Отбор проб при бешенстве
Обновлено: 25.04.2024
1. Отбор патологического материала для диагностики бешенства
2. Отбор патологического материала
Наблюдение за животными -10 дней
(заграницей 14-15 дней)
При необходимости убоя – выстрел в сердце
Нельзя стрелять в голову и использовать яд!
2
3. Патологический материал
4. Патологический материал
• Головной мозг – диагностика бешенства,
изучение молекулярно-биологических свойств
вируса бешенства
• Кровь – оценка эффективности
антирабической иммунизации
• Нижняя челюсть – оценка поедаемости
оральных антирабических вакцин
4
5. Отбор патологического материала
6. Инструменты, защитная одежда, материалы
7. Отбор проб головного мозга
8. Вскрытие черепной коробки
Череп животного
семейства собачьих
(вид сверху)
2 – продольный
распил от лобной
кости (по наружному
сагиттальному
гребню) до большого
затылочного
отверстия, глубина
0,3-0,5 см;
3 – поперечный
распил за глазницами
на глубину 0,5-1,5 см.
9. Вскрытие черепной коробки
Косой распил (4) проходит через теменную, височную кости и мыщелок,
соединяя край поперечного распила (3) и большое затылочное отверстие и
может в ряде случаев заменять продольный распил
10. Продольный распил
11. Поперечный распил
12. Удаление костей черепа
13. Удаление костей черепа
14. Извлечение головного мозга
15. Извлеченный мозг
16. Усовершенствованный способ отбора проб головного мозга
Существующие нормы РФ:
Вскрытие черепной коробки, извлечение головного
мозга целиком, исследование препаратов из
продолговатого мозга мозжечка, аммонова рога,
коры больших полушарий.
Международные нормы:
Вскрытие черепной коробки целиком (при
наличие условий и опытного персонала), а
также отбор проб через затылочное
отверстие или ретроорбитальным
способом.
17. Усовершенствованный способ отбора проб головного мозга (отбор через затылочное отверстие)
18. ОТБОР ПРОБ ГОЛОВНОГО МОЗГА С ПОМОЩЬЮ ТРОАКАРА РЕТРООРБИТАЛЬНЫМ СПОСОБОМ
Работу проводит один специалист. Голову животного
кладут на эмалированную кювету. При поступлении трупа
целиком голову можно не отделять.
Троакар вместе с гильзой вводят в глазное отверстие,
отодвинув глазное яблоко вниз или в сторону. Вращая
троакар и применяя умеренное усилие, делают прокол дна
глазницы. В прокол вводят гильзу троакара в направлении
затылочного отверстия, затем закрывают отверстие гильзы
резиновой пробкой или пальцем, извлекают гильзу и с
помощью стилета троакара выталкивают патологический
материал.
Полученную пробу головного мозга помещают в
стерильную стеклянную или пластиковую тару, которую
герметично закрывают. Пробу подвергают заморозке при 200С
19. Консервирование патматериала (головной мозг)
Существующие нормы РФ:
Пересылка в замороженном, консервированном в
50% глицерине виде.
Международные нормы:
Пересылка по возможности в замороженном виде,
в случае невозможности этого – в охлажденном
виде в 50% глицерине, в крайнем случае
допускается консервирование 10% формалином
(современные
методы
РИФ,
ИФА,
ПЦР,
иммуногистохимия,
позволяют
проводить
исследование такого материала).
20. Отбор проб крови
Аппаратура, материалы и реактивы
1. Перчатки резиновые анатомические;
2. Нож ампутационный;
3. Капроновые или шелковые нитки для наложения
лигатур на сосуды сердца;
4. Одноразовые шприцы объемом 5 мл;
5. Флаконы пластмассовые на 10 мл с крышками;
6. Сумка-холодильник или её аналоги;
Условия хранения крови, сыворотки крови, трупной жидкости в
лаборатории – минус 20оС
21. Наложение лигатур на сосуды сердца
22. Отбор проб крови у диких животных
23. Отбор проб крови у домашних животных
• Отбирают кровь в объеме 2 мл
• Выдерживают кровь при 37оС в течение 0,5 часа
• Осторожно обводят сгусток спицей по стенке и
помещают в холодильник при 4-8оС минимум на
0,5 часа
• Отделившуюся сыворотку центрифугируют в
течение 15 минут при 3000 об/мин (при
необходимости центрифугирование можно
повторить)
• При хранении сыворотки крови более 24 часов
ее замораживают
24. Отбор проб крови у домашних животных
25. Отделение ветви нижней челюсти с зубами
Для оценки поедаемости брикетов оральной
вакцины методом выявления флуоресценции
тетрациклина в зубной ткани.
26. Отделение нижней челюсти
27. Отбор проб костной ткани
28. Правила транспортировки патологического материала для исследований на бешенство
Пробы помещают в герметичную
стеклянную или пластиковую тару, которую, в
свою очередь, помещают в металлический
контейнер. В контейнер помещают
сопроводительное письмо и опись проб,
заверенные руководителем учреждения,
направляющего материал для проведения
исследований. Контейнер помещают в
термоконтейнер с хладагентами или с системой
принудительного охлаждения, опечатывают и
направляют для проведения исследований.
35. Меры безопасности
Факторы риска:
1. Травмирование кожных покровов:
- острые костные обломки
- режущие, колющие инструменты
2. Попадание твердых и жидких элементов
(брызги, аэрозоль) патологического материала
в глаза, на слизистые оболочки.
36. Меры безопасности
Меры предупреждения инфицирования:
1. Обязательная профилактическая вакцинация
2. Проведение процедуры вскрытия и отбора
патологического материала 2-мя специалистами
3. Использование специальной одежды (халат, чепчик,
прорезиненный фартук, нарукавники)
4. Использование индивидуальных средств защиты
( очки, защитная маска на лицо, ватно-марлевая
повязка, перчатки, устойчивые к факторам
механического повреждения)
37. Меры безопасности
Дезинфицирующие вещества:
- четвертичный
аммоний в концентрации 1:500
- 45-70% этиловый спирт
- l % мыльный раствор
(горячий раствор мыла,
детергента, стирального порошка может использоваться для
мытья поверхностей, полов)
- 5-7% йодный раствор
Указанные растворы убивают вирус бешенства в
течение 1 минуты и могут применяться для
обработки ран.
38. Меры безопасности
Утилизация потенциально-опасных материалов:
-Стеклянная и пластиковая посуда, инструменты –
замачивание в растворе дезинфицирующего вещества (1% мыльная
вода) с последующим кипячением или автоклавированием
-Использованный дезинфицирующий раствор –
кипячение, автоклавирование
- Трупы и ткани животных – предпочтительно помещение в
полиэтиленовые мешки и кремирование
39. Меры безопасности
Обработка ран
- Все раны немедленно и тщательно промыть
мылом и водой в течение нескольких минут
- Колотые раны обработать дезинфицирующим
веществом
- Как можно быстрее обратиться в медицинское
учреждение за антирабической помощью
1.1. Настоящие методические указания предназначены для патологоанатомов и судебно-медицинских экспертов, а также для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих лабораторную диагностику погибших от гидрофобии (бешенства) лиц, а также общее руководство по отбору, упаковке, хранению и транспортированию секционных материалов.
1.2. В настоящих методических указаниях определены порядок отбора, упаковки, хранения и транспортирования биологического материала от умерших людей для проведения лабораторной диагностики заболевания, вызванного вирусом уличного бешенства.
- нештатная ситуация, при которой создается реальная или потенциальная возможность заражения персонала
- система медико-биологических, организационных и инженерно-технических мероприятий и средств, направленных на защиту работающего персонала, населения и окружающей среды от воздействия патогенных биологических агентов
- метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции
- метод полимеразной цепной реакции в реальном времени
В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативные документы:
Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. № 554.
WHO Expert consultation on rabies: First Report (2004: Geneva, Switzerland). WHO Technical Report Series 931. - 123 c.
Laboratory techniques in rabies. Fourth edition WHO, Geneva, 1996 г.
4.1. Забор материала от умерших с подозрением на инфекцию, вызванную вирусом уличного бешенства, и его упаковку проводит специально обученный персонал лечебно-профилактических организаций (ЛПО) в соответствии с требованиями действующих нормативных документов.
4.2. Доставка материала на исследование производится лечебно-профилактической организацией по согласованию с управлением Роспотребнадзора субъекта Российской Федерации с учетом требований биологической безопасности и оптимальной транспортной схемы в Центр специальной лабораторной диагностики и лечения особо опасных и экзотических инфекционных заболеваний Минобороны Российской Федерации.
4.3. Управление Роспотребнадзора субъекта Российской Федерации согласовывает с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека порядок доставки материала на исследование в Центр специальной лабораторной диагностики и лечения особо опасных и экзотических инфекционных заболеваний Минобороны Российской Федерации.
5.1. Отбор, упаковку и транспортирование секционного материала от лиц, предположительно погибших от гидрофобии (бешенства) осуществляет квалифицированный персонал, обученный правилам биологической безопасности и имеющий опыт патологоанатомического или судебно-медицинского исследования лиц, погибших от опасных и особо опасных инфекционных заболеваний, с соблюдением правил противоэпидемического режима в соответствии с СП 1.3.1285-03.
5.2. Во избежание заражения в процессе вскрытия необходимо соблюдать все меры предосторожности, включая тщательность препарирования и использование толстых резиновых перчаток.
5.3. Для исследования забирают следующие участки головного мозга:
• кора больших полушарий.
Исследованию подвергаются также слюнные железы.
Размер секционного материала 15 мм×15 мм.
5.4. Забор производят стерильными инструментами в стерильные одноразовые пластиковые флаконы с закручивающимися крышками (колбы, контейнеры), содержащие физиологический раствор, покрывающий взятый секционный материал.
5.5. От одного умершего от гидрофобии (бешенства) человека отбирают две пробы: одну пробу для исследования материала молекулярно-биологическими методами (ОТ-ПЦР или RT-ПЦР), вторую - для проведения вирусологического исследования. Вся работа по отбору проб должна проводиться в соответствии с требованиями биологической безопасности с соблюдением противоэпидемического режима.
5.6. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.
5.7. Отобранный секционный материал помещают в стерильные пластиковые флаконы (колбы, контейнеры), содержащие физиологический раствор и подвергают глубокой заморозке до минус (65 ± 5) °С (или в жидком азоте) либо до минус (20 ± 4) °С. В исключительном случае допускается помещение секционного материала вместе с глицерином в стерильные пластиковые флаконы (колбы, контейнеры) при температуре (6 ± 2) °С.
5.8. Запрещается помещать и хранить секционный биологический материал в формалине, а также в парафиновых блоках.
6.1. Отобранный секционный материал до упаковки образца для транспортирования может храниться при следующих условиях:
• при температуре минус (65 ± 5) °С (или в жидком азоте) - длительно;
• при температуре минус (20 ± 4) °С - в течение 30 суток с момента отбора материала;
• при температуре (6 ± 2) °С - не более 3 суток с момента отбора материала.
Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
6.2. Все образцы, доставляемые в диагностическую лабораторию, должны быть герметично упакованы в соответствии с действующими нормативно-методическими документами:
• в транспортную емкость (плотно закрывающиеся стерильные пластмассовые колбы либо флаконы (контейнеры) с завинчивающимися крышками, проверенные на герметичность); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, парафильм и др.); емкость маркируют;
• в плотный полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять.
6.2.1. В отдельный полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименование направляющего учреждения, ФИО больного, возраст, место жительства, предварительный диагноз, эпидемиологический анамнез, вид материала, дата и время взятия материала.
6.2.2. Пакеты с образцами от одного пациента вместе с направлением упаковывают во второй плотный полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывание образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.
7.1. Перед непосредственным транспортированием герметично закрытые полиэтиленовые пакеты достают из низкотемпературного холодильника и помещают в термоизолирующий плотно закрывающийся контейнер (термос либо сумка-холодильник), приспособленный для транспортирования биологических материалов.
7.1.1. Охлаждающие элементы перед транспортированием секционного материала необходимо замораживать при температуре минус (65 ± 5) °С в течение (6 ± 2) часов, а при температуре минус (20 ± 4) °С - в течение (20 ± 2) часов.
7.1.2. В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения. Сроки и условия транспортирования упакованных проб клинического материала указаны в приложении.
7.2. Транспортирование секционного материала в диагностическую лабораторию осуществляется нарочным(и), информированным о правилах доставки материала в соответствии с п. 3.4 СП 1.2.036-95.
8.1. Вскрытие проводят в дополнительном комплекте специальной одежды, включающим: противочумный комплект, фартук, защитные очки или защитный щиток, средства индивидуальной защиты органов дыхания (респиратор типа ШБ-1 или РБ, Лепесток-200), двойные резиновые перчатки. После процедуры отбора материала перчатки обрабатываются растворами дезинфицирующих средств, руки после снятия перчаток обрабатываются антисептиками.
8.2. Лечебно-профилактические организации, осуществляющие патологоанатомическое исследование лиц, предположительно погибших от гидрофобии (бешенства), должны быть оборудованы аптечкой, укомплектованной в соответствии с СП 1.3.1285-03, и дополненной антирабической вакциной и антирабическим иммуноглобулином.
8.3. Режимы обеззараживания различных объектов (медицинских инструментов и др.) соблюдаются в соответствии с СП 1.3.1285-03.
8.4. Обеззараживание поверхностей помещения (пол, стены, двери), оборудования, рабочих столов и др. проводится двукратным протиранием с интервалом в 15 мин 6 %-м раствором перекиси водорода либо любым дезинфицирующим средством, обладающим вирулицидной активностью, с последующей обработкой ультрафиолетом в течение 60 мин.
8.5. Каждая нештатная ситуация (авария) регистрируется в журнале аварийных ситуаций, где отмечается: дата, время, место, характер аварии, локализация травмы или контакт, фамилия, имя и отчество лиц, имевших контакт с вирусом уличного бешенства.
В качестве секционного материала используются ткани мозга: аммонов рог, мозжечок, кора больших полушарий; слюнные железы. Секционный материал собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы (колбы, контейнеры) с завинчивающимися крышками объемом 50 - 100 мл
Условия хранения материала
При температуре минус (65 ± 5) °С (или в жидком азоте) - длительно.
При температуре минус (20 ± 4) °С - 30 суток.
При температуре (6 ± 2) °С - не более 3 суток с момента отбора материала.
Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Не допускается хранение материала в формалине и парафиновых блоках
Условия транспортирования материала
В термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре:
Текст ГОСТ 25753-83 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики болезни Ауески
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ
ГОСТ 25753-83 (СТ СЭВ 3454-81)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ
Л. В. Селиванов, Э. М. Прохорова, Т. И. Малахова
ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР
Член Коллегии Л. Д. Третьяков
УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2016
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ Методы лабораторной диагностики болезни Ауески
Agricultural animals. Methods of laboratory diagnostics for Morbus Aujeski
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2016 срок действия установлен
с 01.07.84 до 01.07.89
Несоблюдение стандарта преследуется по закону
Настоящий стандарт распространяется на крупный рогатый скот, овец, свиней и других животных (пушных зверей, собак и кошек), невакцинированных живыми вакцинами, и устанавливает методы лабораторной диагностики болезни Ауески.
Стандарт применяют при диагностировании заболевания животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3454—81.
1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ
1.1. Для проведения биологической пробы и выделения вируса патологический материал берут от животных в период максимального проявления клинических признаков болезни (температурная реакция, угнетение, нервная клиника, зуд, расчесы). От вынужденно убитых и павших животных патологический материал должен быть взят и исследован в летнее время в течение 6 ч, а при условии хранения его в охлажденном состоянии в течение 10—12 ч.
1.2. В лабораторию доставляют больных животных, трупы животных или кусочки тканей и органов (головного и спинного мозга, легких, печени, селезенки, лимфатических узлов, миндалин) , от абортировавших животных — плоды и плаценту.
1.3. Для серологического исследования пробы крови от исследуемых животных берут в стерильные пробирки в количестве не менее 5 см 3 .
Перепечатка воспрещена © Издательство стандартов, 1983
Сыворотку получают методом отстоя и хранят ее до 10 сут при температуре плюс 4°С. Допускается более длительное хранение сыворотки при температуре минус 20°С. Сыворотка должна быть прозрачной без признаков гемолиза.
1.4. Патологический материал доставляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают наименование хозяйства, вид и возраст животного, эпизоотические данные, клиническую и патолого-анатомическую картину, сведения о проведении иммунизации животных и применяемой вакцине.
2. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ
Сущность метода заключается в воспроизведении заболевания у здоровых кроликов путем инокуляции патологического материала.
2.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения испытания применяют:
центрифугу с частотой вращения не менее 3000 об/мин;
термостат с температурой нагрева 37 °С;
пробирки стеклянные по ГОСТ 25336—82;
пипетки мерные по ГОСТ 20292—74;
шприцы вместимостью 1 или 2 см 3 ;
чашки Петри до ГОСТ 25336—82;
раствор физиологический стерильный, рН = 7,2;
раствор солевой буферный стерильный, pH = 7,2;
антибиотики широкого спектра действия.
2.2. Подготовка к исследованию
2.3. Проведение исследования
Для проведения биологической пробы используют кроликов массой 2—2,5 кг. Надосадочную жидкость, приготовленную по п. 2.2, вводят двум кроликам внутримышечно в дозе 1—2 см 3 .
2.4. Обработка результатов
Биопробу считают положительной, если животные погибают с клиническими признаками болезни Ауески (нервная клиника, зуд, расчесы) через 2—10 сут после инокулирования суспензии патологического материала. Если животные погибают без призна
ков болезни Ауески, биопробу повторяют, используя патологический материал первого пассажа*
Гибель кроликов после введения суспензии патологического материала от свиней без признаков зуда и расчесов может свидетельствовать о выделении вакцинных штаммов вируса болезни Ауески.
Гибель кроликов после введения суспензии патологического материала от пушных зверей без (признаков зуда и расчесов может свидетельствовать о выделении вакцинных штаммов вируса болезни Ауески, патогенных для пушных зверей.
Для идентификации вируса проводят выделение вируса в культуре клеток с последующей постановкой реакции нейтрализации.
3. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСА В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК
Сущность метода заключается в выявлении цитопатического действия (ЦПД) вируса в культуре клеток и его последующей идентификации.
3.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения исследования применяют: термостат с температурой нагрева 37 °С; центрифугу с частотой вращения не менее 3000 об/мин; весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,01 г;
шкаф сушильный; микроскоп любой марки; холодильники; баню водяную;
аппарат для трипсинизации тканей; пипетки мерные по ГОСТ 20292—74; пробирки стеклянные по ГОСТ 25336—82; чашки Петри по ГОСТ 25336—82; фильтры стерилизующие разных размеров; раствор солевой буферный стерильный, pH = 7,2; среды ростовую питательную и поддерживающую; раствор трипсина;
соду двууглекислую по ГОСТ 4201—79;
сыворотку крупного рогатого скота для культуры клеток; антибиотики и препараты микостатические; феноловый красный по ГОСТ 4599—73; раствор трипана голубого;
вирус болезни Ауески с титром не ниже 10 4 ТЦДзо/см 3 ;
сыворотку животных, не содержащую антител к вирусу болезни Ауески (отрицательную);
сыворотку специфическую гипериммунную против болезни Ауески (положительную).
3.2. Подготовка к исследованию — по п. 2.2.
3.3. Проведение исследования
В пробирки с культурой клеток вносят по 0,2 см 3 каждого испытуемого материала. Для каждой пробы используют 4—6 пробирок. Пробирки с зараженной культурой клеток выдерживают в термостате при 37 °С в течение 30 мин. Затем из пробирок с культурой клеток удаляют надосадочную жидкость и добавляют 1,8 см 3 поддерживающей питательной среды, содержащей антибиотики.
В контроле используют 4—б пробирок с незараженной культурой клеток, в которой проводят смену питательной среды. Пробирки с зараженной культурой клеток и контрольные инкубируют при температуре 37 °С в течение 2—5 сут и ежедневно микроскопируют для учета цитопатических изменений. При появлении цитопатичеоких изменений культуральную жидкость из каждой пробирки объединяют и производят идентификацию выделенного вируса. Если испытуемый материал токсичен для клеток или невозможно определить специфичность ЦПД, проводят дополнительный пассаж.
3.4. Обработка результатов
Результат исследования испытуемого материала считают положительным, если в культуре клеток обнаруживается цитопатоген-ное действие вируса, которое проявляется в округлении клеток, появлении гигантских клеток и клеточном лизисе с отпадением пораженных клеток от стекла.
В контрольных культурах (незараженных) не должно быть цитопатических изменений.
По результатам вирусологического исследования болезнь Ауески диагностируют, если видовая принадлежность выделенного вируса в культуре клеток подтверждена в реакции нейтрализации (метод идентификации вируса).
4. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА
Сущность метода заключается в обнаружении подавления цитопатического действия вируса в культуре клеток с помощью положительной сыворотки.
4.1. Аппаратура, материалы и реактивы — по п. 3.1.
4.2. Проведение исследования
Перед постановкой реакции нейтрализации положительную и отрицательную сыворотки разбавляют в соотношении 1:10 питательной средой для культуры клеток, содержащей антибиотики, и прогревают в водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин. В два ряда пробирок (по 7 шт.) вносят по 2 см 3 сыворотки в каждую пробирку: в первый ряд — положительную, во второй—отрицательную.
Готовят десятикратные разведения испытуемого вируса от 10" 1 до 10~ 5 * 7 на питательной среде для культуры клеток в объемах, достаточных для постановки реакции, и вносят в два ряда пробирок с сыворотками, начиная с разведения 10 -7 , в объеме по 2 см 3 на пробирку. Пробирки со смесью разведений вируса и сыворотки встряхивают и выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 1 ч. Затем каждую смесь сыворотки с разведениями вируса вносят по 1 см 3 в 4 пробирки с культурой клеток. Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37 °С.
4.3. Обработка результатов
Результаты реакции учитывают по цитопатическому действию вируса через 2—5 сут. Для этого определяют титр исследуемого вируса в присутствии положительной и отрицательной сывороток и выражают его в логарифмах ТЦД5э/счз. Титр вычисляют по методу Рида и Менча. Видовую принадлежность вируса устанавливают при наличии разности в титрах вируса с отрицательной и положительной сыворотками не менее чем на два логарифма.
5. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ
Сущность метода заключается в специфическом свойстве нейтрализующих антител сыворотки крови подавлять способность вируса вызывать цитопатическое действие в культуре клеток.
5.1. Аппаратура, материалы и реактив ы—по п. 3.1.
5.2. Подготовка к исследованию
Для групповой диагностики исследуют пробы сывороток в разведениях 1:2 или 1:4 в культуре клеток против 1000 ТЦД50/0,1 см* вируса. Для контроля благополучного стада допускается исследование смеси сывороток от пяти животных. Для подтверждения положительного диагноза сыворотки исследуют в разведениях от 1 : 2 до 1:16.
Испытуемые сыворотки выдерживают в водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин.
5.3. Проведение исследования
Готовят двукратные разведения испытуемых сывороток от 1:2 до 1 : 16 на питательной среде для культуры клеток с анти-
биотиками. Затем готовят необходимый объем вируса, содержащего 1000 ТЦД5о/о,1 см з и добавляют равный объем его в каждую пробирку с последовательными разведениями сывороток. Смесь сывороток и вируса встряхивают, выдерживают при температуре 37 °С в течение 1 ч, после чего в 4 пробирки с культурой клеток вносят по 0,2 см 3 смеси сыворотки и вируса и выдерживают при температуре 37°С ! в течение 30 мин. По истечении указанного срока в пробирки с культурой клеток вносят по 1,8 см 3 поддерживающей питательной среды. Одновременно ставят следующие контролп:
контроль незараженных культур клеток в 3—4 пробирках, в которых проводят смену питательной среды;
контроль дозы вируса. Для контроля точности дозы вируса, взятой в реакцию, из рабочего разведения вируса (1000 ТЦДбо/олсм 3 ) готовят разведения до 10~ 4 . Для каждого разведения вируса используют 3—4 пробирки с культурой клеток. В пробирки с культурой клеток вносят рабочее разведение вируса и последовательные его разведения в объеме по 0,1 см 3 . После контакта при температуре 37°С в течение 30 мин в пробирки с культурой клеток добавляют 1,9 см 3 поддерживающей питательной среды;
контроль токсичности сыворотки. Для определения токсичности сыворотки в пробирочные культуры вносят по ОД см 3 разведения сыворотки и по 1,9 см 3 поддерживающей питательной среды (по 3—4 пробирки с культурой клеток на каждое разведение сыворотки);
контроль специфичности вируса. Пробирки с культурой клеток инфицируют смесью вируса в рабочей дозе с двукратным разведением специфической сыворотки до ее титра (по 3—4 пробирки с культурой клеток для смеси каждого разведения специфической сыворотки + вирус).
Все пробирки с культурами клеток, используемые в' реакции, инкубируют при температуре 37 °С.
Проводят ежедневный микроскопический контроль клеточных культур. Учет реакции проводят при появлении цитопати-ческого действия вируса в контроле дозы вируса, взятой для реакции нейтрализации.
5.4. Обработка результатов
Результат серологического исследования испытуемых сывороток считают положительным при отсутствии цитопатического действия в разведениях сыворотки 1 : 2 и выше при наличии следующих результатов в контролях:
в контроле культуры клеток не должно быть изменений монослоя клеток;
в контроле дозы вируса цитопатическое действие должно быть в рабочем разведении вируса и в разведениях 10 -1 , 10~ 2 , 10 _3 и 10~ 4 (в последнем разведении не менее двух пробирок);
в контроле токсичности сывороток в случае положительной сыворотки (переболевшее животное) отсутствует дитопатический эффект, начиная с разведения сыворотки 1:2; при отрицательной сыворотке (отсутствуют специфические антитела) должен быть дитопатический эффект, как и в культурах с контролем дозы вируса (рабочее разведение);
в контроле специфичности вируса отсутствует цитопатический эффект в культурах, инокулированных смесью специфической сыворотки и вируса.
Наличие специфических антител в испытуемых сыворотках крови свидетельствует об инфицировании данной особи, группы животных возбудителем болезни Ауески или возможной вакцинации животных против болезни Ауески.
Положительный результат серологического метода исследования сывороток крови невакцинированных животных свидетельствует о подозрении на заболевание, которое подтверждают постановкой биологической пробы.
Редактор Н. Е. Шестакова Технический редактор Н. П. Замолодчикоза.
Корректор Е. И. Евтеева
Сдано в наб. 06.05.83 Подп. в печ. 07.06.83 0,625 п. л. 0,48 уч.-изд. л. Тир. 6000 Цена 3 коп.
Текст ГОСТ 26075-84 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА
ГОСТ 26075—84 (СТ СЭВ 3452-81)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ
Б. И. Антонов, Л. П. Каменева
ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР
Зам. начальника Главного управления ветеринарии П. П. Рахманин
УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государств венного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 48
УДК 636:576.8.07:006.354 Группа С79
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ Методы лабораторной диагностики бешенства
Methods of laboratory diagnostics of rabies
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 48 срок действия установлен
с 01.07.84 до 01.07.89
Несоблюдение стандарта преследуется по закону
Настоящий стандарт распространяется на все виды животных и устанавливает методы лабораторной диагностики заболевания бешенством, вызываемого рабдовирусом.
Стандарт применяют при диагностике заболевания животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений, республиканских и областных ветеринарных лабораториях
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3452—81.
1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ
1.1. Для проведения исследований на бешенство в лабораторию направляют свежие трупы мелких животных целикам, от крупных животных — головной мозг.
Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30—50%-ном растворе глицерина,
1.2. Отобранный для исследования патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и в металлических контейнерах доставляют в лабораторию.
1.3. Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные:
наименование и адрес отправителя;
анамнестические и клинико-эпизоотологические данные.
Издание официальное Перепечатка воспрещена
© Издательство стандартов, 1984
2. МЕТОД ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
2.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы
Термостат с температурой нагрева 37°С.
Стекла предметные по ГОСТ 9284—75.
Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336—82.
Чашки Петри по ГОСТ 25336—82.
Пипетки мерные по ГОСТ 20292—74.
Набор инструментов для вскрытия черепной полости и извлечения головного мозга животных.
Пинцеты по ГОСТ 21241—77.
Горелка газовая или спиртовая.
Ацетон по ГОСТ 2603—7Э.
Диагностический иммуноглобулин флуоресцирующий антирабический (ДАФИ).
Масло нефлуоресцирующее иммерсионное по ГОСТ 13739—78.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.
Раствор фосфатный буферный, pH 7,4.
2.2. Подготовка к исследованию
2.2.1. Из каждого отдела головного мозга (аммонова рога, мозжечка, коры больших полушарий и продолговатого мозга) готовят по два препарата — мазка-отпечатка.
2.2.2. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при плюс 4 или минус 12°С в течение 4—12 ч. Затем препараты извлекают из ацетона, высушивают на воздухе 10—15 мин и помещают их во влажную камеру (чашки Петри с увлажненным дном).
2.2.3. Диагностический антирабический флуоресцирующий иммуноглобулин (ДАФИ) в рабочем разведении наносят равномерно на всю поверхность препарата при помощи пипетки (примерно-0,1 см 3 на один препарат) ( закрывают камеру с препаратами, помешают в термостат и выдерживают 30 мин при 37°С. Затем предметные стекла с препаратом троекратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд, наполненный фосфатным
буфером pH 7,4, промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
На окрашенные препараты наносят иммерсионное нефлуоресцирующее масло.
2.3. Проведение исследования
2*3.1. Подготовленные препараты просматривают под люминесцентным микроскопом с иммерсионной системой.
2.4. Обработка результатов
2.4.1. При положительных результатах исследования в препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, обнаруживают разной величины и формы ярко светящиеся желто-зеленым цветом гранулы в нейронах и вне клеток. Размер их колеблется от едва заметных в виде песчинок образований до 15—20 мм*
Не пораженная вирусом бешенства мозговая нервная ткань светится тусклым серовато-желтым или зеленоватым цветом.
3. МЕТОД ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
3.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы
3.1.1- Аппаратура, материалы, реактивы и растворы, указанные в п. 2.1, и дополнительно:
иммуноглобулин 5%-ный антирабический нефлуоресцирующий моноспецифический;
раствор физиологический нейтральный.
3.2. Подготовка к исследованию
3.2.1. На фиксированные препараты, приготовленные из исследуемых участков головного мозга, наносят пипеткой 5%-ный антирабический нефлуоресцирующий моноспецифический иммуноглобулин, выдерживают их в течение 30 мин во влажной камере в термостате при 37°С. Затем препараты промывают двукратно нейтральным физиологическим раствором и окрашивают антирабическим флуоресцирующим иммуноглобулином (ДАФИ) по п. 2.2.3.
3.3. Проведение исследования
3.3.1. Препараты просматривают под люминесцентным микроскопом с иммерсионной системой.
3.4. Обработка результатов
3.4.1. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, предварительно обработанных нефлуоресцирующим и затем флуо
ресцирующим иммуноглобулином, свечения не должно быть, а в препаратах, ранее обработанных только флуоресцирующим’ иммуноглобулином наблюдают специфическое свечение.
4. МЕТОД РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ
Этим методом допускается исследовать несвежий патологический материал, контаминированный бактериальный микрофлорой*
4.1. Аппаратура, материалы и реактивы Гермостат.
Осветитель для бактериологических работ.
Пипетки мерные и пастеровские по ГОСТ 20292—74.
Чашкр Петри по ГОСТ 25336—82.
Трубка металлическая тонкостенная диаметром 4—5 мм.
Перо писчее ученическое.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233—77.
Метиловый оранжевый, 1%-ный раствоор в 50%-ном этиловом спирте по ГОСТ 5962—67.
Диагностический иммуноглобулин антирабический.
Антиген отрицательный контрольный.
Антиген положительный контрольный.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.
Гель агаровый биофабричного изготовления или приготовленный по рецептуре:
1%-ный раствор метилового оранжевого в 50%-ном этиловом спирте —10 см 3 ,
мертиолят —0,01 г,
вода дистиллированная — 1000 см 3 .
Агаровый гель с pH 7,2—7,4 разливают в стерильную посуду, автоклавируют при 0,5 атм в течение 30 мин, хранят в холодильнике при 4°С.
42. Проведение исследования
4.2.1. Реакцию преципитации (РП) ставят на обезжиренных предметных стеклах, на которые предварительно наносят каплю расплавленного агара, пипеткой равномерно распределяя ее по стеклу, и делают тонкий мазок. На застывший слой агара наливают сверху 2,5 см 3 агарового геля толщиной приблизительно 2 мм.
После застывания агара делают в нем лунки металлической тонкостенной трубочкой диаметром 4—5,6 мм согласно трафарету. Агаровые столбики осторожно извлекают ученическим пером, не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля.
В РП исследуют от крупных животных (лошадей, крупного рогатого скота, собак, лисиц и др.) следующие части головного мозга—кору полушарий левой и правой сторон, аммоновы рога— левый и правый, мозжечок и продолговатый мозг. У мелких животных РП ставят с какими-либо тремя отделами мозга. От мышей исследуют весь головной мозг, который растирают в ступке или в самой черепной коробке в массу пастообразной консистенции.
Читайте также: