Методы культивирования вирусов индикация и идентификация вирусов

Обновлено: 25.04.2024

1. Представителей царства вирусов характеризует все, кроме:

  1. отсутствие роста и бинарного деления
  2. один тип нуклеиновой кислоты
  3. наличие ядерной мембраны
  4. способность репродуцироваться из одной нуклеиновой кислоты
  5. абсолютный паразитизм

2. Царство вирусов включает вирусоподобные структуры, кроме:

  1. плазмиды (эписомы, эпивирусы)
  2. дефектные (интерферирующие)
  3. вироиды
  4. прионы
  5. хромосомы

3. Плазмиды как вирусоподобные структуры представляют собой:

  1. двунитчатые кольцевые ДНК, реплицируемые клеткой
  2. свободную инфекционную нуклеиновую кислоту, устойчивую к действию высокой температуры и УФ облучению
  3. вирус, содержащий вместо вирусной нуклеиновой кислоты нуклеиновую кислоту клетки- хозяина
  4. вирусоподобную белковую или полисахаридную структуру, устойчивую к действию высокой температуры, УФ облучению, радиации и нуклеаз

4. Вироиды как вирусоподобные структуры представляют собой:

  1. двунитчатые кольцевые ДНК, реплицируемые клеткой
  2. свободную инфекционную нуклеиновую кислоту, устойчивую к действию высокой температуры и УФ облучения
  3. вирус, содержащий вместо вирусной нуклеиновой кислоты нуклеиновую кислоту клетки - хозяина
  4. вирусоподобную белковую или полисахаридную структуру, устойчивую к действию высокой температуры и УФ облучения, радиации, нуклеаз

5. Прионы, как вирусоподобные структуры представляют собой:

  1. двунитчатые кольцевые ДНК, реплицируемые клеткой
  2. свободную инфекционную нуклеиновую кислоту, устойчивую к действию высокой температуры и УФ облучения
  3. вирус, содержащий вместо вирусной нуклеиновой кислоты нуклеиновую кислоту клетки - хозяина
  4. вирусоподобную белковую или полисахаридную структуру, устойчивую к действию высокой температуры и УФ облучения, радиации, нуклеаз

6. Необычные вирусы (вирусоподобные структуры) - вироиды и прионы могут вызывать, кроме:

  1. медленные вирусные инфекции
  2. болезнь Крейцфельда - Якоба
  3. скрепи (губкообразные спонгиоформные энцефалопатии животных и человека)
  4. ПСПЭ (подострый склерозирующий панэнцефалит)

7. Дефектные вирусы (дефектные интерферирующие частицы - ДИ частицы) представляют собой:

  1. двунитчатые кольцевые ДНК, реплицируемые клеткой
  2. свободную инфекционную нуклеиновую кислоту, устойчивую к действию высокой температуры и УФ облучения
  3. вирус, содержащий вместо вирусной нуклеиновой кислоты нуклеиновую кислоту клетки- хозяина
  4. вирусоподобную белковую или полисахаридную структуру, устойчивую к действию высокой температуры и УФ облучения, радиации, нуклеаз

8. Размеры вирионов варьируют:

  1. от 15-18 нм до 300-400 нм
  2. от 0,2 мкм до 1,5 мкм
  3. от 0,2 мкм до 150 мкм

9. Самые крупные вирусы (300-400 нм):

  1. вирусы группы оспы (поксвирусы)
  2. вирусы полиомиелита
  3. Коксаки, ЭКХО
  4. гепатита А
  5. риновирусы (пикорнавирусы)
  1. вирусы группы оспы (поксвирусы)
  2. вирусы полиомиелита, Коксаки, ЭКХО, гепатита А, риновирусы (пикорнавирусы)
  3. вирус гриппа, парагриппа

11. В структуру простого вируса входит:

  1. ДНК или РНК
  2. капсид, состоящий из капсомеров
  3. внешняя оболочка (наружная оболочка, суперкапсид, пеплос)

12. В структуру сложного вириона входит:

  1. ДНК или РНК
  2. капсид, состоящий из капсомеров
  3. внешняя оболочка (наружная оболочка, суперкапсид, пеплос)
  4. капсула

13. К простым вирусам относятся:

  1. вирусы полиомиелита, Коксаки, ЭКХО
  2. гепатита А
  3. гепатита В
  4. вирусы гриппа, парагриппа, RS, кори
  5. аденовирус

14. К сложным вирусам относятся:

  1. вирусы полиомиелита, Коксаки, ЭКХО
  2. гепатита А
  3. гепатита В
  4. вирусы гриппа, парагриппа, RS, кори
  5. аденовирус
  6. вирусы группы оспы, герпеса

15. Структура капсида вириона может иметь типы симметрии:

16. Тип симметрии вируса – это:

  1. форма вируса
  2. расположение белковых субъединиц капсида (капсомеров) вокруг нити нуклеиновой кислоты
  3. чередование нуклеотидов в НК вируса

17. Спиральный (винтовой, геликоидальный) тип симметрии капсида вириона – это:

  1. расположение капсомеров вокруг НК в виде многогранника
  2. когда капсомеры следуют за витками нуклеиновой кислоты
  3. расположение капсомеров в одной части вириона в виде многогранника, в другой - в виде спирали

18. Кубический (изометрический, кубоидальный, квазисферический) тип симметрии - это:

  1. расположение капсомеров вокруг НК в виде многогранника
  2. когда капсомеры следуют за витками нуклеиновой кислоты
  3. расположение капсомеров в одной части вириона в виде многогранника, в другой - в виде спирали

19. Двойной (смешанный, бинарный) тип симметрии - это:

  1. расположение капсомеров вокруг НК в виде многогранника
  2. когда капсомеры следуют за витками нуклеиновой кислоты
  3. расположение капсомеров в одной части вириона в виде многогранника, в другой - в виде спирали

20. Спиральный тип симметрии капсида имеют:

  1. аденовирус
  2. вирус гриппа
  3. вирус полиомиелита, Коксаки, ЭКХО
  4. бактериофаг (вирус бактерий)

21. Кубический тип симметрии капсида имеют:

  1. аденовирус
  2. вирус гриппа
  3. вирус полиомиелита, Коксаки, ЭКХО
  4. бактериофаг (вирус бактерий)

22. Смешанный тип симметрии имеют:

  1. аденовирус
  2. вирус гриппа
  3. вирус полиомиелита, Коксаки, ЭКХО
  4. бактериофаг (вирус бактерий)

23. Особенность химического состава вирусов:

  1. наличие ферментов гликолитического пути расщепления глюкозы
  2. наличие одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК)

24. В состав вирусов могут входить следующие нуклеиновые кислоты, кроме:

  1. однонитевые РНК, ДНК
  2. двунитевые РНК, ДНК
  3. линейные РНК, ДНК
  4. кольцевые РНК, ДНК
  5. фрагментированные РНК
  6. денатурированная ДНК

25. РНК содержат:

  1. вирусы гриппа, парагриппа, кори,RS
  2. вирус гепатита А
  3. вирус гепатита В
  4. вирусы полиомиелита, Коксаки, ЭКХО
  5. аденовирусы
  6. вирус оспы, герпеса, цитомегалии
  7. ВИЧ

26. ДНК содержат:

  1. вирусы гриппа, парагриппа, кори, RS
  2. вирус гепатита А
  3. вирус гепатита В
  4. вирусы полиомиелита, Коксаки, ЭКХО
  5. аденовирусы
  6. вирус оспы, герпеса, цитомегалии
  7. ВИЧ

27. Позитивный РНК- геном (РНК+) вируса:

  1. представлен одиночными цепочками и упаковывается в капсид с образованием дочерней популяции
  2. не способен транслировать генетическую информацию
  3. является информационной РНК (передает информацию на рибосомы)

28. Негативный РНК- геном (минус РНК) вируса:

  1. представлен одиночными цепочками и упаковывается в капсид с образованием дочерней популяции
  2. не является информационной РНК
  3. является матрицей для синтеза мРНК

29. РНК+ (позитивный РНК - геном) содержат:

30. Негативный РНК- геном содержат:

31. Различают белки вирусов, кроме:

  1. структурные
  2. неструктурные
  3. капсидные
  4. белок А клеточной стенки
  5. суперкапсидные

32. Структурные капсидные и суперкапсидные вирусные белки выполняют ряд функций, кроме:

  1. защищают вирусный геном от неблагоприятных внешних воздействий
  2. ответственны за узнавание (“адресную“ функцию) и адсорбцию на специфических рецепторах клетки
  3. участвуют в слиянии с клеточной мембраной и обеспечивают проникновение вириона в клетку
  4. обеспечивают рост вируса
  5. образуют “внутренние” рибо- и дезоксирибонуклеопротеиды, обладающие антигенными свойствами
  6. входят в состав гликопротеидов внешней оболочки с антигенными свойствами

33. Ферменты вирусов:

  1. участвуют в метаболических реакциях с образованием АТФ
  2. участвуют в репликации и транскрипции вирусных геномов
  3. участвуют в проникновении вирусной нуклеиновой кислоты в клетку хозяина и выходе образовавшихся вирионов

34. Вирионные ферменты- это:

  1. ферменты, структура которых закодирована в вирусном геноме
  2. ферменты, входящие в вирион и обнаруженные у многих вирусов
  3. клеточные ферменты, активность которых модифицируются в процессе репродукции вируса

35. Вирусиндуцированные ферменты- это:

  1. ферменты, структура которых закодирована в вирусном геноме
  2. ферменты, входящие в вирион и обнаруженные у многих вирусов
  3. клеточные ферменты, активность которых модифицируются в процессе репродукции вируса

36. Углеводы и липиды вирусов:

  1. входят в состав капсидной оболочки
  2. входят во внешнюю оболочку
  3. ассоциированы с НК

37. В основу классификации вирусов положены следующие свойства, кроме:

  1. тип нуклеиновой кислоты
  2. молекулярно-биологические признаки нуклеиновых кислот: молекулярная масса, количество нитей, сегментарность и др.
  3. наличие внешней оболочки
  4. диаметр нуклеокапсида
  5. количество капсомеров
  6. антигены, резистентность к детергентам
  7. наличие или отсутствие пептидогликана и диаминопимелиновой кислоты в оболочке
  8. сегментарность и полярность НК

38. Вирусы, вызывающие инфекции с преимущественным поражением кишечника:

  1. энтеровирусы (вирус полиомиелита, Коксаки, ЭКХО)
  2. ротавирусы
  3. вирус гепатита А

39. Вирусы, вызывающие преимущественно нейроинфекции – это все, кроме:

  1. энтеровирусы
  2. вирус бешенства
  3. вирус клещевого энцефалита
  4. ВИЧ

40. Вирусы, передающиеся половым путем – это все, кроме:

  1. ВИЧ
  2. вирус простого герпеса 2 (ВПГ-2)
  3. арбовирусы

41. Группа арбовирусов объединяет вирусы:

  1. передающиеся членистоногими
  2. размножающиеся в организме членистоногих
  3. передающиеся половым путем

42. Взаимодействие вируса с клеткой и процесс репродукции включает стадии, кроме:

  1. адсорбции
  2. хемотаксиса
  3. транскрипции, трансляции информационных РНК и репликации вирусных геномов
  4. сборки вириона
  5. выхода вирусных частиц из клетки
  6. проникновения вируса в клетку
  7. “раздевания” вирионов

43. Проникновение вируса в клетку хозяина происходит различными путями, кроме:

44. Взаимодействие вируса с клеткой на стадии выхода из клетки:

  1. сопровождается деструкцией (лизисом) клетки и выходом вируса во внеклеточное пространство
  2. осуществляется путем почкования
  3. осуществляется путем слияния вирусных и клеточных мембран

45. Вирусы возможно культивировать:

  1. в куриных эмбрионах
  2. в культурах клеток
  3. в синтетической питательной среде 199
  4. в организме лабораторных животных

46. Индикацию вирусов в культуре клеток проводят с помощью различных методик, кроме:

  1. реакции гемадсорбции
  2. РИФ
  3. выявления ЦПД вируса
  4. обнаружения включений в клетках
  5. обнаружения бляшек на ХАО (хорионаллантоисная оболочка)
  6. ИФА, РИА
  7. бляшкообразования на клеточном монослое под агаровым покрытием (по Дальбекко)

47. Перевиваемыми культурами клеток называют:

  1. диплоидные клетки человека, сохраняющие в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом
  2. культуры клеток адаптированные к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro и сохраняющиеся на протяжении нескольких десятков пассажей (теоретически неограниченное количество пассажей)
  3. культуры клеток, способные выдерживать небольшое (2-3) количество пассажей in vitro

48. Полуперевиваемыми культурами клеток называют:

  1. диплоидные клетки человека, сохраняющие в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом
  2. культуры клеток адаптированные к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro и сохраняющиеся на протяжении нескольких десятков пассажей (теоретически неограниченное количество пассажей)
  3. культуры клеток, способные выдерживать небольшое (2-3) количество пассажей in vitro

49. Первичными культурами клеток называют:

  1. диплоидные клетки человека, сохраняющие в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом
  2. культуры клеток адаптированные к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro и сохраняющиеся на протяжении нескольких десятков пассажей (теоретически неограниченное количество пассажей)
  3. культуры клеток, способные выдерживать небольшое (2-3) количество пассажей in vitro

50. Первичные культуры клеток – это:

51. Перевиваемые линии культур клеток – это:

52. Питательные среды, используемые для выращивания культур клеток:

53. Вирусная инфекция на клеточном уровне может быть:

  1. продуктивной цитолитической с образованием инфекционного потомства - лизисом клетки и выходом вирионов во внеклеточную среду
  2. продуктивной нецитолитической с образованием инфекционных вирусных частиц без лизиса клетки, которая продолжает функционировать
  3. интегративной (интеграционной вирогенией, интрагеномным носительством) интеграции вирусной ДНК или РНК с клеточным геномом
  4. абортивной, при заражении клеток дефектным вирусом, в результате чего инфекционные вирусные частицы не образуются или образуются в меньшем количестве
  5. генерализованной

54. Возможные последствия инфекционного процесса, вызванного вирусами для клетки – это все, кроме:

  1. сохранение жизнеспособности клетки
  2. деструкция клетки, возникающая при цитолитической инфекции (цитопатогенное действие вируса - ЦПД)
  3. образование вирусных внутриклеточных включений
  4. образование многоядерных клеток в результате их слияния (симпластообразование)
  5. образование в клетке ретикулярных (инициальных) телец
  6. онкогенная трансформация клетки при интеграции вирусного генома с геномом клетки (вирогении, интегративной инфекции)

55. Особенности неспецифической противовирусной защиты организма в отличие от антибактериальной заключаются в участии различных факторов, кроме:

  1. интерферона
  2. термолабильных противовирусных ингибиторов
  3. фагоцитоза
  4. естественных клеток- киллеров (ЕКК)

56. Особенности иммунитета при вирусных инфекциях заключаются:

  1. в существенном участии секреторных антител класса А, обеспечивающих местный иммунитет во входных воротах инфекции
  2. в более важной роли клеточного иммунитета с участием Т- лимфоцитов и макрофагов
  3. в участии фагоцитоза и опсонинов
  4. в способности паразита вызывать иммунодефицитные состояния, ”ускользать” от иммунологического надзора особой локализацией в организме, что приводит к его персистенции, несмотря на наличие антител

57. Уровень секреторного иммуноглобулина А в фекалиях и смывах из носа у детей первого года жизни:

58. Способность к образованию интерферона у детей раннего возраста:

59. Трансплацентарно к плоду переходят иммуноглобулины матери класса:

60. В женском молоке наиболее высокая концентрация иммуноглобулинов класса:

61. Интерферон- это:

  1. лизосомальный фермент
  2. гормон
  3. белок клетки, образующийся при взаимодействии с интерфероногеном (вирусом и др.) и защищающий клетки от вируса
  4. белок, образующийся плазмоцитами в ответ на действие антигена
  5. лимфокин, усиливающий хемотаксис нейтрофилов

62. Интерферон защищает клетку от вирусной инфекции путем:

  1. нейтрализациии вируса
  2. опосредованно прерывая информацию от генома вируса на рибосомы
  3. активируя вируснейтрализующее действие антител

63. Различают следующие классы интерферонов, кроме:

  1. a - интерферон
  2. b -интерферон
  3. g - интерферон
  4. эндогенный интерферон

64. Для лабораторной диагностики вирусных инфекций используют все методы, кроме:

  1. вирусоскопию (обнаружение элементарных телец, внутриклеточных включений, РИФ, ИЭМ)
  2. вирусологический метод (выделение, культивирование вирусов в курином эмбрионе, в культуре клеток, заражением лабораторных животных)
  3. серологический метод
  4. реакцию Видаля, Райта
  5. выявление вирусных антигенов с помощью высокочувствительных реакций (ИФА, РИА, РПГА, ВИЭФ, РП)
  6. нуклеиновые зонды, ПЦР

65. Для проведения вирусоскопического метода диагностики требуется:

  1. 1-2 часа
  2. 1-2 суток
  3. 3-5 суток до 1 месяца
  4. 2-3 недели

66. Цитопатогенное действие (ЦПД) вируса в культуре клеток можно выявить микроскопией в сроки:

  1. 1-2 часа после заражения
  2. 3-5 суток после заражения и до 1 месяца
  3. 24-48 часов после заражения

67. Для проведения диагностики вирусных инфекций с помощью нуклеиновых зондов, ПЦР требуется:

  1. 1-2 часа
  2. 24-48 часов
  3. 3 - 5 суток и до 1 месяца
  4. 2- 3 недели

68. Для проведения вирусологического метода диагностики требуется:

  1. 1-2 часа
  2. 24-48 часов
  3. 3 - 5 суток и до 1 месяца

69. Экспресс- методом диагностики вирусных инфекций является:

  1. вирусологический метод
  2. вирусоскопия (реакция иммунофлюоресценции - РИФ, иммунная электронная микроскопия - ИЭМ, обнаружение элементарных телец, включений)
  3. серологический метод с парными сыворотками больного
  4. нуклеиновые зонды, ПЦР

70. Экспресс-методами индикации вирусов в материалах от больных, в объектах окружающей среды, для которых требуется не более 2- х часов можно считать

Для индикации вирусов в инфекционном материале могут быть использованы следующие методы и критерии:

Микроскопический: обнаружение вирусных включений в препаратах, окрашенных но Муромцеву, Морозову, Романовскому, Пигаревскому, Павловскому, обработанные флюорохромами.

Вирусологическое выделение вирусов в культурах клеток, в развивающихся куриных эмбрионах, на лабораторных животных (состояние, симптомы).

В культуре тканей: реакция гемаглютинации (РГА), реакция гемадсорбции (РГадс), цитопатогенное действие (ЦПД), цветная проба, метод бляшек.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью серологических (иммунологических) методов:

реакция торможения гемагглютинации (РТГА),

реакция торможения гемадсорбции (РТГадс),

реакция связывания комплемента (РСК),

реакция нейтрализации цитопатогенного действия (РН),

реакция иммунофлюоресценции прямая и непрямая (РИФ, РНИФ),

реакция преципитации в геле (РП),

реакция нейтрализации цветной пробы.

Приложение 4

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

Берут 7-11 дневные куриные эмбрионы, проверяют их жизнеспособность на овоскопе, на нем же у эмбриона простым карандашом обводят воздушную камеру - главный ориентир для последующих манипуляций.Стерильным тампоном с йодом протирают верхнюю (тупую) часть яйца, затем 60° спиртом.

Заражение невскрытого эмбриона

А) В хорион аллантоисную полость: Делают по границе воздушной камеры яйца под углом 45° к его поверхности на глубине 0,3-0,5 см. После введения вирусного материала отверстие заливают расплавленным парафином, и эмбрион в специальных лотках помещают в термостат-инкубатор приt° +40; +42С° и влажности в 60 %.

Б) В амнион и куриный зародыш:Инфицируют толстой тупой иглой для спинномозговыхпункций. Манипуляцию выполняют в темной комнате под контролем глаза, осторожно упираясь в эмбрион.

После заражения отверстие парафинируют, а инкубацию эмбриона продолжают.

Заражение вскрытого эмбриона:

Выполняют после снятия изогнутыми ножницами крышки яйца над его воздушной камерой, которую снимают очень осторожно.

А) Заражение в амниотический мешок выполняют после его подтягивания стерильным пинцетом.

Б) Заражение в желточный мешок проводят также.

В) обоих случаях дефект в скорлупе яйца закрывают: либо возвращением снятого тупого конца скорлупы, либо крышечкой от стеклянного бюкса. Их края для приданиягерметичности заливают парафином. Помещают в термостат-инкубатор.

Контрольные наблюдения ведут по критериям:

подвижность эмбриона, как показатель жизнеспособности;

появление на оболочках эмбриона бляшек с просяное зерно из внутриклеточных вирусных включений;

общепринятая индикация и идентификация вируса (Приложение 3).

Приложение 5

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ С РАЗНЫМ ГЕНОМОМ


ДНК- геномные цитоплазматические (вирус натуральной оспы)


Адсорбция на клетке- виропексис


Депротеинизация, освобождение генома

Стратегия вирусного генома (СВГ)

Все этапы в цитоплазме клетки


Репродукция ДНК (с участием эндорепликазы)


Трансляция на рибосомы


Выход из клетки

Синтез вирусного белка


Эндогенная (вирусная) транскриптаза


Транскрипция

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки-хозяина


ДНК -геномные ядерные (вирус герпеса)


Адсорбция на клетки -виропексис


Депротеинизация. Освобождение генома

СВГ


Редупликация ДНК в ядре клетки хозяина


Разобщенный (дизъюнктивный) синтез


Репродукция ДНК в ядре клетки с участием экзорепликаз

Сборка вириона в цитоплазме

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки


Экзогенная транскрипция (клеточная)


И-РНК транскрипция


Трансляция на рибосомы

Итак, синтез идёт по схеме: ДНК РНК белок


РНК-геномные минуснитевые (вирус гриппа)


Адсорбция на клетке- виропексис


Депротеинизация. Освобождение генома

СВГ


Редупликация ДНК


И-РНК


Экзогенная транскриптаза


М-РНК

М-РНК + репликативная форма

Синтез вирусного белка на рибосоме



+РНК


Сборка вириона

+РНК выполняет функции И- РНК


Трансляция на рибосомы

Синтез вирусного белка

Итак, синтез идет по схеме РНК РНК белок


РНК геномные + нитевые


Адсорбция


Депротеинизация

СВГ

Функции И-РНК выполняет +РНК нить


+РНК

Трансляция на рибосомы



Синтез вирусной репликазы (эндорепликазы)


Матрица для образования +нитей ДНК

Синтез вирусного белка


Итак, синтез идет по схеме: РНК белок


ДНК онкогенные вирусы


Адсорбция


депротеинизация


Интеграция в геном ДНК клетки хозяина


Редупликация ДНК


И-РНК


Белок вирусный

Итак, синтез идет по схеме: ДНК РНК белок


РНК онкогенные вирусы (обратная транскрипция)


Адсорбция- виропексис


Депротенизация


РНК (одна нить)


В вирионе формируется РНК зависимая ДНК полимераза

Синтез двунитчатой ДНК (провирус)

СВГ


Редупликация ДНК


Сборка вириона созревание на мембранах клетки


Трансляция ДНК (провируса при участии РНК- полимеразы клетки)

Лабораторные исследованияпри проведении идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций включают следующие этапы: выделение, культивирование, индикация (выявление) и идентификация вирусов.

2.3.1 Культивирование вирусов

Вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно. Крупным достижением было предложение Р. Гудпасчура в 1932 г. использовать для культивирования вирусов куриные эмбрионы. Окончательное решение проблемы культивирования вирусов оказалось возможным лишь после того, как были разработаны основные способы культивирования клеток вне организма.

Использование куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы – практически идеальные модели для культивирования не­которых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проник­новению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирова­ния и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбу­дители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распозна­вать заболевание).

Для заражения обычно используют куриные эмбрионы 7–12-дневного возраста. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона путем овоскопирования (просматривают в проходящем свете). Живые эмбрионы при овоскопировании проявляют двигательную активность, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом очерчивают границы воздушной камеры.

Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим материалом в асептических условиях стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом. Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость, либо в желточный мешок (рисунок 29). Выбор метода заражения зависит от биологических свойств вируса.


Рисунок 29 – Схематическое изобра­жение развивающегося куриного эмбриона

Культура клеток. Вначале был использован метод переживающих тканей. Он заключался в том, что в колбу, содержащую питательную среду, вносили кусочек ткани. Клетки некоторых тканей в таких условиях могут пережи­вать (но не размножаться) до 30 дней, а в них могут размножаться вирусы. Однако этот способ давал очень небольшой выход вирусов. Необходимо было разработать условия, при которых клетки ткани могли бы свободно размножаться.

Для получения культур клеток необхо­димо было решить четыре главных задачи:

– получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;

– создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;

– обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;

– определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.

Для выделения изолированных (разобщенных), но жизнеспособных клеток из разрушенных тканей, стали использовать обработку их слабым раствором трипсина, разрушающего межкле­точные мостики. Для культивирования клеток были предложены различные среды, содержащие все необходимые для размножения клеток питательные вещества (аминокислоты, основания, витамины и другие), минеральные соли, имеющие оптимальную рН и т. д. К питательным средам добавляли индикатор, по изменению цвета которого можно было судить о метаболизме клеток и их размноже­нии. Было установлено, что в качестве основы, на которой клетки размножаются и образуют монослой, может быть использовано хорошо обработанное стекло пробирок и колб. Для подавления возможного роста бактерий вируссодержащий материал перед посевом его в культуры клеток стали обраба­тывать антибиотиками.

В 1949 г. Дж. Эндерс, Т. Веллер и Ф. Роббинс показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян. Основной недостаток первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после нескольких пересевов они перестают размножаться. Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бесконечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток (клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом) получают из опухолевых тканей (HeLa получена из карциномы шейки матки, НЕр-2 – из карциномы гортани; Детройт-6 – из метастаза рака легкого в костный мозг; RН – из опухоли почки человека) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромосом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких контаминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требованиям отвечают культуры диплоидных клеток.




Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток – клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать 50–100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Как оказалось, вирусы могут размножаться не только в культурах клеток, образующих монослой на стекле пробирок, но и в суспензиях живых клеток.

Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.

2.3.2 Выделение вирусов

Выделение вирусов в культурах клеток. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов (кровь, моча, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающих наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл взвеси исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Выделение вирусов на лабораторных животных. При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили кле­точные культуры. Тем не менее животные модели активно используют для изучения особенно­стей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.

Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в лабораторных условиях в настоящее время используются следующие живые объекты (биологические модели): 1) культура клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

2.3.3 Индикация вирусов

Индикация вирусов в культурах клеток. Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить:

1) развитие специфической дегенерации клеток – цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: крупно- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток (гроздевидная дегенерация клеток).

Различают два механизма гибели клеток, вызываемой вирусами, – некроз и апоптоз. Некроз происходит из-за необратимых нарушений целостности клеточных мембран, апоптоз – вследствие фрагментации ядерной ДНК под действием клеточной эндонуклеазы.

Цитопатические эффектыоценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью:

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гемагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс). Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепто­рами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках куль­туры тканей);

4) феномен бляшкообразования. Широкое распространение получил предложенный в 1952 г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при 37 °С. Через 48–96 ч выявляются пятна – бляшки. Они имеют диаметр 1–3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия вируса;

5) цветная реакция Солка. О росте вирусов в клетках можно судить с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый;

6) реакция интерференции (используется при отсутствии ЦПД, гемагглютинации и гемадсорбции): исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительна). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток могут быть использованы различные серологические реакции.

Индикация вирусов на лабораторных животных. Индикация вируса основана на обнаружении у животных признаков инфекционного заболевания, регистрации их гибели, изучении характера патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, выявлении положительной реакции гемагглютинации.

2.3.4 Методы идентификации вирусов

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активно­сти вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация цитопатического действия: в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1–2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус. При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим антителам примененной сыворотки;

2) нейтрализация реакции гемадсорбции;

3) изменение проявления цветной пробы;

4) задержка (торможение) реакции гемагглютинации: смешивают культуральную среду, со­держащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

5) нейтрализация в опытах на животных.

Таким образом РН (реакция нейтрализации) основана на подавлении соответствующей реакции, феномена, развития инфекционного процесса после внесения в культуру или введения в организм животного смеси вируса со специ­фичными AT, содержащимися в диагностической сыворотке.

Вопросы для самоконтроля

1 Назовите основные принципы классификации вирусов.

2 Приведите русские и латинские названия основных семейств вирусов человека и животных.

3 Назовите типовых представителей основных семейств вирусов и заболевания, вызываемые ими.

4 Каковы особенности морфологии и ультраструктуры вирусов человека и животных (основных семейств)?

5 Назовите РНК-геномные и ДНК-геномные фитовирусы.

6 Какие этапы включают в себя лабораторные исследования при идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций?

7 Какие биологические модели используются для выделения и культивирования вирусов человека и животных?

8 Как происходит заражение куриных эмбрионов в лабораторных условиях?

9 Какие методы получения культуры клеток вы знаете?

10 Как проводят идентификацию вирусов в курином эмбрионе и на лабораторных животных?

11 Какие существуют методы индикации вирусов на культуре клеток?

12 В чем заключается назначение и сущность реакций нейтрализации вирусов?

Читайте также: