Реагенты для определения антител сифилиса

Обновлено: 13.05.2024

Разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости иммуноглобулинов класса G к Treponema pallidum методом иммунного блоттинга (формат Western blot)

Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2020;19(4): 465‑469

АКТУАЛЬНОСТЬ

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать набор реагентов для диагностики сифилиса методом иммунного блоттинга в формате Western blot с использованием нативных антигенов Treponema pallidum.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для приготовления иммуносорбента использован нативный лизат T. pallidum (штамм Nichols) собственного производства и коммерческие препараты, необходимые для электрофореза и электропереноса белков возбудителя на нитроцеллюлозную мембрану. Выбран оптимальный режим проведения этих процедур. Для оценки чувствительности и специфичности новой тест-системы использованы коммерческие панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к T. pallidum, а также клинические материалы — образцы сыворотки, плазмы крови, спинномозговой жидкости.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработана новая тест-система для оценки наличия в крови и спинномозговой жидкости антител класса G к отдельным антигенам T. pallidum методом иммунного блоттинга в формате Western blot, не уступающая по эффективности импортному аналогу.

Дата принятия в печать:

Введение

Согласно статистическим данным Роспотребнадзора [1] заболеваемость сифилисом в Российской Федерации имеет тенденцию к снижению. Несмотря на это, сифилис остается социально значимым заболеванием, требующим пристального внимания со стороны как лечащих врачей, так и специалистов лабораторной службы.

Спектр методов, применяемых в лабораторной диагностике сифилиса, довольно широк [2—4]. При обследовании разных групп пациентов применяются разные комбинации этих методов и различные алгоритмы лабораторной диагностики сифилиса, которые, помимо скрининговых, обязательно включают различные подтверждающие методы исследования [5— 7]. Наиболее эффективным подтверждающим методом в настоящее время считается иммунный блоттинг (ИБ) — выявление специфических антител к отдельным антигенам возбудителя. Из основных антигенов T. pallidum диагностически значимыми считаются TpN15, TpN17, TmpA и TpN47 с молекулярной массой 15, 17, 45 и 47 кДа соответственно [5, 8—12].

В практике отечественного здравоохранения широко применяются наборы реагентов для ИБ формата Line blot (лайн-блот, линейный иммуноблот), в которых используются рекомбинантные аналоги антигенов TpN15, TpN17, TmpA и TpN47 [13, 14]. В то же время опыт серологической диагностики инфекционной патологии показывает, что наиболее эффективными являются подтверждающие исследования с использованием как рекомбинантных аналогов, так и нативных антигенов возбудителей, т.е. применительно к ИБ его обоих форматов — Line blot и Western blot.

Цель исследования — разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости IgG к T. pallidum методом ИБ (формат Western blot).

Материал и методы

В процессе разработки использованы следующие основные материалы:

— белковый маркер молекулярной массы фирмы Bio-Rad (США);

— акриламид и бис-акриламид фирмы AppliChem (Германия);

— нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм фирмы Sartorius (Германия);

— конъюгат козьих антител к IgG человека с щелочной фосфатазой фирмы Jakson ImmunoResearch (США);

— субстратный раствор, содержащий 5-бром-1-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий фирмы Kem-En-Tec (Дания).

В работе применяли следующие методы:

2. Получение нативного лизата из культуральной массы. Полученный супернатант подвергали обработке ультразвуком, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в фосфатно-солевом буферном растворе.

3. Электрофорез нативного лизата T. pallidum в полиакриламидном геле (ПААГ) в восстановленных условиях с целью разделения белков в соответствии с их молекулярной массой проводили по методике, предложенной U.K. Laemmli [17].

4. Электроперенос (блоттинг) разделенных белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили с использованием оборудования фирмы Hoefer Scientific (США).

В качестве референсного материала при оценке чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали международный стандарт ВОЗ WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG фирмы NIBSC (Великобритания); сероконверсионную панель Syphilis Seroconversion Panel фирмы SeraCare (США) и смешанную панель Syphilis Mixed Titer AccuSet Performance Panel Modified фирмы SeraCare (США).

В качестве набора сравнения использовали набор реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG (Германия).

Результаты и обсуждение

При разработке новой тест-системы использован опыт разработки аналогичных наборов, в частности тест-системы для выявления IgG к цитомегаловирусу [18]. При этом отработаны оптимальные условия получения иммуносорбента, процедуры анализа, регистрации, учета и интерпретации полученных данных.

По результатам проведенных экспериментов выбраны следующие условия получения иммуносорбента:

1) ПААГ с концентрацией акриламида 16% и бис-акриламида 4%;

2) загрузка нативного лизата T. pallidum на поверхность ПААГ из расчета 2 мкг на 1 мм 2 ;

3) проведение электрофореза в течение 4 ч при температуре 7°С и меняющемся напряжении (250 В в начале процесса, 150 В через 1 ч от начала процесса и 100 В через 2 ч от начала процесса);

4) проведение электропереноса в течение 3 ч при температуре 15 °С и постоянном напряжении 100 В;

5) инкубирование мембран после электропереноса в течение 15 мин в трис-солевом буферном растворе с целью блокирования сайтов неспецифического связывания.

Анализ антигенного состава нативного лизата T. pallidum показал наличие в нем всех диагностически важных антигенов с молекулярными массами 47, 45, 17 и 15 кДа (см. рисунок).


Антигенный состав лизата T. pallidum.

1 — результат электрофоретического разделения белкового маркера молекулярной массы; 2 — результат исследования сыворотки, положительной по наличию IgG к T. pallidum, при инкубации с мембраной, на которую нанесены электрофоретические разделенные антигены нативного лизата T. pallidum и контрольная линия (анти-IgG).

В качестве оптимальной выбрана следующая процедура проведения анализа:

— разведение образца в буферном растворе 1:100;

— инкубация стрипов иммуносорбента с образцом в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— 3 промывки буферным раствором по 5 мин;

— инкубация стрипов иммуносорбента с конъюгатом в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— 3 промывки буферным раствором по 5 мин;

— инкубация с субстратным раствором в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре на шейкере-качалке;

— остановка реакции водой очищенной.

Итогом разработки стала тест-система ИФА-Блот-Сифилис-IgG следующего состава:

1) иммуносорбент — 24 полоски (стрипа) из нитроцеллюлозной мембраны с нанесенными на них методом электропереноса белками T. pallidum (антигены р47, р45, р17, р15) и контрольной линией (козьи антитела к IgG человека);

2) конъюгат — козьи антитела к IgG человека, меченные щелочной фосфатазой;

3) окрашивающий раствор — 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий;

4) 10-кратный концентрат трис-солевого буфера [ТСБ(×10)];

5) фотография референс-стрипа с проявленным белковым профилем антигенов T. pallidum (р47, р45, р17, р15).

Результаты анализа интерпретировали с учетом окрашивания зон, соответствующих только специфическим антигенам, при этом учету подлежали только четко окрашенные полосы. Наличие слабо окрашенных полос, соответствующих специфическим антигенам, а также окрашенных полос, соответствующих неспецифическим антигенам, не учитывали.

Положительным результатом анализа считали наличие не менее 2 полос, соответствующих специфическим антигенам T. pallidum; наличие только одной полосы, соответствующей одному из специфических антигенов, оценивали как неопределенный результат, отсутствие окрашивания в области полос, соответствующих специфическим антигенам, — как отрицательный результат.

Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы вначале исследовали на референсных материалах — на 9 сыворотках сероконверсионной панели Syphilis Seroconversion Panel фирмы SeraCare (5 отрицательных, 3 неопределенных и 1 положительный) и на 20 сыворотках панели Syphilis Mixed Titer AccuSetTM Performance Panel Modified фирмы SeraCare (2 отрицательных и 18 положительных).

Полученные оценки исследованных образцов полностью совпали с их паспортными характеристиками, т.е. была показана 100% диагностическая чувствительность и специфичность разработанной тест-системы. Аналитическая чувствительность тест-системы оценена с использованием международного стандарта ВОЗ WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG фирмы NIBSC и составила 0,001 МЕ/мл.

В заключение исследовали чувствительность и специфичность разработанной тест-системы на клиническом материале по сравнению с аналогом — набором реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG. Исследовано по 10 образцов сыворотки и плазмы крови человека, а также спинномозговой жидкости, содержащих IgG к T. pallidum по результатам их предварительного обследования, и по 10 образцов сыворотки, плазмы и спинномозговой жидкости, не содержащих этих антител (всего 60 образцов). Оценки всех исследованных образцов, полученных в обеих тест-системах, полностью совпали, что подтверждает высокую чувствительность и специфичность новой тест-системы.

Кроме полного совпадения общих оценок клинических материалов, в обеих тест-системах получено практическое совпадение профилей антител, выявленных этими тест-системами в исследованных образцах, о чем свидетельствуют коэффициенты корреляции оценок наличия антител к антигенам р47, р45, р17, р15 — 0,93—1,00.

Выводы

1. Разработана отечественная иммуноферментная тест-система ИФА-Блот-Сифилис-IgG, предназначенная для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости IgG к T. pallidum методом ИБ (формат Western blot).

2. Разработанная тест-система характеризуется высокими показателями чувствительности и специфичности и имеет аналитическую чувствительность 0,001 МЕ/мл.

3. ИФА-Блот-Сифилис-IgG выгодно отличается по техническим характеристикам и стоимости от своего импортного аналога — набора реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG (Германия).

4. После прохождения процедуры государственной регистрации медицинского изделия новая тест-система может быть рекомендована учреждениям здравоохранения в качестве подтверждающего теста на сифилис.

Набор полосок для определения антител

к возбудителю сифилиса

Набор реагентов для определения антител к возбудителю сифилиса (в цельной крови, сыворотке, плазме) человека методом иммунохроматографии

  • Количество в упаковке - 50 штук
  • Номер в каталоге - W34-S4P
  • Регистрационное удостоверение - № РЗН 2019/9254 от 19 ноября 2019 года

Производитель - Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd, КНР

Предназначен для качественного выявления суммарных (IgG и IgM) антител к Treponema pallidum в цельной капиллярной и венозной крови, сыворотке или плазме человека методом иммунохроматографического анализа. Этот тест обычно используется в лабораторных анализах или анализах вблизи пациента для быстрого определения бактериальной инфекции Treponema pallidum, связанной с сифилисом. Предназначен для первичной лабораторной диагностики сифилиса. Все варианты исполнения предназначены для постановки анализа вручную. Область применения - клиническая лабораторная диагностика.

1. 50 индивидуальных пакетов, каждый из которых содержит:

- Мешочек с осушителем.

2. Буферный раствор (5 мл) (2 шт.).

3. Инструкция по применению (1 шт.).

Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению.

Необходимые материалы, не включенные в комплект

1. Емкость для сбора образца.

2. Стерильный ланцет (только для взятия цельной

крови из пальца).

3. Спиртовая салфетка.

4. Одноразовая пипетка.

5. Центрифуга (для плазмы).

7. Капиллярная трубка с гепарином и груша (только для взятия цельной

крови из пальца).

1. Данный набор реагентов предназначен только для использования "in vitro" (вне живого организма). Не глотать.

2. Со всеми образцами следует обращаться как с биологически опасными.

3. Кровь больных желтухой, липемией, гемолитическая, термообработанная и загрязненная кровь могут вызывать ошибочные результаты.

4. Утилизировать набор реагентов после использования. Каждый набор реагентов не может использоваться более одного раза.

5. Не использовать набор реагентов после истечения срока годности.

6. Не использовать набор реагентов если мешочек проколот или нарушена его герметичность.

7. Хранить вне досягаемости от детей.

Средства индивидуальной защиты:

В этом продукте используется в качестве образца цельная кровь, сыворотка или плазма человека. Все образцы должны считаться потенциально опасными и с ними следует обращаться таким же образом, как с инфицированными реактивами. Носить стандартную защитную одежду, такую как халат и одноразовые перчатки при обращении с образцами и проведении тестов в соответствии с местными нормативными актами. Тщательно мыть руки после использования.

ЗАО "ЭКОлаб", Электрогорск (Московская обл.)

ЗАО "ЭКОлаб", Электрогорск (Московская обл.)

ГБУЗ "Центр планирования семьи и репродукции" Министерства здравоохранения Краснодарского края, Краснодар

ГБУЗ "Центр планирования семьи и репродукции" Министерства здравоохранения Краснодарского края, Краснодар

Отечественная тест-система Лайн-Блот Сифилис-IgM для определения IgM-антител к Treponema pallidum методом линейного иммуноблоттинга

Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2013;11(5): 40‑43

Марданлы C.Г., Арсеньева В.А., Анискова И.Н., Жигаленко А.Р. Отечественная тест-система Лайн-Блот Сифилис-IgM для определения IgM-антител к Treponema pallidum методом линейного иммуноблоттинга. Клиническая дерматология и венерология. 2013;11(5):40‑43.
Mardanly CG, Arsen'eva VA, Aniskova IN, Zhigalenko AR. The Russian Light-Blot Syphilis-IgM test system for the identification of IgM antibodies to Treponema pallidum by linear immunoblotting. Klinicheskaya Dermatologiya i Venerologiya. 2013;11(5):40‑43. (In Russ.).

ЗАО "ЭКОлаб", Электрогорск (Московская обл.)

Разработана отечественная тест-система Лайн-Блот Сифилис-IgM на основе метода линейного иммуноблоттинга с использованием рекомбинантных антигенов Treponema pallidum. Показана ее высокая диагностическая эффективность при использовании в качестве подтверждающего теста при серологической диагностике сифилиса.

ЗАО "ЭКОлаб", Электрогорск (Московская обл.)

ЗАО "ЭКОлаб", Электрогорск (Московская обл.)

ГБУЗ "Центр планирования семьи и репродукции" Министерства здравоохранения Краснодарского края, Краснодар

ГБУЗ "Центр планирования семьи и репродукции" Министерства здравоохранения Краснодарского края, Краснодар

Несмотря на снижение в последние годы доли сифилиса в структуре инфекций, передаваемых половым путем [1], он остается социально значимым заболеванием, требующим повышенного внимания специалистов в области здравоохранения.

Следует учитывать также, что одновременно со снижением заболеваемости манифестными формами сифилиса увеличилась доля его скрытых форм, как ранних, так и поздних, что характерно для периода угасания эпидемического процесса. В структуре поздних форм сифилиса повысился удельный вес нейросифилиса, причем увеличилась доля больных ранним и поздним нейросифилисом. Увеличилась доля скрытого сифилиса как раннего, так и позднего [2].

Основным инструментом лабораторной диагностики сифилиса являются серологические исследования, начинающиеся, как правило, со скрининга с использованием таких неспецифических (нетрепонемных) тестов, как реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном, и заканчивающиеся подтверждающими исследованиями с использованием таких специфических (трепонемных) тестов, как реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющих определить наличие и содержание в крови пациента видоспецифических антител классов М, А и G. В последние годы в качестве подтверждающих методов исследования на сифилис все шире используют иммуноблоттинг (ИБ) — выявление и оценку содержания антител к отдельным антигенам Treponema pallidum, иммобилизованным на нитроцеллюлозной мембране [3—6].

В связи с этим представляется актуальной разработка отечественной тест-системы для проведения ИБ для выявления IgM-антител к T. pallidum.

Материал и методы

За основу разработки была взята тест-система Лайн-Блот Cифилис-IgG (Регистрационное удостоверение №ФСР 2010/06925 от 01.03.10), т.е. новая тест-система Лайн-Блот Cифилис-IgG представляет собой набор реагентов, рассчитанный на исследование 24 образцов сыворотки (плазмы) крови или ликвора человека на наличие и содержание IgM-антител к четырем антигенам T. pallidum — TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.

В новый набор входят:


— иммуносорбент — тест-полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны, на каждую из которых в виде поперечных полос нанесены рекомбинантные аналоги указанных антигенов T. pallidum, а также пять контрольных линий (см. рисунок); Рисунок 1. Схема нанесения антигенов T. pallidum, контролей и калибраторов на нитроцеллюлозном стрипе в наборе реагентов Лайн-Блот Cифилис-IgG.

— 10-кратный концентрат промывочного раствора;

— раствор для разведения исследуемых образцов;

— субстратный раствор — раствор хромогенного субстрата для выявления ферментативной активности щелочной фосфатазы;

— референс-стрип — образец-шаблон со стрипом той же серии, что и иммуносорбент, проинкубированным с положительной, ранее охарактеризованной сывороткой, содержавшей IgМ-антитела;

— конъюгат — антитела козьи к IgМ человека, конъюгированные с щелочной фосфатазой.

Кроме того, новый набор включает РФ-сорбент — антитела козьи к IgG человека, используемый для удаления IgМ-антител ревматоидного фактора, а также избытка IgG-антител.

Кроме линий (зон) рекомбинантных антигенов, на каждом стрипе имеются пять контрольных линий. Линия контроля антигена (КАГ) — для оценки корректности проведения теста на данном образце (при правильно проведенном исследовании эта полоса не окрашивается). Три калибровочные линии, которые при проведении анализа дают зоны дискретно уменьшающейся интенсивности окрашивания, соответствующие баллам 3+, 1+, 0,5+. Линия контроля внесения образца — для самоконтроля (должна быть окрашена при правильном проведении исследования).

Процедура ИБ с использованием новой тест-системы отличается от процедуры ИБ с использованием оригинала только предварительной обработкой исследуемых образцов РФ-сорбентом (образец разводят 1:1 и после 30-минутной инкубации при комнатной температуре центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин, в дальнейшем исследовании используют супернатант).

Тест-система прошла технические и медицинские испытания в Государственном научном центре дерматовенерологии и косметологии, где продемонстрировала 100% диагностическую чувствительность и специфичность.

Результаты

В число обследуемых лиц вошли:

1) лица, имевшие половой контакт с лицом, имеющим установленный ранее диагноз сифилиса (17 человек);

2) лица с положительными нетрепонемными реакциями (10);

3) лица с положительным результатом на наличие IgM-антител в ИФА (9);

4) лица с подозрением на первичное заражение (14);

5) лица с подозрением на реинфекцию при вторичном сифилисе (17);

6) лица, проходящие плановое обследование, в том числе беременные (27);

7) лица с наличием клинических проявлений заболевания (10);

9) лица с подозрением на ранний скрытый сифилис (17);

10) лица с подозрением на неуточненный скрытый сифилис (1);

11) лица с подозрением на ранний врожденный сифилис (3).

Предварительная оценка на наличие IgM-антител к T. pallidum в 126 образцах сыворотки крови в ИФА и РИФабс дала 54 положительных, 50 отрицательных и 22 сомнительных результата. При этом ИБ в тест-системе Лайн-Блот Cифилис-IgG подтвердил 53 положительных, 48 отрицательных и 6 сомнительных результатов; 1 отрицательный и 12 сомнительных результатов были переквалифицированы в положительные, 3 сомнительных получили отрицательную оценку и по одному образцу, предварительно оцененному как положительный и отрицательный, были переквалифицированы в сомнительные.

Как следует из таблицы, получено практически полное совпадение оценок в обеих тест-системах (коэффициент корреляции ранговых оценок составил 0,93).

Предварительное исследование образцов ликвора в ИФА, РПГА и РИФабс дало во всех случаях отрицательный результат по наличию IgM-антител к T. pallidum. IgG-антитела обнаружены в 14 образцах, 12 образцов по наличию этих антител были оценены как отрицательные, 5 — как неопределенные.

ИБ всех образцов ликвора был выполнен с использованием как новой тест-системы, так и тест-системы-прототипа (Лайн-Блот Cифилис-IgG). Его результаты полностью совпали с данными предварительной оценки образцов.

Обоснованность включения в состав нового набора РФ-сорбента, т.е. целесообразность предварительной обработки им исследуемых образцов, показана при исследовании 23 образцов сыворотки, которые давали положительный результат при исследовании на РФ-фактор. ИБ этих образцов без предварительной обработки РФ-сорбентом дал 17 отрицательных и 6 сомнительных результатов, а ИБ после такой обработки — 21 отрицательный и 2 сомнительных результата соответственно, что позволяет говорить о существенном повышении диагностической специфичности набора.

Заключение

Разработка технологий производства рекомбинантных антигенов Treponema pallidum способствовала широкому внедрению в серологическую диагностику сифилиса методов ИФА, в том числе ИБ в формате лайн-блоттинга, реализацией которого явилась разработка тест-системы Лайн-БлотCифилис-IgG.

Использование ИБ особенно важно при необходимости верифицировать диагноз в сложных случаях, в частности для серологической диагностики во второй половине инкубационного периода, диагностики скрытого врожденного сифилиса в первые дни жизни ребенка, выявления скрытого сифилиса у лиц со слабым гуморальным ответом, а также для дифференцирования ложноположительных и противоречивых результатов серореакций [7—10].

Поскольку в пуле исследованных образцов были представлены фактически все указанные случаи, результаты испытаний новой тест-системы Лайн-Блот Cифилис-IgG позволяют высоко оценивать ее диагностическую эффективность как подтверждающего теста в комплексной серологической диагностике сифилиса.

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Современные лабораторные методы и алгоритмы диагностики сифилиса

Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2015;14(6): 56‑61

Дано описание современных подходов к лабораторной диагностике сифилиса. Описаны прямые тесты (темнопольная микроскопия, прямая иммунофлюоресценция Treponema pallidum, полимеразная цепная реакция), позволяющие выявить самого возбудителя или его генетический материал. Приведены наиболее часто применяемые нетрепонемные и трепонемные тесты, используемые в серологической диагностике сифилиса; показания и ограничения к их применению. Дано описание двух современных алгоритмов, применяемых при серологическом обследовании больного с подозрением на сифилис: традиционного и реверсионного, описаны их достоинства и недостатки. Статья представляет интерес для практических врачей — дерматовенерологов, урологов, акушеров-гинекологов, врачей клинической лабораторной диагностики, в поле зрения которых могут оказаться больные манифестными и скрытыми формами сифилиса.

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Сифилис — системное инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой (Treponema pallidum, subspecies pallidum), остается общемировой проблемой здравоохранения.

В Москве в последние годы отмечена стойкая тенденция к снижению заболеваемости сифилисом. В 2013 г. уровень заболеваемости сифилисом составил 20,4 на 100 000 населения. Однако эпидемиологическая ситуация продолжает оставаться напряженной: в структуре сифилиса преобладают скрытые формы, растет число поздних форм инфекции, что диктует необходимость усиления эпидемиологического контроля над распространением заболевания и широкого применения врачами-дерматовенерологами современных высокочувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики сифилиса [1].

Все лабораторные методы диагностики сифилиса подразделяются на прямые, позволяющие выявлять возбудителя или его генетический материал непосредственно в очагах поражения, и непрямые — для выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови (серологическая диагностика).

При назначении пациенту лабораторного обследования по поводу сифилиса не следует забывать о том, что абсолютным критерием постановки диагноза является непосредственное выявление возбудителя заболевания — бледной трепонемы (T. pallidum) или его генетического материала [2].

T. pallidum в образцах, полученных из райц-серума сифилидов или инфицированных лимфоузлов при раннем сифилисе, можно обнаружить с помощью следующих прямых методов исследования:

• микроскопия в темном поле микроскопа, или темнопольная микроскопия (ТПМ);

• прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) (для образцов из поражений в полости рта или из других очагов, где возможна контаминация трепонемами-комменсалами);

• полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Наиболее убедительным доказательством инфицирования сифилисом является прямая визуализация T. pallidum в темном поле зрения [3].

Материалом для темнопольной микроскопии является серозное отделяемое с поверхности эрозии, язвы, мацерированной или экскориированной, эрозированной папулы или бляшки, иногда — содержимое пунктата лимфоузла. При исследовании в темном поле бледная спирохета выглядит в виде нежной подвижной спирали, слабо светящейся серебристым блеском. Исследование в темном поле микроскопа позволяет изучать T. pallidum в живом виде, а также дифференцировать ее от других трепонем как по морфологическим признакам, так и по характерным особенностям движения, что позволяет поставить диагноз даже без учета данных серологических тестов.

Вторым методом выявления возбудителя сифилиса в очагах поражения является метод ПИФ. В результате взаимодействия моноклональных антител анти-T. pallidum, меченных ФИТЦ, и бледной трепонемы, полученной из очагов поражения и помещенной на предметное стекло, при люминесцентной микроскопии наблюдается специфическое ярко-зеленое свечение. Метод удобен при исследовании материала, полученного со слизистой оболочки полости рта и прямой кишки, при биопсии или аутопсии. За счет использования видоспецифических моноклональных антител метод позволяет дифференцировать патогенную T. pallidum от трепонем-комменсалов [4]. В России данный метод не применяют ввиду отсутствия промышленного производства и сертификации соответствующих ингредиентов, в частности, моноклональных антител к патогенной бледной трепонеме, меченных ФИТЦ.

ПЦР позволяет обнаружить единственную молекулу ДНК возбудителя среди миллионов других молекул. Метод основан на принципе естественной репликации ДНК и заключается в размножении (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК возбудителя в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом этапе вновь синтезированные молекулы копируются ферментом ДНК-полимеразой, благодаря чему происходит многократное удвоение специфических фрагментов ДНК [5].

Источниками обнаружения генетического материала возбудителя при постановке ПЦР у больных сифилисом могут являться: райц-серум (тканевая жидкость) генитальных язв, биопсийный материал кожных сифилидов, спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, плацента, периферическая кровь и семенная жидкость. Наиболее адекватным для исследования является райц-серум генитальных язв.

Чувствительность и специфичность метода ПЦР при исследовании райц-серума сифилидов при первичном сифилисе достигает 94,7—98,6%, при вторичном 80—98,6% и более выражена по сравнению с темнопольной микроскопией [6].

Широкое применение при обследовании на сифилис получили непрямые, серологические методы исследования, принцип которых заключается в выявлении в сыворотке или плазме крови или спинномозговой жидкости пациентов антител, ассоциированных с сифилитической инфекцией.

Первой серологической реакцией для диагностики сифилиса была реакция связывания комплемента, предложенная в 1906 г. Вассерманом, Нейсcером и Бруком [7]. Однако в настоящее время этот метод, ставший в свое время революционным и положивший начало серологической диагностике сифилиса, считается морально устаревшим: он длительно выполняется, субъективно интерпретируется, часто дает ложноотрицательные и ложноположительные результаты и не подлежит стандартизации.

Современные серологические тесты, применяемые для диагностики сифилиса, подразделяются на две большие группы: нетрепонемные (НТТ) и трепонемные (ТТ).

В НТТ на сифилис используется антиген нетрепонемного происхождения — кардиолипин-холестерол-лецитиновый комплекс [8, 9].

Основными видами НТТ, рекомендуемыми к применению на территории России, в настоящее время являются:

— РМП — реакция микропреципитации с плазмой и инактивированной сывороткой;

— RPR — тест быстрых плазменных реагинов (Rapid Plasma Reagins), или быстрый, или ускоренный плазмареагиновый тест;

— VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) — тест исследовательской лаборатории венерических заболеваний.

Могут быть также использованы следующие их аналоги при условии, если тест-система имеет разрешение к медицинскому применению на территории Российской Федерации:

TRUST — тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test);

RST — тест на скрининг реагинов (Reagin Screen Test);

USR — тест на реагины с непрогретой сывороткой (Unheated Serum Reagins) [10, 11].

Показаниями к применению НТТ на сифилис являются:

• проведение скрининга населения на сифилис;

• контроль эффективности терапии (по титру антител в парных сыворотках, полученных до и после лечения);

• определение активности инфекции (по высоте титра антител).

НТТ просты в исполнении, недороги, не требуют специального оборудования и длительного времени; при этом реакции являются высоко чувствительными и специфичными.

Чувствительность РМП варьирует в зависимости от стадии заболевания: от 81% при первичном сифилисе до 94—99% при вторичном и скрытых формах сифилиса. Чувствительность зарубежных тестов варьирует от 59 до 100%, специфичность — от 93 до 99%.

После адекватного специфического лечения сифилиса содержание антител к возбудителю сифилиса, выявляемых в НТТ, постепенно снижается, тесты из резко положительных становятся слабоположительными, а затем отрицательными. В связи с этим НТТ используют для оценки эффективности лечения.

Ограничениями применения НТТ являются ранние стадии сифилиса (период инкубации, начало первичного периода), так как данные реакции становятся позитивными лишь спустя 2—3 нед после появления твердого шанкра, и поздние стадии (поздний скрытый и третичный сифилис, сифилис с поражением внутренних органов и нервной системы), так как лабильные преципитины первыми элиминируются из организма при длительном течении сифилитической инфекции. К числу недостатков НТТ следует отнести также субъективный визуальный учет, хотя в настоящее время разработаны системы для видеоцифровой регистрации результатов с их переводом в цифровые данные.

Следует иметь в виду, что антитела, определяемые в НТТ на сифилис, могут выявляться при ряде острых и хронических инфекционных и соматических заболеваний, которые сопровождаются гибелью клеток и разрушением тканей, что может стать причиной ложноположительных результатов НТТ, которые встречаются при скрининге населения на сифилис в 1—3% случаев [12].

В ТТ применяется антиген трепонемного происхождения — патогенная бледная трепонема, рекомбинантные белки, полученные генно-инженерным способом или пептиды, полученные путем искусственного химического синтеза.

Основными ТТ, рекомендуемыми к применению на территории России, в настоящее время являются:

ИФА — иммуноферментный анализ (ELISA — Enzymelynced immunosorbent assay, EIA – Enzyme immunoassay);

РПГА — реакция пассивной гемагглютинации (ТРНА, TPPA — Treponema pallidum hemagglutination assay, Treponema pallidum partiсle agglutination assay);

РИФ — реакция иммунофлюоресценции (FTA Fluorescent treponemal antibody);

ИХЛ — иммунохемилюминесценция (СLIA — Chemiluminescence Immunoassay);

Простые быстрые тесты у постели больного — ПБТ (РОС — point of care tests);

РИБТ (РИТ) — реакция иммобилизации бледных трепонем (TPI — Treponema pallidum immobilization test) [13, 14].

Показаниями к применению ТТ являются:

• подтверждение положительных результатов НТТ;

• дополнительное подтверждение в случае расхождения результатов скринингового ТТ и последующего НТТ;

• скрининг населения на сифилис (ИФА, РПГА, простые быстрые тесты).

К числу несомненных достоинств ТТ относится их высокая чувствительность и особенно специфичность, возможность подтверждения (верификация) результатов НТТ.

Часть ТТ (ИФА, ИХЛ, иммуноблоттинг) может быть автоматизирована и выполняться на анализаторах с получением объективного отчета в электронном виде. Для РПГА имеется возможность видеоцифровой регистрации результатов.

ТТ могут быть использованы для подтверждения клинического диагноза сифилиса на ранних стадиях инфекции, когда НТТ еще отрицательны, но есть клинические, эпидемиологические или анамнестические подозрения на сифилис. Однако чувствительность при первичном сифилисе этих тестов в совокупности недостаточна (76—86%) в основном за счет РИБТ, которая становится позитивной, начиная со второй половины первичного периода сифилиса.

Ранние стадии сифилиса (начало первичного периода сифилиса, период инкубации) могут быть диагностированы при использовании IgM-тестов, которые выявляют ранние трепонемоспецифические IgM, первыми появляющимися в организме больного сифилисом в ответ на внедрение возбудителя (варианты РИФ-абс IgM, ИФА-IgM, ИХЛ-IgM, IgM-иммуноблоттинга) [15—19].

Трепонемные методы хорошо выявляют вторичный и скрытый сифилис (чувствительность составляет 98—100%) [20].

ТТ могут быть использованы для установления ретроспективного диагноза сифилиса, а также для распознавания ложноположительных результатов НТТ.

С использованием ряда ТТ (ИФА, РПГА, ИХЛ, ПБТ) можно проводить скрининг отдельных категорий населения на сифилис (доноры, беременные, больные офтальмологических, психоневрологических, кардиологических стационаров, ВИЧ-инфицированные).

ТТ не могут быть использованы для контроля эффективности лечения, так как длительно остаются положительными после окончания лечения сифилиса (в особенности РИБТ, РПГА). Они сложнее в техническом отношении, чем НТТ, что несколько ограничивает их применение.

В настоящее время существуют два основных подхода к проведению скрининга и обследования больных на сифилис: первый подход характеризуется началом обследования с назначения НТТ, второй — когда обследование начинается с ТТ.


Рис. 1. Традиционный алгоритм серологического скрининга на сифилис (из лекции Фриго Н.В. на цикле усовершенствования врачей, РМАПО, 2012).

Контрольное обследование после лечения проводится с помощью РМП или ее модификации в полуколичественном варианте. По снижению ее титра судят об эффективности терапии

Заключительное обследование проводят не ранее чем через 1 год. Ставится та же специфическая реакция, что и при первичном обследовании. Наличие ее положительных результатов не является препятствием для снятия пациента с учета [13].

Традиционный алгоритм скрининга на сифилис имеет свои преимущества и недостатки. Несомненным преимуществом является то, что он выявляет активную инфекцию. Однако данный алгоритм дает высокий процент ложноположительных результатов, нуждается в подтверждении ТТ и может пропустить ранний первичный сифилис или пролеченную инфекцию.


Рис. 2. Реверсионный алгоритм серологического скрининга на сифилис (из лекции Фриго Н.В. на цикле усовершенствования врачей, РМАПО, 2012).

При положительном результате ТТ следует постановка НТТ с определением титра антител.

Если НТТ дает отрицательный результат, проводится дополнительное тестирование с использованием второго чувствительного и специфичного (подтверждающего) ТТ (например, РПГА).

При отрицательном результате дополнительного подтверждающего теста (РПГА–) делается вывод о том, что человек не болен сифилисом; при этом положительный результат скринингового ТТ (первый) расценивается как ложноположительный.

При положительном результате (РПГА+) делается вывод о том, что у человека имеется сифилис в настоящем или был перенесен в прошлом.

Можно привести ряд аргументов в пользу использования реверсионного алгоритма:

• возможность автоматизации ТТ;

• высокая производительность (до 180 тестов в час);

• отсутствие или сведение до минимума ручных манипуляций (безопасность персонала и высокое качество исследований);

• низкая себестоимость при больших объемах тестирования (поток);

• отсутствие ложнонегативных реакций и феномена прозоны (высокая чувствительность);

• возможность детекции IgM антител — потенциальная возможность диагностики раннего сифилиса.

Главным преимуществом реверсионного алгоритма является то, что он выявляет ранний или пролеченный сифилис, что может быть пропущено при традиционном скрининге. Вместе с тем он также имеет ряд недостатков: реверсионный алгоритм нуждается в постановке НТТ для подтверждения активной инфекции и контроля эффективности терапии, может давать ложноположительные результаты (из-за недостаточно высокой специфичности тестов), не позволяет дифференцировать активную и пролеченную инфекцию (и это его основной недостаток!).

Проблемы возникают чаще всего при наличии положительного результата ТТ и отрицательного результата НТТ. Тактика в этом случае должна быть следующей.

• При несовпадении результатов скринингового ТТ и НТТ (ТТ+, НТТ–) необходима постановка дополнительного подтверждающего ТТ.

• Подтверждающий Т.Т. должен иметь чувствительность не ниже, а специфичность — выше, чем скрининговый ТТ.

• В качестве дополнительного подтверждающего теста в этих случаях может быть рекомендована РПГА (РИФабс не рекомендуется ввиду более низкой аналитической чувствительности в сравнении с другими ТТ) [24].

• Результаты скрининга следует анализировать с учетом клинической картины заболевания и анамнестических данных пациентов (в частности, полноты и качества проведенного специфического лечения по поводу ранее перенесенного сифилиса).

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что в распоряжении дерматовенерологов и врачей других специальностей в настоящее время имеется большой арсенал как прямых, так и непрямых лабораторных методов исследования для диагностики сифилиса. Рациональное использование имеющихся технологий и алгоритмов диагностики позволяет осуществлять эпидемиологический надзор и контроль над распространением сифилиса на территории города Москвы и других субъектов Российской Федерации.

Читайте также: