Редактирование генома человека с вич инфекцией

Обновлено: 12.05.2024

Китайские двойняшки

Хе Цзянькуй (He Jiankui), китайский ученый из Южного университета науки и технологий в Шэньчжэне, рассказал в середине ноября о рождении девочек-близняшек с измененным геномом. Геном был отредактирован на стадии эмбрионального развития для защиты детей от ВИЧ.

Китайский ученый-генетик Хе Цзянькуй

Около 1% населения Северной Европы, в том числе в России, имеют иммунитет к ВИЧ с рождения.

Попытки научиться переносить эту невосприимчивость от одного человека к другому ученые предпринимают уже давно. На этой идее основывался и эксперимент Хе Цзянькуя. Но несмотря на окрыляющие результаты, к истории с редактированием генома эмбрионов много вопросов.

Во-первых, ни одной статьи в рецензируемом научном журнале с деталями работы пока не опубликовано. А раздел, посвященный работе с детьми, на сайте лаборатории Хе в Южном университете недоступен. И все сведения об успехе эксперимента основаны на выступлении ученого на Международной конференции по редактированию генома в Гонконге и его интервью Associated Press.

Из-за отсутствия доказательств безопасности редактирования генома подсаживать измененные эмбрионы женщинам запрещено в большинстве стран. Поэтому выпускник Стэнфорда и университета Райса Хе Цзянькуй и поставил эксперимент в Китае. Кстати, в этом ему помогал профессор биоинженерии Майкл Дим, с которым Хе познакомился во время обучения.

Более того, китайский ученый не смог или отказался ответить на несколько важных вопросов, в том числе о том, кто финансировал исследование и как он удостоверился, что подопытные знали о возможных последствиях. Смутило ученых и то, что данные о начале эксперимента в государственный реестр клинических испытаний были внесены лишь 8 ноября 2018 года — почти через год после его начала.

Берлинский пациент

Говорить об излечении Рея от ВИЧ специалисты не спешат: сколько еще 52-летний пациент сможет продержаться без терапии, неизвестно.

Испанские больные

В результате у 10 из 13 пациентов количество вирусов в крови увеличилось, и они стали проходить антиретровирусную терапию. Но у остальных вирус либо не обнаружился вообще, либо — в незначительном объеме. И в таком состоянии без терапии они провели до 30 недель. Отчитались ученые о работе с 13 пациентами, но на самом деле их было больше — не все вошли в финальную выборку по разным причинами.

После публикации результатов многие СМИ писали о создании вакцины от ВИЧ, однако говорить об этом было преждевременно. Тем более что новых заявлений испанских ученых по поводу состояния подопытных найти не удалось.

Российские инфицированные

Подобные случаи, когда зараженные ВИЧ не нуждаются в замедляющей развитие вируса терапии, встречаются не только в Германии и Испании. По крайней мере об одном ВИЧ-положительном с 20-летним стажем, который без проблем для здоровья отказался от терапии, известно в России. Однако экстраполировать этот опыт на других пациентов так, чтобы состояние улучшалось в 100% случаев, пока не удается.

Поэтому люди с ВИЧ-положительным статусом постоянно принимают лекарства. Антиретровирусная терапия — единственный способ борьбы с вирусом, чья эффективность, пусть и временная, доказана. Кроме того, она исключает возможность передачи вируса от человека к человеку, в том числе от ВИЧ-положительных матерей детям.

Во-вторых, терапия дорогая. В России за счет бюджета в прошлом году удалось обеспечить лекарствами 340 тыс. пациентов, в этом — 412 тыс.

По данным Министерства здравоохранения РФ на ноябрь 2018 года, у 808 тыс. россиян ВИЧ.

Пусть это меньше, чем 1,2 или 1,5 млн, о которых говорят другие организации, в том числе негосударственные, которые ведут свою статистику. В любом случае, количество людей, которых удается лечить за счет бюджета, существенно меньше количества больных. В прошлом году Россия стала первой страной в Европе по числу новых случаев заражения — 71,1 случай на 100 тыс. населения.

Инфицированным остается ждать попадания в бюджетную программу или лечиться самостоятельно. Ко второму варианту подталкивает и то, что некоторые новые зарубежные препараты запрещено покупать за государственный счет.

Дело нескольких лет

И хотя испытания российского препарата были удачными, о выпуске его на рынок речь пойдет, только когда медики получат доказательства отсутствия непредсказуемых последствий вмешательства в геном клеток. Тех самых доказательств, которых не стал дожидаться Хе Цзянькуй.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) разработала с целью лечения ВИЧ-инфекций российскую версию системы редактирования генома CRISPR, основанную на внесении изменений в генетический аппарат клеток. Об этом сообщается на сайте ведомства.

Научно-консультативный клинико-диагностический центр ЦНИИ эпидемиологии разработал платформу по производству компонентов системы редактирования генома CRISPR и получил российский патент. Сейчас специалисты института готовят заявку о регистрации патента в Международное патентное ведомство (WIPO).

По словам главы Роспотребнадзора Анны Поповой, системы CRISPR можно использовать для терапии ВИЧ, наследственных и приобретенных заболеваний, среди которых рак, аутоиммунные и орфанные заболевания. Как пояснили в службе, тест-системы CRISPR позволяют проводить диагностику без применения специализированного оборудования.

На сегодняшний день существуют несколько методов редактирования геномов — системы TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) и CRISPR/Cas9, элементами которой служат некодирующие рибонуклеиновые кислоты (РНК) и белки Cas.

Заложники микроменеджеров: зачем компании массово возвращают людей в офис

Издержки хранения могут достигать 40%: как компании правильно запасаться

По каким отраслям экономики России кризис ударит сильнее всего

Россияне перешли на кризисные модели шопинга: что и где они скупают

Meta* в опале: что это значит для бизнеса и поможет ли VPN

Чем поможет форс-мажор — инструкция по применению

Европейское небо закрыто для России. Кто выиграет от этой авиаблокады

В сентябре Bloomberg узнал о встрече российских генетиков с представителями Минздрава, посвященной проблеме редактирования ДНК человека. Поводом для собрания называлось исследование биолога Дениса Ребрикова. Он работает с семейной парой глухих, которая не хочет, чтобы их ребенок унаследовал их патологию. Биолог хочет помочь им с помощью редактирования ДНК.

По мнению противников биолога, одобрение его заявки подтолкнет ученых на проведение рискованных экспериментов со сперматозоидами, яйцеклетками и эмбрионами до того, как будет создана структура для контроля этой спорной области науки.

О долгосрочном воздействии системы редактирования генов Crispr на организм человека пока мало известно. По словам критиков Ребрикова, для того чтобы быть уверенным в том, что редактирование ДНК безопасно, могут уйти десятилетия.

Директор НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича, академик РАН Андрей Лисица подтверждал РБК, что встреча ученых-генетиков и представителей Минздрава прошла 24 июля 2019 года в Медико-генетическом научном центре. По словам академика Лисицы, встреча проводилась под председательством главного внештатного специалиста Минздрава России, директора Медико-генетического научного центра Сергея Куцева. Организатором выступила Российская ассоциация содействия науке.

Новость

Система CRSIPR/Cas9 удалит вирусную информацию в геноме человека, зараженного ВИЧ

Автор

Редакторы

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

CRISPR/Cas9

Рисунок 1. Система CRISPR/Cas9 как один из вариантов бактериального иммунитета. а — Внедрение чужеродной ДНК в клетку бактерии. б — Приобретение спейсера. в — Транскрипция CRISPR-локуса. г — Образование guideРНК. д — Образование активного комплекса Cas9 + guideРНК. е — Связывание чужеродной ДНК. ж — Внесение двухцепочечного разрыва в ДНК. Сокращения см. в тексте.

Но затем в 2012 году бактериальную защитную систему взяли на вооружение ученые, ведь если соединить Cas9 с определенной РНК, то можно разрезать необходимый ген. Разрезанный ген запускает в клетке систему репарации, которая в буквальном смысле пытается соединить концы с концами. При этом происходят различные мутации репарируемого гена — в основном удаления, но бывают и разные вставки. Однако если мы предоставим матрицу для репарации, ген может вернуться к правильной форме. Так можно вносить любые изменения в геном. Это означает, что мы в теории можем лечить генетические заболевания, рак и не только. Сегодня мы поговорим о том, как CRISPR/Cas9 поможет решить проблему избавления от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

ВИЧ — возбудитель синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) — относится к роду лентивирусов семейства ретровирусов, чей геном представлен двумя копиями одноцепочечной РНК, на двух концах которой находятся длинные концевые повторы (или по-английски long terminal repeat, LTR) [7]. В самой вирусной частице содержатся еще три фермента: протеаза, обратная транскриптаза и интеграза (рис. 2). Протеаза расщепляет продукты считывания вирусных генов с образованием зрелых белков.

Рисунок 2. Строение вириона ВИЧ. Частица покрыта липидным бислоем, происходящим из клеточной мембраны организма-хозяина, и усеяна молекулами вирусных гликопротеинов.

Жизненный цикл ВИЧ довольно прост (рис. 3). Вначале вирус инфицирует клетку, причем в качестве рецептора служит молекула CD4, а корецепторами становятся рецепторы хемокинов, поэтому поражаются клетки иммунной системы: T-лимфоциты (T-хелперы), моноциты, макрофаги, а также клетки мозга (макрофаги, микроглия, астроциты), клетки лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта и другие. Затем одноцепочечный РНК-геном с помощью обратной транскриптазы превращается в двухцепочечную ДНК, так называемую провирусную ДНК. Наконец интеграза встраивает двухцепочечную провирусную ДНК в геном хозяина. Эта встроенная информация считывается, причем промоторами (то есть местами, привлекающими РНК-полимеразу для транскрипции) служат длинные концевые повторы — LTR. Собираются новые вирусные частицы, поражающие новые клетки. В целом весь этот процесс приводит к частым мутациям вируса, особенно вариабельны поверхностные гликопротеины, в том числе поэтому частицы ВИЧ так неуловимы для нашего иммунитета [8], [9].

Рисунок 3. Жизненный цикл ВИЧ. 1 — зрелая вирусная частица; 2 — связывание с клеткой благодаря рецепторам; 3 — слияние мембран вируса и клетки; 4 — высвобождение вирусной РНК; 5 — превращение РНК в ДНК (обратная транскрипция); 6 — интеграция в геном клетки; 7 — считывание вирусной информации; 8 — сборка и выход вирусной частицы; 9 — новая вирусная частица.

Терапия ВИЧ

Рисунок 4. Удаление провируса из генома человека приведет к невозможности размножения и распространения вируса.

Современная высокоактивная антиретровирусная терапия основывается на ингибировании обратной транскриптазы, протеазы, интегразы, слияния вируса с клеткой, что значительно осложняет жизнь вируса. Но все же ВИЧ-инфекция в настоящий момент остается неизлечимым заболеванием, так как такая терапия никак не влияет на ДНК вируса у нас в геноме: у пациентов, принимающих антиретровирусную терапию, около 10 6 клеток содержат провирус. Сверх того, у пациентов могут быть серьезные побочные эффекты или устойчивость к антиретровирусной терапии [10].

Рисунок 5. Система CRISPR/Cas9, интегрированная в клетки, может препятствовать их заражению вирусом и интеграции вируса в геном.

Предложенная система протестирована японскими учеными в 2013 году на культуре клеток человеческих T-лимфоцитов [8]. В качестве мишени они предложили использовать LTR, а в них — разные участки, необходимые для связывания факторов инициации и элонгации транскрипции. Трехкратное внесение в клетки конструкции CRISPR/Cas9 снижало считывание вирусного генома почти в 3 раза (с 97,8% до 35,5%). Дальнейший анализ показал, что почти все клетки содержали в области провируса различные мутации.

Так как LTR — это концевые повторы, то разрезание с двух концов теоретически может привести к полному вырезанию встроенного в геном вирусного куска. И действительно — почти у трети клеток (31,8%) после трехкратного внесения системы CRISPR/Cas9 этот участок полностью удалялся.

А что насчет мутаций вируса? Ведь если целевой участок изменит свою структуру, система CRISPR/Cas9 не сможет его найти и обезвредить. Понимая это, ученые выбрали именно тот участок LTR, что содержит высококонсервативные последовательности ДНК, практически одинаковые у всех подвидов ВИЧ.

Не все так просто

Рисунок 6. Повышение специфичности разрезания гена с использованием никаз, вносящих одноцепочечные разрывы.

Предложенная система изменения генов не так чудесна, как может показаться на первый взгляд, как бы я ни старалась вас в этом убедить. Есть много подводных камней, которые требуют дальнейшего исследования.

Таким образом, стремительно развивающаяся генная терапия с использованием CRISPR/Cas9 — ключ к избавлению от ВИЧ-инфекции и ассоциированных с ней заболеваний и осложнений. Однако не стоит ожидать, что такое лекарство сегодня-завтра появится на прилавках в аптеке, ведь еще о многом стоит подумать, чтобы разработать действительно эффективное и безопасное лечение.

Новость

Комплекс-белок Cas9/sgRNA/viral RNA (слева) и модель вируса иммунодефицита человека (справа), построенная коллективом Visual science.

Автор

Редактор

Спонсор публикации этой статьи — Виктор Татарский.

Врага нужно знать в лицо

Об иммунитете, апоптозе и вообще.

Иммунная система развивалась сотни миллионов лет. По типу реакции ее обычно делят на врожденный (неспецифичный) и приобретенный (специфичный) иммунитет [1], [2]. Считается, что специфичный (то есть вырабатываемый к конкретному патогену) иммунитет впервые появился у челюстноротых (рыб и всех вышестоящих по эволюционному древу таксонов) после отделения от бесчелюстных (миног и миксин), хотя у вторых имеется аналогичная система защиты [3]. К клеткам специфичного иммунитета относят В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры, natural killer cells). Помимо этого существуют моноциты, которые хоть и не являются истинными инструментами приобретенного иммунитета, однако выполняют некоторые функции по нейтрализации патогена: фагоцитоз, презентация антигена, выделение бактерицидных веществ и цитокинов.

Рисунок 1. Взаимодействия Т-киллеров (слева) и Т-хелперов (справа) с зараженными клетками. Для передачи сигнала о заражении необходимо выполнение двух условий: контакт комплекса МНС-патоген с TcR (T-cell Receptor, рецептор Т-клеток) и CD. Двигаясь по организму, Т-лимфоциты проверяют каждую клетку на предмет наличия у нее антигена в комплексе с МНС. Их можно сравнить с подслеповатой глуховатой бабушкой, пришедшей забирать дитятко из детского сада. Для опознания ей надо подойти вплотную и по нескольким (в данном случае по двум) признакам определить, ее ли это чадо или нет.

Т-лимфоциты, в свою очередь, необходимы для уничтожения клеток, зараженных внутриклеточными паразитами, и опухолевых клеток. Они делятся на два основных типа в зависимости от класса рецепторов, находящихся на внешней стороне их мембраны.

Т-киллеры несут CD8 рецепторы и отвечают за:

Т-хелперы имеют CD4 рецепторы и ответственны за секрецию цитокинов, которые:

активируют макрофаги для борьбы с внутриклеточными паразитами;
способствуют продукции антител В-лимфоцитами.

Но не менее важна роль Т-хелперов в подготовке зрелых Т-киллеров из клеток-предшественниц, активации NK-клеток и моноцитов.

Как же происходит опознавание антигена на молекулярном уровне? Здесь надо упомянуть еще об одном очень важном классе рецепторов — МНС (Major Histocompability Complex или главном комплексе гистосовместимости). Они бывают двух классов: I и II. МНС I присутствует на поверхности всех ядерных клеток организма человека. Он необходим для опознавания клетки натуральным киллером и Т-киллером (рис. 1, 2). Если по какой-то причине МНС I изменен, несет на себе антиген или отсутствует, клетка будет подвергнута апоптозу. МНС II находится на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. Он необходим для презентации антигена Т-хелперам (рис. 1, 2). Жизнь пула Т-хелперов можно представить как прогулку с ребенком в зоопарке, только вместо животных — антигены, вместо ребенка — Т-хелпер, а вместо взрослых, объясняющих, кто есть кто, — три перечисленных типа клеток.

Рисунок 2. Процесс передачи сигнала Т-киллеру и Т-хелперу. Первый этап — сборка комплекса МНС-антиген, второй этап — презентация комплекса на поверхности клетки.

Первый этап проникновения вируса в клетку — взаимодействие вирусного белка gp120 (рис. 3) с рецептором CD4. Отсюда понятно, почему ВИЧ размножается именно в Т-хелперах. Взаимодействию способствуют корецепторы CCR5 и CXCR4 [8]. В норме они являются рецепторами цитокинов, а при взаимодействии ВИЧ с клеткой их связь является необходимым условием проникновения вируса внутрь. Мутации в генах этих рецепторов обеспечивают частичную устойчивость носителей таких мутаций (таких людей около 2%, причем некоторые штаммы вируса все равно могут их поражать) [9]. Затем в мембрану клетки погружается белок gp41, после чего мембрана вируса сливается с клеточной, и происходит распаковка генетического материала. По принципу обратной транскрипции с РНК-матрицы вируса с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируются молекулы кДНК (комплементарной ДНК). Синтезированная кДНК вставляется вирусной интегразой в геном клетки хозяина. После попадания в геном хозяина вирус может никак себя не проявлять до нескольких лет — протекает так называемый инкубационный период. Только когда клетки активно пролиферируют, а значит, синтезируют белки на матрице ДНК, начинается сборка вирусных частиц , выход их из клеток и гибель последних (так как каждая частица забирает с собой часть клеточной мембраны клетки, вирусы попросту разрывают клетку).

Рисунок 3. Строение ВИЧ. Белки gp120 и gp41 участвуют в рецепции вируса клеткой и проникновении вирусной частицы внутрь. Липидная оболочка захватывается от клетки хозяина вместе с частью мембранных белков. Белки матрикса синтезируются в клетке после встраивания кДНК в геном в момент наработки клеточных белков для деления. Протеаза, возможно, необходима для разрезания противоапоптотического фактора Bcl-2 [9]. Ферменты обратная транскриптаза и интеграза создают кДНК на матрице РНК и встраивают кДНК в геном Т-хелпера соответственно. Tat — белок, вовлеченный в индукцию апоптоза. Нуклеокапсид — комплекс из РНК и белков вируса, представляющий собой компактную упакованную форму генома. Капсид — белковая оболочка, защищающая содержимое от воздействия внешних условий.

Как иммунитет бактерий правит геномы

Система редактирования геномов CRISPR/Cas известна уже довольно давно (впервые локус описал в 1987 году Есизуми Исино из университета Осаки), но только недавно (в 2005 году) ученые поняли ее истинное предназначение [11], [12].

Как вы уже поняли, система состоит из двух компонентов: CRISPR-локуса (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats или сгруппированные и регулярно разделенные короткие палиндромные повторы) и белков Cas, которые, являются нуклеотид-специфичными эндонуклеазами (а название получили за работу в команде с CRISPR — Crispr associated).

Помимо CRISPR-локуса и блока генов Cas в ДНК бактерии (не обязательно в нуклеоиде [12]) находится ген tracrРНК (transactivated crispr RNA), частично комплементарной палиндромам.

Для формирования специфичной устойчивости к вирусу бактерия, как и человек, должна встретиться с ним дважды.

Первый раз после внедрения вирусной ДНК в клетку происходит разрезание ДНК белками Cas1 и Cas2 на протоспейсеры и встраивание их в начало CRISPR-локуса. Cas1 и Cas2 формируют при этом комплекс, причем Cas2 играет только структурную роль, удерживая ДНК, тогда как Cas1 встраивает ее. Каждый протоспейсер вставляется в CRISPR-локус так, чтобы от другого (уже имеющегося) спейсера его отделял палиндром.

Соответственно, после транскрипции ДНК всего комплекса образуются три продукта (рис. 4):

tracrРНК;
РНК белка Cas (наиболее изученным является Cas9, поэтому далее повествование пойдет о нем), далее транслирующаяся;
pre-crРНК (poly-spacer precursor crRNA или многоспейсерный предшественник crРНК), которая представляет собой транскрипт спейсеров, разделенных образовавшимися из палиндромов шпильками или петлями.

Рисунок 4. Строение CRISPR-локуса и результат транскрипции. leader — лидерная последовательность, отвечающая за начало транскрипции, со стороны которой вставляется новый спейсер. repeat — палиндромный повтор, который после транскрипции превращается в шпильку или петлю.

Второй этап — образование комплекса pre-crРНК/Cas9/РНКаза III. Очевидно, что вся длинная pre-crРНК не может участвовать в опознавании инвазивной ДНК, так как, во-первых, очень длинна, что конформационно неудобно, а во-вторых, при сравнении спейсеров РНК с протоспейсерами инвазивной ДНК длинный транскрипт начнет путаться и в итоге образует клубок, непригодный для дальнейшей работы. Самое логичное — разделить длинную последовательность на короткие участки, которые могли бы проверятся на соответствие инвазивной ДНК белком Cas9. И тащить за собой не надо, и не запутается.

С помощью фермента РНКазы III и при участии tracrРНК pre-crРНК разделяется по границам повторов так, что в белково-нуклеиновый комплекс входят один спейсер и один повтор, комплементарно связанный с tracrРНК (рис. 5) [13]. Повтор полностью теряет свою вторичную структуру, tracrРНК же оставляет несколько шпилек (обычно три).

Рисунок 5. Белково-нуклеиновый комплекс после созревания транскрипта. crРНК состоит из спейсера (слева) и повтора, соединенного с частью tracrРНК (справа). Три петли на tracrРНК нужны для удержания ее эндонуклеазой Cas9.

комплементарность спейсера комплекса Cas9/crРНК/tracrРНК протоспейсеру инвазивной (например, вирусной) ДНК;
наличие в геноме вируса около протоспейсера последовательности из трех нуклеотидов — РАМ (Protospacer Adjacent Motif, прилежащий к протоспейсеру мотив).

Таким образом клетка страхуется от уничтожения своей ДНК. Но даже просто разрезанная в одном месте вирусная ДНК может представлять опасность, поэтому завершает инактивацию негомологическое сращивание концов (non-homologous end joining, NHEJ). При этом происходит инсерция/делеция одного или нескольких нуклеотидов, что приводит к потере инфекционности.

Рисунок 6. Полная схема механизма работы CRISPR/Cas9 системы. а — Транскрипция CRISPR локуса с образованием pre-crРНК. б, в — Разрезание РНК РНКазой III и образование комплексов Cas9/tracrРНК/crРНК. г — Вторичное проникновение в клетку чужеродной ДНК. д — Соединение комплекса с инвазивной ДНК. е — Образование двухнитевого разрыва в протоспейсере.

А где же тут редактирование геномов? А вот где:

во-первых, таким образом можно просто нокаутировать целевой ген и добиться прекращения экспрессии того или иного белка;
во-вторых, после создания двухцепочечного разрыва в образовавшуюся брешь можно вставить нужный нам ген и заставить организм синтезировать нужный нам белок.

Рисунок 7. Сравнение искусственной (а) и естественной (б) систем CRISPR/Cas9. Отличие состоит лишь в том, что искусственная РНК едина, а природная — состоит из двух частей, гены которых разделены.

Битва века

Однако вернемся к теме этой статьи.

Так как система редактирования геномов может помочь в избавлении от ВИЧ? Очень просто: вирус можно вырезать! Нацелив Cas9, путем создания sgРНК с последовательностью, комплементарной вирусной кДНК.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa [15]. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации [16]. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте этого года статью [17], где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует.

Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

С помощью биоинформатических методов и анализа баз данных было показано, что sgРНК/Cas9 не проявляет активности по отношению к нецелевым сайтам.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.

Читайте также: