Туберкулез как в пробирку
Обновлено: 26.04.2024
Квантфивероновй тест (QuantiFERON®-ТВ Gold) – современный лабораторный тест для выявления туберкулезной инфекции, альтернатива классическому кожному тесту с туберкулином. В настоящий момент в различных странах разработано и выпущено большое число национальных рекомендаций по применению данного теста.
Квантифероновый тест основан на определении INF-γ (гамма-интерферона), высвобождаемого сенсибилизированными Т-клетками, стимулированными in vitro специфическими протеинами (ESAT-6, CFP-10, TB7.7 (p4)) микобактерий туберкулеза, входящих в комплекс Mycobacterium tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. canettii, M. caprae, M. pinnipedii, M. mungi, M. microti, M. africanum и др.). Эти протеины отсутствуют в вакцинных штаммах M. bovis BCG и в большинстве нетуберкулезных микобактерий, за исключением M. kansasii, M. szulagai, M. marinum.
В исследуемой крови пациента (из пробирки с ТВ-антигеном) определяется содержание INFγ, результат анализируется в совокупности с данными, полученными из 2-х других пробирок (выполняющих роль контрольных).
Примерно 1/3 часть населения мира инфицирована МБТ, и только у 5-10% инфицированных лиц развивается заболевание. При наличии неблагоприятных факторов латентная туберкулезаня инфекция (ЛТИ – состояние, когда микобактерии туберкулеза (МБТ) присутствуют в организме человека, но при этом отсутствуют клинические и рентгенологические признаки туберкулеза) может перейти в активную форму с развитием внелегочного туберкулеза (например, туберкулез почек).
К группе высокого риска инфицирования МБТ относятся лица, имевшие контакт с больным туберкулезом, или имеющие высокую вероятность контакта (работники противотуберкулезных диспансеров, приютов, исправительных учреждений и др.), а также лица с сопутствующими заболеваниями (ВИЧ-инфекцией, сахарным диабетом и др.).
Используемые для диагностики ЛТИ кожные тесты – проба Манту и Диаскинтест®, имеют ряд противопоказаний и ограничений к применению.
Противопоказания к проведению пробы Манту и Диаскинтеста:
- Индивидуальная непереносимость туберкулина;
- Острые и хронические инфекционные заболевания и соматические заболевания в период обострения;
- Кожные заболевания и аллергические состояния в период обострения;
- Период карантина в детских коллективах.
У пациентов с индивидуальной гиперчувствительностью к туберкулину может наблюдаться ложноположительная реакция.
Сравнение тестов для диагностики туберкулезной инфекции
Параметр | Проба Манту | Диаскинтест® | Квантифероновый тест |
---|---|---|---|
Метод исследования | Кожный тест | Кожный тест | Исследование крови |
Побочные реакции | Возможны | Возможны | Нет |
Противопоказания | Есть | Есть | Нет |
Специфичность | Низкая | Высокая | Высокая |
Ложноположительные результаты после вакцинации БЦЖ | Да | Нет | Нет |
Зависимость от сроков проведения профилактических прививок | Да (не ранее чем через месяц) | Да (не ранее чем через месяц) | Нет |
Интерпретация результатов | Субъективна | Субъективна | Объективна |
Преимущества квантиферонового теста:
- отсутствие противопоказаний и ограничений по времени проведения;
- отсутствие ложноположительных результатов в случае вакцинации БЦЖ;
- безопасность процедуры и отсутствие побочных реакций;
- интерпретация результатов этого теста менее субъективна, чем интерпретация результатов кожных туберкулиновых тестов;
- высокая специфичность (99,1%) и высокая чувствительность (89,0%).
Показания к назначению квантиферонового теста:
- Выявление ЛТИ в группах высокого риска: работники специализированных противотуберкулезных и других учреждений, где есть высокий риск контакта с возбудителем или больным туберкулезом, пациенты с сопутствующими заболеваниями и др.;
- Наличие известных контактов с больным туберкулезом (бактериовыделителем);
- Наличие положительной реакции пробы Манту для исключения поствакцинальной реакции;
- Наличие противопоказаний к проведению кожных туберкулиновых проб (пробы Манту и Диаскинтеста®);
- Дифференциальная диагностика инфекций, вызванных МБТ;
- Обследование иммигрантов.
Пример результата исследования и интерпретация:
Примечание: Данный тест не дифференцирует латентный и активный туберкулез. В случае положительного результата необходима консультация врача-фтизиатра для определения дальнейшей тактики. Величина уровня гамма-интерферона не коррелирует со стадией и степенью инфицирования, уровнем иммунной реактивности или вероятностью перехода латентного туберкулеза в активный.
Параметр | Результат | Критерии оценки результатов |
---|---|---|
Содержание гамма-интерферона в контрольной пробирке (NIL) | 0,05 | До 8,00 |
Содержание гамма-интерферона в пробирке с ТВ-антигеном (ТВ Ag) | 0,09 | Менее 0,35 (или свыше 0,35, но до 25% контрольного значения NIL) |
Содержание гамма-интерферона в пробирке с митогеном (Mitogen) | 9,56 | От 0,50 |
Квантифероновый тест (диагностика туберкулеза) | Отрицательный | Отрицательный |
Интерпретация результата исследования
- Инфицирование МБТ;
- Инфицирование нетуберкулезными микобактериями (M. kansasii, M. szulgai, M. marinum).
- Индивидуальные особенности иммунитета;
- Нарушение преаналитических требований.
В этом случае врач принимает решение либо в пользу забора нового образца крови, либо в пользу проведения других медицинских обследований.
- Не исключает инфицирования МБТ или туберкулеза.
- В ранние сроки инфицирования;
- При иммунодефицитных состояниях;
- У детей < 5 лет;
- При несоблюдении преаналитических требований.
Внимание! Интерпретация результатов должна проводиться с учетом клинико-эпидемиологического анамнеза и результатов других диагностических исследований.
Метод исследования: твердофазный иммуноферментный анализ.
Срок выполнения исследования: 3-10 рабочих дней.
Подготовка к проведению исследования: забор крови производят утром строго натощак (или не ранее, чем через 8 часов после последнего приема пищи).
Лабораторная диагностика туберкулеза. Выявление бактерий туберкулеза.
В распознавании и дифференциальной диагностике туберкулеза, а также в определении эффективности проводимого лечения важную роль играют лабораторные методы исследования. Среди них большое значение имеют прежде всего способы обнаружения микобактерии туберкулеза в различных выделениях, воспалительных экссудатах, жидкостях и тканях организма больного.
При туберкулезе легких микобактерии находят прежде всего в мокроте. Частота, массивность и постоянство бацилловыделения зависят от формы процесса. Оно часто имеет место при инфильтративном и особенно деструктивном туберкулезе легких. Реже или периодически выделяют микобактерии больные очаговыми, диссеминированными и цирротическими формами туберкулеза без явного распада легочной ткани. Существенное значение имеет при этом состояние бронхов. При их специфическом поражении, но сохраненной дренажной функции микобактерии выявляются с мокротой сравнительно чаще и с большим постоянством, чем при нормальном состоянии бронхов или при их стенозе, вызывающем блокаду каверны.
Микобактерии туберкулеза находят в большом количестве в обильно выделяющейся мокроте, а в скудном отделяемом, наоборот, они встречаются реже и в виде единичных экземпляров. У больных, не выделяющих мокроту, лучшие результаты дает применение раздражающих аэрозольных ингаля пий 10—15% раствора поваренной соли в 1% растворе питьевой соды Н. М. Рудой и соавт. (1971) применяют с этой целью смесь, состоящую из 5 мл 10% раствора хлорида натрия, 1 мл химопсина, растворенного в физиологическом растворе, и 20 капель солутана.
Второе место по эффективности выявления бацилловыделения у больных, не выделяющих мокроту, занимает исследование промывных вод трахеи и бронхов, которое предложил Я. С. Зобин (1939). В настоящее время для анестезии гортани у взрослых применяют 0,25% раствор дикаина, разведенный в 10% растворе новокаина. Этот раствор наливают во время фонации на голосовые связки в количестве 0,5—1 мл. У больных с повышенным глоточным рефлексом этим раствором смазывают заднюю стенку глотки. Затем в трахею шприцем с напаянной канюлей вводят 10—20 мл физиологического раствора комнатной температуры.
При этом в результате раздражения слизистой оболочки бронхов возникает кашель, при котором из глубоких дыхательных путей вместе с введенной жидкостью выделяются слизь и мокрота. Это отделяемое исследуют на присутствие микобактерии туберкулеза или другой микробной флоры.
Исследование промывных вод бронхов редко сопровождается серьезными осложнениями. Только при сильном, длительном и приступообразном кашле иногда появляется кровохарканье, может аспирироваться инфекционный материал в здоровые участки легочной ткани, нарастает сердечная недостаточность. Такие явления отмечаются главным образом у больных с сопутствующей бронхиальной астмой, пороком сердца, гипертонией. В подобных случаях, очевидно, не следует прибегать к данному методу исследования. При отсутствии таких противопоказаний, особенно у больных с ограниченными формами процесса, у которых чаще всего и возникает необходимость в исследовании промывных вод бронхов, обычно не наблюдается каких-либо осложнений, и поэтому его можно производить не только в клинических, но и в амбулаторных условиях.
Менее эффективно производимое натощак исследование промывных вод желудка, в которых может содержаться бациллярная мокрота или бронхиальная слизь, чаще заглатываемая детьми, а иногда и взрослыми (Аrmand-Dellille, 1927). Кроме того, микобактерии могут проникать в желудок через его слизистую оболочку при гематогенном распространении инфекции в организме, а также при забрасывании бациоллосодержащей желчи (М. Д. Розанова, 1950). Пользоваться этим методом рекомендуется в тех случаях, когда не удается получить мокроту при раздражающих ингаляциях, при противопоказаниях к применению промывания бронхов или при невозможности их проведения по другим причинам.
Наименее информативно определение бацилловыделения с помощью исследований мазков слизи из гортани, а также промывания только верхних отделов дыхательных путей.
У части больных можно выделить микобактерии из крови. По наблюдениям 49 авторов, обобщенным в 1954 г. Dalencour, бациллемия отмечалась в среднем у 5,3% больных различными формами туберкулеза. П. И. Беневоленский (1945) установил ее у 3,7% больных туберкулезом легких (исключая страдающих гематогенным процессом). Чаще обнаруживают микобактерии в крови при туберкулезе кожи, обширных гематогенных диссеминациях в легких, при менингите. Однако, по сводным данным Kallos (1937). основанным на изучении гемокультур, выделенных от 14 502 больных, туберкулезная бациллемия имела место всего лишь у 1,13% из них.
Частота выявления микобактерии зависит не только от формы заболевания, метода получения материала, но и от способа его исследования (бактериоскопия, посев, заражение животных). Микобактерии туберкулеза обнаруживают при прямой бактериоскопии мазков мокроты, окрашенных по Цилю—Нельсену, при микроскопии с использованием метода обогащения — флотации и люминесцентного способа исследования. Методы обогащения повышают частоту обнаружения микобактерии туберкулеза в мокроте, промывных водах желудка и бронхов, в экссудате, спинномозговой жидкости, в каловых массах на 10—20% по сравнению с результатами прямой бактериоскопии.
Среди бактериоскопических методов выявления бацилловыделения наиболее чувствительным является люминесцентная микроскопия, повышающая возможность обнаружения в мокроте микобактерии на 15—20% по сравнению с обычной бактериоскопией, а при исследовании мазков из флотационных колец — на 8—10%. При этом облегчается изучение некоторых биологических свойств возбудителя — старения культур, аутолиза клеток и др.
Некоторые авторы утверждают, что при флюоресцентной (люминесцентной) микроскопии микобактерии туберкулеза можно выявить даже чаще, чем при посевах мокроты и других материалов на различные питательные среды. Kolbel (1955) обнаружил их при простой бактериоскопии у 39,7% больных, при бактериологическом методе — у 52,1%, а при люминесцентной микроскопии — у 73,6%. На преимущество последнего метода указывают Т. Н. Ященко и И. С. Мечева (1973), Н. С. Страхов и соавт. (1973).
Для суждения об эффективности проводимой антибактериальной терапии придают прогностическое значение уменьшению (или сохранению) в динамике массивности бацилловыделения. Поэтому целесообразно не только констатировать бацилловыделение, но и оценивать его количественный показатель. При этом при бактериоскопии бацилловыделение оценивается как обильное, если находят микобактерии в каждом поле зрения, умеренное — при наличии «единичных микробов в 40—50 полях зрения и скудное — при нахождении их единичных экземпляров в препарате.
Диагностика туберкулеза. Принципы микробиологической диагностики туберкулеза. Выделение возбудителя туберкулеза.
Для диагностики туберкулёза применяют бактериоскопические, бактериологические, биологические, серологические и аллергологические методы, входящие в обязательный диагностический минимум. Материалом для исследований служат мокрота, отделяемое свищей, моча, СМЖ, испражнения.
Микроскопия возбудителя туберкулеза в патологическом материале. В мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену, обнаруживают кислотоустойчивые палочки возбудителя туберкулеза.
Нередко материал содержит мало бактерий туберкулеза и для повышения вероятности их обнаружения используют методы обогащения: центрифугирование и флотацию. В первом случае исследуемый материал обрабатывают смесью растворов NaCl и NaOH, центрифугируют и микроскопируют осадок. Второй метод включает обработку материала смесью NaOH, дистиллированной воды и ксилола (или бензола). Образец энергично встряхивают; образующаяся пена всплывает и захватывает микобактерии. Пену отсасывают и готовят мазки.
Наиболее результативна люминесцентная микросколия возбудителя туберкулеза. Материал обрабатывают аурамин-родамином и бактерии окрашиваются в бело-жёлтый цвет. Для выявления L-форм применяют AT, меченные флюорохромами.
Выделение возбудителя туберкулеза
Достоинство метода — возможность получения чистой культуры туберкулеза, позволяющая её идентифицировать, оценить вирулентные свойства и определить чувствительность к ЛС. Материал засевают, тщательно втирая, на твёрдые питательные среды.
Для повышения эффективности выделения возбудителя туберкулеза и уничтожения контаминирующей микрофлоры применяют методы обогащения или обрабатывают материал 6-12% серной кислотой. Основной недостаток бактериологического метода — длительность получения результата (от 2 до 12 нед). В связи с этим разработаны ускоренные микрометоды выделения возбудителя туберкулеза.
Один из распространённых методов выделения возбудителя туберкулеза, метод Прайса, заключается в следующем. Материал помещают на предметное стекло, обрабатывают серной кислотой, отмывают физиологическим раствором и вносят в питательную среду, дополненную цитратной лизированной кровью.
Стекло вынимают через 3-4 сут и окрашивают но Цилю-Нильсену. При микроскопии обнаруживают микроколонии микобактерии возбудителя туберкулеза. Вирулентные бактерии образуют змеевидные (рис. 22-2), а невирулентные — аморфные микроколонии. Культуры L-форм выделяют посевом в столбик полужидкой среды и инкубируют при 37 °С 1-2 мес.
Рост проявляется в виде облачка помутнения с мелкими вкраплениями. Вирулентность выделенной культуры возбудителя туберкулеза определяют заражением лабораторных животных и по наличию корд-фактора. Последний легко идентифицируют по способности микобактерии связывать нейтральный красный и нильский голубой и удерживать их после добавления щелочи. Вирулентные штаммы возбудителя туберкулеза удерживают красители, авирулентные — нет.
Обзор
Автор
Редакторы
Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.
Тем не менее диагностика — это еще не диагноз, и результат любого теста не является истиной в последней инстанции. Диагноз же по-прежнему ставят, исходя из нескольких составляющих:
- клинической картины;
- наличия контакта с туберкулезным больным;
- рентгенографии легких, флюорографии или компьютерной томографии;
- результатов диагностических тестов.
Однако большинство этих методов диагностируют туберкулез постфактум — только скрининговые тесты помогают выделить лиц с высоким риском развития заболевания или с только зарождающимся процессом. И уже более 100 лет основным методом массовой диагностики туберкулеза является туберкулиновая проба Манту 2 ТЕ (содержащая 2 туберкулиновые единицы). Тест спорный, со множеством ложноположительных результатов, но именно его используют во всем мире и отказываться пока не собираются.
Проба Манту
В мире используют 3 вида туберкулина (рис. 1): датский препарат PPD (purified protein derivative) RT 23, американский PPD-S и российский — PPD-L. Различаются они видами микобактерий, из которых были получены: при производстве датского и американского препаратов используют только M. tuberculosis, а при производстве российского — смесь из M. tuberculosis и M. bovis (микобактерии, вызывающей туберкулез у крупного рогатого скота; на основе этого штамма была разработана вакцина БЦЖ). Различие в составах туберкулина обусловливает разные границы положительного результата: 15 мм для детей, привитых БЦЖ, и не более 10 мм для непривитых детей до 5 лет у датского препарата, не более 10 мм у американского и 5 мм у российского [4].
Рисунок 1. Препараты туберкулина
Диагностику с помощью пробы Манту проводят следующим образом: небольшое количество туберкулина вводят под кожу чуть выше запястья и через 72 часа оценивают реакцию, которую считают положительной, если в месте введения появляется припухлость (папула) более 5 мм в диаметре. В зависимости от ее размера, различают степень реакции от отрицательной (0–1 мм) до резковыраженной, или гиперергической (17 мм и более у детей и подростков, 21 мм и более у взрослых) [5]. И тут начинаются трудности, потому что у привитых БЦЖ реакция Манту положительна [6]! Мало того, чем больше поствакцинальный рубец, тем выше чувствительность к туберкулину [7]. Поэтому у привитых БЦЖ оценивают не только диаметр папулы, но и размер поствакцинального рубчика (табл. 1).
Срок, прошедший с момента вакцинации БЦЖ | Размер рубчика после БЦЖ | Привитый иммунитет (мм) | Неясная причина | Подозрение на инфицирование |
---|---|---|---|---|
1 год | 6–10 мм | 5–15 мм | 16 мм | Более 17 мм |
2–5 мм | 5–11 мм | 12–15 мм | Более 16 мм | |
0 мм | 2–4 мм | 5–11 мм | Более 12 мм | |
2 года | Вне зависимости от размера | Уменьшение размера папулы или прежний ее размер | Увеличение размера на 2–5 мм от предыдущего положительного результата | Реакция изменяется на положительную или папула увеличивается более чем на 5 мм |
3–5 лет | Вне зависимости от размера | 5–8 мм либо уменьшение размера папулы | Увеличение размера на 2–5 мм за последний год или отсутствие тенденции к уменьшению | Изменение на положительную (5 мм) реакцию или увеличение папулы на 6 мм; 12 мм при впервые поставленной пробе; изменение предыдущего размера на 2–4 мм или размер в 12 мм |
6–7 лет | Вне зависимости от размера | 0–4 мм | 5 мм | 6 мм и более |
7–9 лет | Если в 7 лет ребенку была сделана ревакцинация БЦЖ, реакция Манту вновь становится положительной и нормы повторяются | 0–4 мм | 5 мм | 6 мм и более |
Взрослые | Отрицательная реакция, покраснение любого диаметра; папула до 4 мм | Более 5 мм |
Безусловно, метод оценки результата довольно субъективный. Но главное, папулу надо еще правильно измерить, зафиксировав только размер выпуклой части и игнорируя покраснение вокруг нее (рис. 2).
Рисунок 2. Правильная и неправильная оценки диаметра папулы
Еще одна трудность с диагностическими возможностями пробы Манту связана с тем, что они зависят от нижней границы положительного результата: чем ниже граница, тем больше будет наблюдаться ложноположительных реакций. К примеру, в России пороговым значением является папула в 5 мм. Это приводит к гипердиагностике — большому количеству зафиксированных реакций, но в итоге к низкому проценту реально выявленных случаев инфицирования [4].
В общем, не удивительно, что в последнее время информативность туберкулиновой пробы постоянно ставится под сомнение. Мало того, она может вызывать не связанные с туберкулезом аллергические реакции, поэтому все больше здоровых, но склонных к аллергии детей вынуждены идти в тубдиспансер в надежде выяснить причину положительной реакции. И наконец, на результат пробы может влиять множество факторов: недавно перенесенные инфекции, хронические заболевания, прием медикаментов, изменение гормонального фона или иммунитет к нетуберкулезным микобактериям [7].
Если говорить о достоинствах пробы Манту, то кроме низкой себестоимости, ими будут возможность выявления туберкулеза на ранних стадиях развития (за исключением лиц с иммуносупрессией и маленьких детей до двух лет [7]) и более высокая диагностическая ценность у непривитых БЦЖ по сравнению с привитыми (от 50% и ниже против 65,4% [6], [9]).
Мифы о пробе Манту
Рисунок 3. Антигены ESAT-6 и CFP-10
Что нужно знать о кожных пробах?
Анализы крови на туберкулез: плюсы и минусы
- в ранние сроки инфицирования;
- при иммунодефицитных состояниях;
- при неправильном заборе крови или ее транспортировке;
- из-за ошибок во время расшифровки результатов.
Добавлю, что тесты IGRA требуют наличия качественного оборудования, специальных реактивов и квалифицированного персонала, поэтому себестоимость у них довольно высока.
Кроме того, по сравнению с кожными тестами существенным недостатком этих анализов является определение in vitro только образования гамма-интерферона или активности Т-клеток. Поэтому в странах с высокой заболеваемостью (а Россия, несомненно, в их числе с показателем более 50 больных на 100 000 населения [13]) у IGRA-анализов нет никаких дополнительных преимуществ [12]. Тем более что их способность диагностировать туберкулезный процесс колеблется в районе 42–90% для разных возрастных групп, к тому же они не маркируют латентное носительство [12]. Другими словами, для жителей нашей страны анализы крови на туберкулез в общем-то напрасная трата денег, хотя в странах с низкой заболеваемостью (США, Канада, Западная Европа) они более информативны и рекомендованы к замене туберкулиновых проб для привитых БЦЖ [14].
В мире живет более полумиллиарда латентных носителей M. tuberculosis. Причем, далеко не каждый из них в итоге заболевает, потому что размножение микобактерии сдерживает иммунная система. Например, из 100 инфицированных палочкой Коха детей, лишь у одного развивается активная форма туберкулеза, поэтому диагностические тесты направлены не только на выявление латентных носителей, но и на оценку риска развития заболевания [15].
Анализы крови vs кожные тесты: сравнение эффективности
При оценке эффективности тестов для диагностики туберкулеза чаще всего учитывают два параметра: чувствительность (sensitivity) и специфичность (specificity). Под чувствительностью понимают способность метода выявлять лиц с заболеванием или носителей с высоким риском развития туберкулеза. Под специфичностью — способность теста правильно идентифицировать людей, у которых нет туберкулеза (то есть этот параметр характеризует риск появления ошибочных ложноположительных результатов) [12].
Какой тест все-таки выбрать?
Как говорится, при всем богатстве выбора альтернатив немного. К сожалению, при выборе теста многие руководствуются не его диагностическими характеристиками, а безвредностью для здоровья, потому что фенол в составе кожных проб пугает многих. И существует даже движение против пробы Манту, группа поддержки которого периодически предлагает заменить ее анализами крови IGRA. Но, как было отмечено выше, у подобных страхов нет никаких оснований. В придачу, являясь продуктом жизнедеятельности организма, фенол не накапливается, а выводится вместе с мочой. Поэтому главными критериями все-таки являются чувствительность и специфичность тестов.
Читайте также: