремовым оттенком.

Учет результатов производят через 36-48 ч инкубации в термостате при 35-37°С. На этой среде хорошо выявляются пигментные свойства микроорганизма, обусловленные липохромным пигментом. Вокруг колоний можно видеть радужный венчик за счет образования лецитовителлазы. Добавление к среде 10% стерильного снятого молока усиливает пигментообразование.

б) Желточная среда по Г.Н.Чистовичу. Среда предназначена для определения лецитиназной активности стафилококков.

К мясопептонному питательному агару, приготовленному по общепринятой прописи, добавляют 20% желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида).

При определении лецитиназной активности по методу Чистовича исследуемую культуру стафилококка засевают на среду отдельными штрихами или бляшками. Посевы помещают в термостат при 36-37°С. Вокруг колоний стафилококка, продуцирующих лецигиназу, образуются четко выраженные зоны помутнения с радужным венчиком по периферии.

в) Среда Casman E.R. в модификации Ф.С.Флуера для получения стафилококкового энтеротоксина.

Состав:
Ферментативный гидролизат казеина
Цитрат железа — 0,25 г
KH₂PO₄ - 1,0 г
К₂HPO₄*3H₂O - 1,0 г
MgSO₄*7H₂O - 0,2 г
L-цистин — 0,025 г
L-триптофан — 0,075 г
Ацетат натрия — 7,0 г
Кальция пантетонат — 0,0005 г
Тиамин гидрохлорид — 0,00004 г
Никотиновая кислота — 0,0012 г
Дистиллированная вода — до 1000,0 мл

Навески ингредиентов (кроме четырех — см. ниже) вносят в колбу с ферментативным гидролизатом казеина; объем ферментативного гидролизата вносится из расчета конечного содержания аминного азота в среде — 2,0 г/л. Затем вносят L-триптофан, предварительно растворенный в 3 мл 1N раствора НО. Общий объем воды доводят до 1 л дистиллированной водой, тщательно перемешивают. Подогревают (при частом перемешивании) и кипятят 1 мин для полного растворения. Устанавливают pH среды 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 15 мин.

Кальций пантетонат, тиамин гидрохлорид и никотиновую кислоту стерилизуют отдельно через миллипоровские фильтры и добавляют асептически в среду перед посевом.

Подготовка раствора кальция пантегоната: берут навеску 500,0 мкг, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильного пангентоната кальция асептически перед посевом добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

Подготовка раствора тиамина гидрохлорида: берут навеску 40,0 мкг, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильного раствора тиамин гидрохлорида асептически добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

Подготовка раствора никотиновой кислоты: берут навеску 12,0 мкг никотиновой кислоты, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильной никотиновой кислоты асептически добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

г) Бульон для энтеротоксигенных стафилококков HiMedia, Casein Hydrolysate Broth. Бульон используют для культивирования стафилококков с целью получения энтеротоксина, используемого в пробе на котятах и в серологических исследованиях.

Состав, г/л:
Гидролизат казеина кислотный — 20,0
Железа цитрат — 0,025
Калия дигидроортофосфат — 2,0
Магния сульфат — 0,20
L-цистин — 0,025
Натрия ацетат — 7,0
L-триптофан — 0,075
Кальция пантотенат — 0,0005
Тиамин — 0,00004
Никотиновая кислота — 0,0012
pH 7,3±0,2

Навеску среды 29,33 г вносят в 1000,0 мл дистиллированной воды. Тщательно размешивают. Подогревают (при частом помешивании) и кипятят 1 мин для полного растворения. Устанавливают pH. Разливают в соответствующие емкости. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин.

Полученные фильтраты тестируют на присутствие α- и β-гемолизинов. В случае положительного результата токсин денатурируют прогреванием или нейтрализуют иммунной сывороткой. После денатурации фильтраты можно вводить котятам и наблюдать за появлением рвоты.

Этот бульон можно использовать для приготовления плотной среды, если добавить в его состав агар. Культуры, выращенные на таком агаре, можно применять и для заражения других животных, и для исследования в системе антиген-антитело методом диффузии.

Готовая среда янтарной окраски, прозрачна или опалесцирует.

д) Бульон для получения и очистки токсина синдрома токсического шока (ТСТШ).

Состав:
Бактопентон Difco — 6,0 г
Никотиновая кислота — 1,0 мг
Солянокислый тиамин — 5,0 мг

Бактопептон Difco растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды, устанавливают pH6,5 и проводят стерилизацию в течение 15 мин при 121°С. Никотиновую кислоту и солянокислый тиамин добавляют асептически в среду перед посевом. Предварительно берут 10,0 мг никотиновой кислоты, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл добавляют к 100,0 мл среды перед посевом.

Раствор солянокислого тиамина готовят следующим образом: берут 50,0 мг солянокислого тиамина, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, затем стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и асептически добавляют 1,0 мл к 100,0 мл основной среды.

е) Солевой бульон для обогащения материала, исследуемого на энтеротоксигенные стафилококки. К 100,0 мл мясопептонного бульона (МПБ) с pH 7,3 добавляют 6,5 г хлористого натрия и разливают в пробирки по 10,0 мл, стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 20 мин.

ж) Среда Фогель-Джонсона, плотная среда для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптиказа — 1,0 г
Дрожжевой экстракт — 0,5 г
Глицин — 1,0 г
Маннит — 1,0 г
Хлористый литий — 0,5 г
Двузамещенный фосфат катия K₂HPO₄*3H₂O — 0,5 г
Теллурит калия (1% раствор) — 2,0 мл
Феноловый красный — 0,0025 г
Агар — 1,6 г
Дистиллированная вода — 100,0 мл

Навески триптиказы, дрожжевого экстракта, глицина, маннита, хлористого лития, двузамещенного фосфата калия, фенолового красного и агара растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды.

Устанавливают pH 7,2 и стерилизуют в автоклаве при 121°С 20 мин. Теллурит калия добавляют асептически в остуженную среду до 45°С перед посевом. Среду разливают в чашки Петри.

з) Теллурит-полимиксин-желточный агар (г/100 мл) для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптон — 1,1 г
Дрожжевой экстракт — 0,55 г
Маннит — 0,55 г
Хлорид натрия NaCl — 2,2 г
Теллурит калия (1%-ный раствор) — 1,0 мл
Желток яйца (в 50 мл физиологического раствора) — 10,0 мл
Полимиксинсульфат (1%-ный раствор) — 0,04 мл
Агар — 2,0 г

Навески триптона, дрожжевого экстракта, маннита, хлористого натрия и агар добавляют в колбу с 100,0 мл дистиллированной воды, доводят до кипения.

Устанавливают pH среды 7,2 и стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 мин. В остуженную до 45°С среду асептически вносят раствор теллурита калия, взвесь желтка куриного яйца и полимиксин, после чего среду разливают в чашки Петри по 25,0 мл. Выросшие колонии стафилококка имеют черный цвет.

з) Среда Baird-Parker (г/100,0 мл) для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптон — 1,0 г
Мясной экстракт — 0,5 г
Дрожжевой экстракт — 0,1 г
Глицин — 1,2 г
Пируват натрия — 1,0 г
Хлористый литий — 0,5 г
Теллурит калия (2,0%-ный раствор) — 0,5 мл
Желток яйца — 5,0 мл
Агар — 2,0
Вода дистиллированная — 100,0 мл

Все навески (кроме раствора теллурита и желтка) размешивают в 100,0 мл дистиллированной воды. Смесь нагревают при перемешивании и кипятят в течение 1 мин до полного расплавления ингредиентов. Устанавливают pH 7,1 и стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Основа среды может храниться в холодильнике в течение 1 мес. Перед употреблением в расплавленную и охлажденную до 45°С основу, соблюдая правила асептики, прибавляют из расчета на 100,0 мл среды 0,5 мл 2%-ного раствора теллурита калия и 0,5 мл эмульсии яичного желтка.

Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри в объеме не менее 20,0 мл на чашку. Чашки со средой могут быть использованы в течение 24-28 ч. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате общепринятым способом.

Выросшие колонии S. aureus имеют черный цвет (за счет восстановления теллура) с зонами просветления и опалесценции (за счет лецитиназы).

и) Основа дифференцирующего агара (с плазмой) для стафилококков HiMedia, Coagulase Mannitol Agar Base. Среду с добавкой плазмы используют для выделения и дифференциации Staphylococcus spp. из патологического материала и для идентификации чистых культур S.aureus по способности коагулировать плазму и ферментировать маннит.

Состав, г/л:
Настой мозга и сердца — 5,0
Гидролизат казеина ферментативный — 10,5
Перевар соевой муки папаиновый — 3,5
Натрия хлорид — 3,5
Маннит — 10,0
Бромкрезоловый пурпурный — 0,02
Агар — 14,5
pH 7,4±0,2

Размешивают 47,0 г среды в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения частиц. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Охлаждают до 45-50°С и асептически добавляют до 7-15% (об.) стерильную предварительно проверенную плазму. Тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

В случае ферментации маннита среда вокруг колонии закисляется, и индикатор бромкрезоловый пурпурный окрашивается в желтый цвет. Если микроорганизмы коагулируют плазму, вокруг их колоний образуется непрозрачная зона. Коагулазоотрицательными видами стафилококка маннит может ферментироваться с образованием желтой зоны, но она не будет мутной.

Готовая среда имеет лиловую окраску, слегка опалесцирует.

к) Среда для выявления термостабильной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) у энтеротоксигенных стафилококков. ДНКаза определяется по методу, основанному на метахроматических свойствах толуидина голубого.

К 1000,0 мл 0,05 М трис-буфера (оксиметиламинометан), pH 9,0, добавляют 0,3 г ДНК, затем 10,0 г агара Difco, 1 мл 0,01 М раствора CaCl₂, 10,0 г хлористого натрия, 3,0 мл 0,1 М раствора толуидина голубого. Среду разливают в пробирки по 12-15 мл, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике до 3-5 мес.

Перед постановкой реакции среду растапливают и разливают в чашки Петри, подсушивают при 37°С в течение 1 ч, стерильно вырезают лунки диаметром 3 мм, отсасывают пипеткой агар и вносят в лунки пастеровской пипеткой взвеси испытуемых культур.

Для этого пробирки с суточным ростом испытуемых культур стафилококков на полужидком питательном агаре прогревают в кипящей водяной бане 15 мин и вносят в лунки в агаровой пластинке, содержащей ДНК и толлуидин голубой инкубируют при 37°С. В результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНКазой стафилококков, образуются зоны просветления с розовым окрашиванием. Появление через 1-2 ч зон, окрашенных в розовый цвет, расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНКазы.

л) Молочно-солевой агар С.Л. Петрович (для определения каротиноидного пигмента стафилококков). К расплавленному мясопептонному агару с pH 7,2±0,2, содержащему 5-7,5% натрия хлорида, добавляют ex tempore 10% стерильного теплого молока, хорошо обезжиренного, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Данная хромогенная среда рекомендуется для выделения и идентификации стафилококков из объектов внешней среды.

Рост на среде HiCrome Aureus Agar Base (M1468)
S. aureus (черные)

Состав*:

Конечное значение рН (при 25°С) 7,0 ± 0.2
*Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 63,1 г порошка в 950 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 50°С. Асептически добавить 50 мл желтково-теллуритового концентрата ( FD046 ). Тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри.

Предупреждение: Хлорид лития ядовит, поэтому следует избегать контакта с ним и вдыхания его паров. При попадании на кожу обильно промыть ее водой.

Принцип и оценка результата:

Данная хромогенная среда рекомендуется для выделения и подсчета коагулазоположительных Staphylococcus aureus в объектах внешней среды. Ферментативный гидролизат казеина, панкреатический перевар желатина, говяжий и дрожжевой экстракты являются источником питательных веществ для роста бактерий. Пируват натрия предохраняет поврежденные клетки, помогая выделению и улучшая рост стафилококков. Хлорид лития и теллурит калия подавляют рост большинства сопутствующих микроорганизмов, за исключением S. aureus (1). Ввиду присутствия яичного желтка протеолитические бактерии формируют на данной среде прозрачную зону вокруг колоний (1). Коагулазоположительные S. aureus образуют на данной среде коричнево-черные колонии с прозрачной зоной вокруг, а Staphylococcus epidermidis – коричневатые. Благодаря присутствию хромогенной смеси, другие микроорганизмы формируют либо бесцветные, либо голубоватые колонии. У Listeria monocytogens колонии голубоватые, а у Bacillus spp., E. coli и Micrococcus spp. - бесцветные.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный порошок желтого цвета.

Плотность готовой среды:

По плотности соответствует 2,0 % агаровому гелю.

Цвет и прозрачность готовой среды:

В чашках Петри формируется прозрачный или слегка опалесцирующий гель светло-янтарного цвета, при добавлении яичного желтка и теллурита калия ( FD046 ) – желтый непрозрачный гель.

Данную основу с добавками используют для выделения и идентификации клинически значимых бацилл и стафилококков.

Рост Bacillus cereus на среде MYP Agar (M636), вид колоний на черном фоне.

Состав**:

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 46,0 г порошка М636 или 43,0 г порошка М1139 в 900 мл дистиллированной воды. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 55°С и асептично добавить стерильный раствор полимиксина В сульфата ( FD003 ) до конечной концентрации 100 ЕД/мл и 100 мл стерильной эмульсии яичного желтка ( FD045 ) на каждые 1000 мл среды. Тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри.

Принцип и оценка результата:

Эта среда предложена Mossel и соавт. (1) и рекомендована специалистами АРНА (2) для подсчета Bacillus cereus. Эти микроорганизмы могут попадать, например, от персонала в пищевые продукты при их изготовлении и вызывать пищевые отравления (3). Модифицированная среда отличается меньшей концентрацией агар-агара. Международный комитет ISO (4) рекомендовал использовать модифицированную среду (М1139) для определения стафилококков и бацилл.

Среда содержит пептический перевар животной ткани и мясной экстракт, которые служат источником углерода, азота, минеральных веществ, витаминов В и других важных факторов роста данных бактерий. Маннит служит ферментируемым углеводом. Кислые продукты ферментации маннита изменяют цвет фенолового красного и соответствующие колонии окрашиваются в желтый цвет. Включение в состав среды яичного желтка позволяет определить лецитиназную активность: в присутствии лецитиназы вокруг соответствующих колоний формируется зона белого преципитата. Полимиксин В подавляет рост таких грамотрицательных бактерий, как кишечная и синегнойная палочки. Такая среда позволяет дифференцировать Bacillus cereus от других бацилл по ферментации маннита и характеру спорообразования. Микроорганизмы, не относимые к Bacillus cereus, часто вызывают диффузное пожелтение среды при ферментации маннита, что мешает дифференцировать колонии по этому признаку. В этом случае рекомендуется проверить ферментацию маннита у чистой культуры на свежей среде.

Выросшие на данном агаре колонии отсевают на Питательный агар и инкубируют при 30°С в течение 24 ч с последующим определением морфологии вегетативных клеток, спор, липидных включений в вегетативных клетках.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий светло-розовый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному (М636) или 1,2%-ному (М1139) агаровому гелю .

Цвет и прозрачность готовой среды:

Основа среды имеет красную окраску, прозрачна или слегка опалесцирует. После добавления эмульсии желтка среда становится оранжевого цвета, непрозрачна, если в чашках Петри формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водные растворы М636 (4,6% вес/об) или М1139 (4,3% вес/об) имеют рН 7,1 ± 0,2.

Рост Bacillus cereus на среде MYP Agar (M636), вид колоний на черном фоне.

Состав**:

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Принцип и оценка результата:

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий светло-розовый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному (М636) или 1,2%-ному (М1139) агаровому гелю .

Цвет и прозрачность готовой среды:

Кислотность среды:

При 25°С водные растворы М636 (4,6% вес/об) или М1139 (4,3% вес/об) имеют рН 7,1 ± 0,2.

Читайте также: