Иммунохроматографические тесты к вирусам

Обновлено: 26.04.2024

Тестирование на COVID-19 не только помогает получать информацию о распространенности вируса, но также дает представление о том, как вирус распространился и накопил ли он потенциально значимые мутации. Многие методы тестирования основаны на анализе нуклеиновых кислот. Хотя эти подходы бесценны и позволяют определить активную инфекцию, они не дают полной картины. Как мы можем узнать, заразился ли кажущийся здоровым пациент вирусом? Что, если бы у этого человека не было симптомов носительства, и его обследовали после того, как инфекция прошла? Ответы на эти вопросы может помочь получить экспресс-тест на антитела к коронавирусу.

Что такое экспресс-тест на коронавирус и в чем его отличие от ПЦР

Молекулярное тестирование, включая тестирование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), выявляет генетический материал вируса и, таким образом, может определить, инфицирован ли человек SARS-CoV-2 в настоящее время. Серологический анализ, к которым относятся экспресс-тесты, выявляет антитела к вирусу, измеряя количество антител, вырабатываемых после инфицирования, тем самым выявляя, был ли человек ранее инфицирован SARS-CoV-2. Серологические тесты не следует использовать для диагностики острой инфекции SARS-CoV-2, поскольку антитела вырабатываются через несколько недель после заражения.

Что такое IgA, IgG, IgM

Серологические тесты, к которым относится экспресс-тест, — это тесты на основе крови, которые можно использовать для определения того, подвергались ли люди воздействию определенного патогена, по их иммунному ответу. Напротив, тесты ПЦР, которые в настоящее время используются во всем мире для диагностики случаев COVID-19, могут указывать только на присутствие вирусного материала во время инфекции и не указывают, был ли человек инфицирован и впоследствии выздоровел. Эти тесты могут дать более подробную информацию о распространенности заболевания в популяции путем выявления людей, у которых выработались Ig к вирусу.

Экспресс-тесты используется для выявления следующих антител:

IgG — это самый распространенный изотип антител (около 70-75%) в крови. IgG преимущественно отвечает за длительный иммунитет после инфекции.
IgM составляет около 10% антител в крови и сначала вырабатывается в ответ на острую инфекцию.
IgA составляет еще около 10% антител в крови и в первую очередь отвечает за защиту поверхностей слизистых оболочек, поэтому он может быть особенно важен при COVID-19.

Тестирование на все три Ig улучшило информативность результатов по сравнению с любым тестом на одно антитело. Этот тип теста на COVID-19 подтверждает, были ли вы ранее инфицированы SARS-CoV-2. Это исследование не подтверждает, что вы полностью невосприимчивы к COVID-19, поскольку в настоящее время нет доказательств того, что люди не могут заразиться коронавирусом более одного раза. Кроме того, тест на Ig к COVID-19 не показывает, инфицированы ли вы в настоящее время коронавирусом. Если вы хотите узнать, инфицированы ли вы в настоящее время COVID-19, вам нужно пройти диагностику методом ПЦР.

Как интерпретировать результаты экспресс-теста?

Проведение экспресс-тестирования — возможность получить достоверные результаты о наличии циркулирующих антител в крови. Есть 4 возможных результата диагностики:

IgM отрицательный, IgG отрицательный. Нет никаких доказательств текущей инфекции или предыдущей инфекции. Помните, что с момента появления симптомов проходит минимум 4 дня или 7 дней с момента контакта с вирусом, прежде чем антитела окажутся положительными. Это означает, что исследование на Ig не может обнаружить инфекцию на начальных стадиях. Если, несмотря на этот результат, есть подозрение на недавнее заражение, можно провести ПЦР-тест или повторить тест на антитела через несколько дней.
IgM положительный, IgG отрицательный: Это говорит о заражении на ранних стадиях заболевания. Если результат не совпадает с клинической картиной (например, нет симптомов), это могло быть ложноположительным. Результат может быть подтвержден с помощью ПЦР-теста или, если диагностика проводилась экспресс-тестом на антитела, с помощью теста ИФА, который является более надежным и использует другой метод.
IgM-положительный, IgG-положительный: Это говорит о наличии инфекции в промежуточной стадии заболевания. Инфекционность, вероятно, будет низкой.
IgM отрицательный, IgG положительный. Идет выздоровление и пациент не заразен. Может быть выявлен иммунитет к Covid-19, хотя пока неизвестно, в какой степени и как долго этот иммунитет может сохранять свою эффективность для реализации иммунного ответа после повторного проникновения вируса в организм. Меры предосторожности все же следует принимать.

Можно ли делать экспресс-тестирование на ковид дома?

Проведение диагностики с использованием иммунохроматографического анализа возможно и в домашних условиях. Для этого не требуются специальные знания, поскольку к каждому диагностическому набору прилагается краткая инструкция, в которой указано всего несколько действий, позволяющих получить быстрый результат. В большинстве комплектов содержится полоска, пипетка, буферный раствор и скарификатор для прокола кожи. Как правило, исследуемому нужно нанести на полоску каплю крови, а после — несколько капель буфера и подождать, пока уровень жидкости достигнет индикаторов для получения ответа.

С чем связана недостоверность результатов

Негативный результат ИХА экспресс-тестов не всегда отражает реальную картину, поскольку их чувствительность значительно ниже, нежели у ИФА.

Отрицательный результат может означать, что вы:

Не подвергались воздействию вируса, вызывающего COVID-19.
Подверглись воздействию, но иммунная система еще не начала вырабатывать антитела (их активный синтез начинается на 5-6 день после заражения).
У вас слишком низкий уровень антител, поэтому их невозможно обнаружить с помощью иммунохроматографического анализа. Например, потому что вы недавно перенесли инфекцию и еще не выработали антитела, или потому что инфекционный процесс протекал давно и уровни антител успели снизиться.

Кому стоит сделать тест на антитела к коронавирусной инфекции

Экспресс-тест на антитела к коронавирусу — простой метод диагностики, который отличается:

невысокой стоимостью;
высокой точностью;
отсутствием серьезной подготовки (в сравнении с ПЦР);
предоставлением информации о наличии иммунитета после инфекционного заболевания;
возможностью проведения диагностики на дому.

Проведение этого вида диагностики рекомендовано людям, у которых более 5 дней назад наблюдались симптомы ОРВИ, и тем, кто был в контакте в зараженными коронавирусом, но в течение 14 дней симптомы инфекционного заболевания так и не проявили себя.

Что делать, если результат теста положительный

Позитивный результат означает, что на момент тестирования в вашем организме циркулируют антитела, которые образовались в ответ на заражение коронавирусом. Для получения подробных данных о состоянии иммунной системы рекомендуется дополнительно пройти ИФА диагностику для количественного определения антител острой фазы воспаления. Желательно воспользоваться проведением исследования на дому.

Для получения дополнительной информации о том, что нужно делать вам, всем, с кем вы живете, и всем, кто находится в вашем кругу общения, обратитесь за помощью к вашему врачу и после консультации выполните все инструкции, которые он вам предоставил.

Иммунохроматографическая экспресс-диагностика (ИХЭД) – новый высокотехнологичный метод, позволяющий вне лабораторных условий и в течение 5-20 минут не только точно диагностировать большой спектр самых серьезных патологий (инфаркт миокарда, опасные инфекции, воспалительные процессы, онкозаболевания, гормональные нарушения и др.), но и оценивать степень их тяжести. Широкое применение ИХЭД позволяет обнаруживать заболевания на ранней стадии и предотвращать их развитие, особенно это касается опухолей простаты и осложнений сахарного диабета. Некоторые из этих тестов настолько просты, что могут проводиться в домашних условиях.

Во-вторых, когда есть хотя бы малейшие подозрения на серьезную инфекцию, развитие которой может быть опасным не только для пациента, но и для окружающих. Тесты однозначно и быстро обнаруживают антиген возбудителя или антитела, выработанные в ответ на него. Нет нужды говорить, насколько важно быстро определить наличие: антигенов вируса гепатита В, антител к вирусам гепатитов В и C, ВИЧ 1 и ВИЧ 2, вирусу Эпштейна-Барра (инфекционный мононуклеоз) и к другим, пусть менее опасным, но весьма распространенным вирусам.

Чувствительность теста на антиген вируса гепатита В – до 0,5 нг/мл, время определения - 20 мин. Чувствительность теста на антитела к вирусу гепатита В – 30мМЕ/мл, время определения – 10-15 мин, возможно тестирование капиллярной крови. Тест полезен для определения статуса пациента перед прививкой от гепатита В. Тесты на антитела к вирусу гепатита С и ВИЧ 1,2 имеют 100% корреляцию по чувствительности и специфичности с другими международно признанными тестами, время определения – 10-15 мин. Возможно использование капиллярной крови.

Некоторые тесты, такие как тесты на ротавирус, аденовирус или респираторный синцитиальный вирус (РСВ), позволяют своевременно выявить заболевание в детских коллективах, в родильных домах или стационарах и принять немедленные противоэпидемические меры.

Чувствительность и специфичность теста на антиген аденовируса в фекалиях на 100% совпадает с результатами иммуноферментного анализа, время определения – 15 мин. Чувствительность и специфичность теста на антиген ротавируса в фекалиях – 100% относительно FUMOUZE латекс-теста, время определения – 15 мин. Чувствительность теста на РСВ в назофарингиальных мазках относительно иммунофлюоресцентного теста составляет 85,7%, специфичность – 91,6%, время определения – 15 мин.

Трудно переоценить значение тестов на наличие антител и/или антигенов, свидетельствующих о сифилисе, туберкулезе, хламидиозе, стрептококках А и В, о поражении желудочно-кишечного тракта клостридийным токсином или бактерией Helicobacter pylori. Кроме того, все эти тесты можно использовать в качестве дополнительных методологически независимых подтверждающих тестов.

Чувствительность теста на IgG, gA и IgМ к туберкулезной бацилле (350 МЕ/мл) подобрана таким образом, чтобы кровь здоровых вакцинированных людей не давала ложноположительных результатов теста. Тест может быть весьма полезен для диагностики нелегочных форм туберкулеза, таких как костный туберкулез, туберкулез внутренних органов и туберкулез гениталий. Специфичность – 92,8%, время определения – 10-15 мин. Возможно тестирование капиллярной крови.

Чувствительность и специфичность теста на IgG, gA и IgМ антитела к Т.pallidum в сыворотке – 100% относительно традиционных тестов, время определения – 10-15 мин.

Тест на хламидийный антиген в мазках из цервикального канала или уретры имеет 93% чувствительность и 99,7% специфичность по сравнению с ПЦР-диагностикой, время определения – 20 мин. Возможно применение этого теста не только для выявления Chlamydia trachomatis, но и для обнаружения Chlamydia pneumonia в мокроте.

Тест на стрептококк А в мазке из зева имеет 91,8% чувствительность и 97,7% специфичность от культурального метода. Время определения – 5-10 мин. Тест может использоваться и в домашних условиях.

Тест на стрептококк в вагинальных мазках имеет 88,4%, чувствительность и 97,9% специфичность от культурального метода. Время определения – 5-10 мин. Тест полезен для выявления инфицированных рожениц.

Тест на IgG к Helicobacter pylori имеет чувствительность 10-15 Ед/мл и специфичность 100%. Время определения – 10-15 мин. Возможно использование капиллярной крови..

Тест на клостридийный токсин А в фекалиях весьма полезен для выявления антибиотикосвязанной диарреи. Выявление токсина имеет явное преимущество перед выделением возбудителя, так как не все штаммы клостридии патогенны. Чувствительность – 86,7%, специфичность – 91,7%, время определения – 15 мин.

При ведении больных с сахарным диабетом одна из главных проблем – вовремя распознать возникновение и развитие диабетической нефропатии, последствия которой могут быть самыми тяжелыми. Ее индикатор – альбумин в моче в диапазоне 20-200 мг/мл (микроальбуминурия). Однако микроальбуминурия характерна и для пациентов со стойкой гипертензией, она также предсказывает тяжелые осложнения беременности (эклампсию и преэклампсию) и является важнейшим показателем при посттрансплантационном наблюдении пациентов с пересаженной почкой. Высокочувствительные тесты на микроальбумин (качественный и полуколичественный) могут применяться даже самим пациентом в домашних условиях.

Полуколичественный скрининговый экспресс-тест на альбумин в моче имеет 3 варианта результатов: до 10 мг/л, от 10 до 20 мг/л и свыше 20 мг/л. Тест активен в широком диапазоне pH (2.5-9.5). Отсутствуют перекрестные реакции с билирубином, гемоглобином, иммуноглобулинами. Время определения – 5-10 мин. Эффекта прозоны нет. (Прозона – ситуация, в которой из-за избытка антигена или недостатка антител количество образовавшихся комплексов антиген-антитело не соответствует истинной концентрации антигенов.)

ИХЭД позволяет выявить иммунный статус пациента прямо на приеме у врача с помощью тестов на иммуноглобулин Е.

Тест на сывороточный иммуноглобулин Е имеет чувствительность 150 МЕ/мл и специфичность 90,9%. Эффекта прозоны нет до 32000 МЕ/мл. Время определения – 5-10 мин.

Для эндокринологов весьма важны экспресс-тесты на тиреотропный гормон (в цельной и капиллярной крови, в сыворотке или в плазме). У этого ИХЭД-теста есть детская и взрослая версии (с разными пороговыми уровнями), он позволяет провести скрининг функции щитовидной железы прямо на приеме у врача.

Взрослая версия теста имеет пороговую чувствительность 5 мкМЕ/мл, детская – 10мкМЕ/мл. Специфичность 97,3%, перекрестных реакций с гормонами роста, плацентарным лактогеном и хориогонадотропным гормоном нет. Время определения – 10 мин.

Весьма важны и актуальны тесты на гормоны для акушерства и гинекологии. Это тесты на хорионгонадотропин (в моче или сыворотке крови), позволяющие выявить беременность уже в первый день задержки цикла, на лютеинизирующий гормон (в моче) для определения точного времени овуляции, на фолликулостимулирующий гормон (в моче) и пролактин (в сыворотке крови). Существенно, что эти тесты можно проводить самостоятельно в домашних условиях.

Чувствительность теста на ХГЧ – 5 мМЕ/мл в сыворотке, 10 мМЕ/мл в моче. Специфичность – 100%, перекрестных реакций не наблюдается. Время определения – 5 мин. Эффекта прозоны нет до 1 млн мМЕ/мл.

Чувствительность теста на лютеинизирующий гормон – 30 мМЕ/мл, при более низких концентрациях ЛГ также возможно его обнаружение. Специфичность – 100%, нет перекрестных реакций с другими гормонами и продуктами их метаболизма. Эффекта прозоны нет. Время определения – 5 мин.

Чувствительность теста на ФСГ – 25 мМЕ/мл, специфичность – 100%, перекрестных реакций с другими гормонами и продуктами их метаболизма нет. Эффекта прозоны нет. Время определения – 10 мин.

Чувствительность теста на пролактин – 37 нг/мл (800 мМЕ/л). Специфичность – 100%, перекрестных реакций с гормонами роста и плацентарным лактогеном нет. Эффекта прозоны нет. Время определения – 5-10 мин.

Весьма важны тесты на онкомаркеры. Это тесты на альфа-фетопротеин, на ферритин, позволяющий выявить наличие анемии при скрытых кровотечениях, на скрытую кровь в фекалиях.

И, пожалуй, один самых важных тестов – на простатоспецифический антиген (ПСА) (в сыворотке, плазме и цельной крови), который можно проводить и в домашних условиях. Своевременное и регулярное применение этого теста позволяет практически на 100% избежать негативных последствий весьма распространенных опухолей простаты, рост заболеваемости которыми наблюдается во всем мире. Этот тест должен регулярно проходить каждый мужчина старше 50 лет. В странах ЕС он проводится в каждой аптеке, и это помогает выявлять патологии предстательной железы на ранней стадии. К несчастью, в России диагноз рак простаты в большинстве случаев ставится на последней, IV стадии заболевания.

Тест на альфафетопротеин имеет пороговую чувствительность 10 нг/мл. Время определения – 10 мин.

Ферритин можно определять по капиллярной крови Чувствительность теста 20 нг/мл. Время определения – 10 мин.

Тест для определения наличия скрытой крови в фекалиях имеет широкий диапазон чувствительности – от 40 мкг до 120 мг гемоглобина на грамм фекалий. Время анализа 10 мин.

Тест на ПСА имеет пороговый уровень определения 4 нг/мл и время определения – 10 мин.

Рис. 1. Тест-кассета на ПСА, общий вид. Размеры 65×27×5 мм.

Насколько точно работает ИХЭД. Чтобы ответ был очевиден – несколько слов, как работают иммунохроматографические тесты. Хотя внешне пластинки выглядят весьма просто, это – результат самых современных технологий получения моноклональных и поликлональных антител к специфическим иммуноглобулинам человека, к рекомбинантным антигенам возбудителей заболеваний и применения сорбентов с улучшенными свойствами.

Рис. 2. Устройство тест-кассеты.

Образец (цельная кровь, сыворотка, плазма, моча, экстракт мазков или фекалий), нанесенный на подложку, движется по мембране и доходит до зон, где находятся специфически связывающиеся агенты (антитела или антигены). В этих зонах происходит специфическое связывание тестируемого белка (антигена), находящегося в образце со специфическими антителами к нему (конкретная информация – в инструкциях к каждому тесту).

Рис. 3. Ридер для количественных экспресс-тестов. Размеры 20×20×7 см.

Один из мировых лидеров в разработке ИХЭД – французская компания VEDALAB. Разработанные этой фирмой количественные тестовые кассеты и ридеры определяют постепенное увеличение интенсивности окраски в диапазоне от нулевой до максимальной, пропорционально концентрации антигена.

Использование таких количественных кассет и ридеров позволяет за 15-20 минут получить количественную характеристику степени тяжести ОИМ. Навряд ли можно переоценить значение количественной экспресс-диагностики кардиомаркеров: миоглобина, МВ-изофермента креатинкиназы, тропонина I, проводимое прямо на месте острого коронарного события. Имея количественный результат, врач может сразу и самостоятельно оценить и риск, и степень поражения сердечной мышцы и определить время, прошедшее после ОИМ, если он действительно был.

Количественный экспресс-тест на так называемый D-Димер, оценивающий работу системы гемостаза, может применяться прямо в операционной, а регулярная количественная экспресс-диагностика СРБ позволит следить за динамикой воспалительного процесса и оценивать эффективность его терапии.

Для адекватной оценки степени тяжести сахарного диабета неоценима количественная экспресс-диагностика уровней гликозилированного гемоглобина (свидетельствует об истинной концентрации глюкозы в крови), а регулярное количественное тестирование микроальбумина позволит вовремя увидеть начало диабетической нефропатии и оценить ее динамику. Весьма эффективны количественные тесты на ТТГ и пролактин. Аномально высокие уровни пролактина могут быть связаны как с первичным гипотиреозом, так и с мужским и женским бесплодием и мужской импотенцией, что важно знать специалистам по репродуктивному здоровью.

Как говорилось, качественная экспресс-диагностика на ПСА проводится в аптеках большинства европейских стран. А вот во Франции практически все аптеки оснащены ридерами для количественной оценки уровня ПСА. Не напрасная ли это трата денег? Широкомасштабные исследования, проведенные в Швеции (Malmo Preventive Project, 1974-1986 гг.) показали: в возрасте 44-50 лет даже небольшое повышение ПСА, до 1,01-2,0 нг/мл, увеличивает риск рака простаты в 7 раз (в контрольной группе ПСА – ниже 0,5 нг/мл). В целом, регулярное (1 раз в год) количественное определение ПСА позволяет своевременно определить начало заболевания и практически на 100% гарантировать успех лечения.

Можно так же можно количественно определять и такие онкомаркеры, как раковый эмбриональный антиген и альфа-фетопротеин. Информация об уровне ХГЧ может быть полезна не только для диагностики беременности, но и для выявления некоторых онкологических заболеваний. Количественное определение иммуноглобулина Е позволяет оценить тяжесть состояния больных с аллергией.

В целом, иммунохроматографическая экспресс-диагностика, особенно количественная, позволяет проводить вне лаборатории анализы практически лабораторного качества. И более того, она удобно умещается в саквояже семейного доктора. И работает быстро и точно.

Синонимы: Мазок из носо- и ротоглотки для определения антигена SARS-CoV-2; Выявление антигена SARS-CoV-2 в мазках носоглотки или ротоглотки (качественно); Качественное определение антигена коронавируса SARS-CoV-2 в мазках со слизистой оболочки рото-/носоглотки.

Краткая характеристика вируса SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 − тяжелого острого респираторного синдрома коронавирус 2) – официальное наименование вируса, вызвавшего эпидемию COVID-19.

COVID-19 (coronavirus disease 2019 − коронавирусная болезнь 2019) – название болезни, которую индуцирует новый вид коронавируса.

Источником передачи инфекции SARS-CoV-2 является, в основном, больной человек, в том числе находящийся в инкубационном периоде заболевания, составляющем от 2 до 14 (в среднем 5-7) дней. Клинические проявления могут быть неспецифичными симптомами ОРВИ (чаще – повышение температуры, сухой кашель, затруднение дыхания). Дополнительные эпидемиологические признаки − подтвержденный либо вероятный контакт с больными COVID-19, а также проявления в виде пневмонии с характерными изменениями в легких по данным компьютерной томографии (КТ), свидетельствуют о высокой вероятности COVID-19.

С какой целью используют исследование антигена вируса SARS-CoV-2

Как и исследование вирусной РНК методами ПЦР, определение антигена SARS-CoV-2 в мазках со слизистых оболочек носо- или ротоглотки методами иммуноанализа наиболее информативно в первые 1-5 дней от начала клинических проявлений инфекции (реже до 10 дней). На более поздних сроках инфекции (после 1-2 недель от начала клинических проявлений) становится информативным исследование крови для выявления специфических антител к SARS-CoV-2.

Для оценки аналитической специфичности проводились анализы на образцах, полученных у пациентов с положительными результатами анализов на наличие патогенных агентов, вызывающих острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) у людей, методом ПЦР в реальном времени.

Исследованы положительные образцы, содержащие вирус гриппа типа А, вирус гриппа типа В, метапневмовирус, респираторно-синцитиальный, риновирус, вирус парагриппа, аденовирус и бокавирус. Кроме того, были исследованы патогены бактериальной природы: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Streptococcus pneumoniae.

Результаты анализов, проведенных с использованием набора реагентов, свидетельствуют об отсутствии перекрестных реакций. Интерференция не наблюдалась при исследовании образцов, содержащих интерферирующие вещества в указанных концентрациях: присутствие муцина (до 5% по объему) или цельной крови (до 5% по объему) в мазках из носоглотки и/или ротоглотки не влияют на результат анализа.

Чувствительность метода, применяемого в исследовании на Антиген SARS-CoV-2 в мазке из рото- или носоглотки, качественный

Что может повлиять на результат исследования антигена вируса SARS-CoV-2

Характеристики исследования во многом зависят от качества взятия биоматериала: соблюдения правил, указанных в инструкции, для получения мазка со слизистой нужной локализации, обеспечения сохранности аналита при хранении и доставке в лабораторию, исключения вероятности внешнего загрязнения.

К преимуществам ИХА следует отнести:

● быстроту и легкость в использовании;

● малые объемы образца, отсутствие пробоподготовки;

● дешевизну для производителя и потребителя;

● возможность производства тестов в больших объемах;

● простоту чтения и интерпретации результата;

● высокую чувствительность и вопроизводимость;

● возможность количественного определения;

● возможность использования портативных ридеров, совместимых с компьютером;

В связи с большим количеством преимуществ по сравнению с другими скрининговыми методами, ИХА получил широкое применение
и находится на первом месте на мировом рынке диагностики. ИХА применяется в различных областях медицины и народного хозяйства:

● банки крови и плазмы;

● промышленность (контроль качества, безопасности, идентификация продукта, эко-контроль);

● сельское хозяйство, агрономия;

Тест-полоски для ИХА являются чрезвычайно удобными и простыми в использовании, однако они имеют сложное строение и процесс разработки каждого вида ИХА является чрезвычайно трудоемким и высокотехнологичным.

Рис. 13. Схематическое изображение иммунохроматографической тест-полоски

Метод ИХА, так же как и ИФА, имеет несколько форматов. Наиболее распространены 2 схемы: прямой (сэндвичный) и непрямой конкурентный метод.

Рис. 14. Схема прямого (сэндвичного) ИХА

Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, в т.ч. ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний.

Схема сэндвичного ИХА не подходит для определения низкомолекулярных веществ, т.к. для образования сэндвича Ат-Аг-Ат антиген должен иметь по крайней мере две антигенные детерминанты (т.е. центра связывания с антителами). Кроме того, из-за стерических затруднений образование такого двойного комплекса с низкомолекулярным антигеном маловероятно. Поэтому для анализа небольших молекул, в том числе наркотических веществ, используется другая схема – непрямой конкурентный ИХА.

Метод конкурентого ИХА основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране с конъюгатом (рис. 15). Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где на иммобилизован конъгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.

При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг:белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа (рис. 15). Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Схема оценки результатов ИХА наркотических веществ представлена на рис. 16. Результат теста является недействительным при отсутствии контрольной линии, т.к. этот факт может свидетельствовать о незавершенной процедуре анализа, либо о том, что иммунохимическая реакция не прошла должным образом по какой-либо причине (из-за испортившихся иммунореагентов или несоблюдения инструкции по применению теста).

Рис. 15. Схема конкурентного ИХА

Рис. 16. Схема оценки результатов ИХА метаболитов наркотических веществ

Часто, особенно в случаях когда недоступны большие количества биообразца для анализа, например, для определения наркотических веществ в слюне, используются тест-полоски в пластиковой кас-
сете (рис. 17).

Рис. 17. Пластиковый корпус иммунохроматографического теста

В качестве меток в ИХА используются различные частицы, обладающие следующими свойствами:

1. Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное рефлектометрическое определение (например, сканирование). Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса, позволяет проводить мильтианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота, которые образуют линии темно-бурого (или темно-розового) цвета.

2. Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминисцентные метки, ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.

3. Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.

4. Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.

5) Новым направлением в разработке различных разновидностях ИХА является использование липосом в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, электроактивных и пр.) [17].

Разработка технологических стадий иммунохроматографического анализа является наукоемким, высокотехнологичным и многостадийным процессом: он включает в себя подбор материалов, реагентов и условий проведения анализа на нескольких этапах разработки ИХА. Перечислим основные этапы разработки:

● выбор материалов для производства тест-полосок;

● подбор оптимальных концентраций иммунореагентов: конъюгатов Ат-метка, конъюгатов антиген-белок-носитель, антивидовых антител;

● подбор дополнительных реагентов для предобработки компонентов тест-полоски (позволяет улучшить свойства потока, и тем самым обеспечить лучшую чувствительность теста);

● оптимизация условий проведения анализа реальных образцов;

● изучение стабильности тест-системы, выбор условий хранения и упаковки для увеличения срока хранения тестов.

На рис. 18 представлена схема производства иммунохроматографических тестов. На каждом этапе данной технологической схемы должна быть произведен выбор материалов и реагентов, оптимизация условий проведения технологической стадии.

Все компоненты тест-полоски (фильтр, мембрана с конъюгатом, хроматографическая мембрана, мембрана абсорбции, см. рис. 13) приклеиваются на пластиковую подложку. Подложка – это лист, состоящий из пластика и имеющий клейкое покрытие. При выборе подложки необходимо обращать внимание на качество клея (это может напрямую влиять на характеристики хроматографической мембраны, которая будет приклеена на подложку) и удобство покрывающей пленки (что обеспечивает точность приклеивания компонентов полоски на подложку).

При выборе материала фильтра для образца необходимо руководствоваться теми функциями, которые должен выполнять фильтр:

● впитать достаточное количество образца и доставить его в мембрану для конъюгата;

● довести рН образца до оптимального;

● увеличить или уменьшить вязкость образца для достижения оптимальной скорости прохождения образца по хроматографической мембране;

● увеличить способность образца растворить конъюгат;

● уменьшить забивку мембраны за счет добавления забивки в прокладку для образца.

Рис. 18. Схема стадий производства иммунохроматографических тестов

Хроматографическая мембрана – самый важный элемент иммунохроматографической полоски. Именно на ней проходит иммунохимическая реакция, происходит разделение и связывание иммунореагентов в тестовой и контрольной зонах. Мембрана является самой длинной зоной тест-полоски, именно здесь иммунореагенты проходят максимальный путь в латеральном потоке. При выборе материала для хроматографической мембраны необходимо руководствоваться следующими свойствами, которыми должна обладать мембрана:

1. Гидрофильность – необходима для возможности прохождения потока (а это водная среда) через мембрану. Обеспечивается выбором материала, а также использованием ПАВ.

Рис. 19. Диполи нитроцеллюлозы и белков

При производстве мембран для ИХА используются следующие материалы: нитроцеллюлоза (наиболее распространенный материал, используется в 99 % выпускаемых тест-полосок); нейлон; поливинилиденфторид; полиэфирсульфон; стекловолокно.

При выборе материала мембраны необходимо руководствоваться следующими ее физическими параметрами, которые характеризуют свойства латерального потока, проходящего через данную мембрану:

● толщина мембраны, ее объем слоя;

● пористость, размер и распределение пор;

● номинальная скорость потока;

● прочность (предел прочности на разрыв);

● качество поверхности: неровности, порошок и пыль, оставшиеся на поверхности после производства материала.

Все перечисленные характеристики формируют в конечном итоге главный параметр иммунохроматографической мембраны – скорость латерального потока, определяющий все основные параметры ИХА (рис. 20).

Рис. 20. Влияние скорости потока на характеристики анализа

Все вышеописанные подробности приведены для того, чтобы дать представление о сложности процесса разработки и производства на первый взгляд простых тест-полосок. Для того чтобы получить действительно работающий качественный тест, необходимо очень тщательно пройти все стадии разработки и наладки производства. К сожалению, не все нынешние производители это делают на должном уровне, экономя средства для достижения минимальных цен на рынке. В результате мы имеем общепринятое мнение о неточности ИХА тестов. В то же время качественный ИХА тест может иметь характеристики не хуже, чем тест-система для приборного метода ИФА [17].

Современные материалы и возможности тщательного подбора условий при производстве ИХА тестов позволяют разработать даже количественные варианты ИХА. В этом случае детекция результата осуществляется с помощью специальных считывающих устройств – ридеров для ИХА. В зависимости от типа метки, данные устройства осуществляют различные способы детекции: рефрактометрический, флуоресцентный, магнитный (рис. 21).

Рис. 21. Считывающие устройства для детекции результатов ИХА

Рис. 22. Автоматическая платформа для производства ИХА полосок

Количественный формат ИХА характеризуется гораздо большими требованиями к качеству тест-полосок, и, следовательно, к контролю качества каждой стадии производства тестов. Кроме качества материалов и реагентов, на каждой стадии производства необходимо четко, с высокой точностью, контролировать температуру, влажность, концентрацию реагентов, скорость подачи материалов, давления прессов и т.д. Только в этом случае можно получить количественный ИХА тест. Столь высокие требования возможно выполнить только с использованием специальных закрытых, полностью автоматизированных платформ, в которых каждый из параметров контролируется и поддерживается с высокой точностью (рис. 22).

Читайте также: