Моноклональными антителами гепатит с

Обновлено: 25.04.2024

Определение рабочей концентрации моноклонального антитела 6B11 к рекомбинантному белку NS4 вируса гепатита С методом иммуноферментного анализа, при которой комплекс антиген-антитело является наиболее стабильным.

Описание

Вирус гепатита С (ВГС) является одной из наиболее актуальных проблем современности. Это заболевание имеет широкую распространённость: по данным ВОЗ, хронической инфекцией гепатита С страдают около 70 миллионов человек во всём мире, и примерно 399 000 человек ежегодно умирают от этого заболевания.

В связи с этим в мае 2016 года Всемирной ассамблеей здравоохранения разработана стратегия, перспективой которой является ликвидация вирусного гепатита на 90 % и сокращение случаев смерти из-за вирусного гепатита на 65 % к 2030 году.

Актуальность изучения этого заболевания обусловлена:

- высоким риском хронизации инфекции (в 55–85 % случаев острый гепатит С принимает хроническую форму);

- неблагоприятным исходом (у 20–30 % инфицированных лиц гепатит С приводит к циррозу печени или гепатоцеллюлярной карциноме);

- малодоступностью лечения и его высокой стоимостью;

- высокой способностью к изменчивости вируса, затруднённостью симптоматической диагностики (у 80 % людей на начальной стадии заражения не проявляется никаких симптомов, а дальнейшие проявления гепатита С совпадают с проявлениями других заболеваний).

Большую роль в развитии болезни играет вирусный белок NS4, который создаёт мембранную сеть с комплексом репликации РНК-вируса. Таким образом, изучение этого белка играет ключевую роль в лечении гепатита С. Активность белка в клетке можно проследить, пометив его антителом, но для этого необходимо подобрать такое антитело и такую его концентрацию, чтобы комплекс антиген-антитело был наиболее стабильным в среде организма человека.

В работе изучалась способность белка NS4 формировать комплекс антиген-антитело с моноклональным антителом 6В11, что необходимо для изучения механизма функционирования NS4 в культуре клеток гепатокарциномы человека с помощью моноклональных антител.

Задачи

1. Определить эффективность моноклонального антитела 6В11 и возможность его использования в дальнейших исследованиях вирусного белка NS4.

2. Подобрать наиболее эффективную концентрацию моноклонального антитела.

Содержимое виросомы представлено синтетическим фрагментом белков капсида вируса гепатита С.

Исследование и перспектива изучения помеченных МКА 6В11 белков NS4B вируса гепатита С может уточнить роль этого белка в вирусе, так как на данный момент известно лишь то, что он создаёт мембранную сеть, которая помогает репликации, однако более точный механизм пока не открыт.

Были выбраны два варианта разведения МКА – 8 мкг/мл (1:1000) и 10 мкг/мл.

Для работы наиболее подходящим оказался метод непрямого твёрдофазного ИФА, который основан на образовании комплекса антиген-антитело.

Ход работы

1 этап. Сорбция рекомбинантного белка.

Рекомбинантный белок rNS4 засорбировали в разведении 1:2000 по 50 мкл/лунку 96-луночного микропланшета с использованием PBS×1 (однократного соляного буфера).

Инкубация проводилась при +4 °C в течение ночи.

2 этап. Отмывка после сорбции.

Отмывка необходима для удаления несвязавшихся веществ. В каждую лунку многоканальным семплером вносили по 250 мкл PBSTw20 (соляного буфера с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %). Панель отмывали в течение 3 минут, затем содержимое лунок сбрасывали. Отмывку повторяли 4 раза.

3 этап. Титрование и внесение моноклонального антитела 6B11.

4 этап. Инкубация. Проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой для предотвращения испарения и кантаминирования.

5 этап. Отмывка. Повторная отмывка для удаления первичных антител, не связавшихся с антигенами. Процесс отмывки производился так же, как на 2 этапе.

6 этап. Внесение конъюгата. В качестве конъюгата использовали вторичные козьи антитела, соединённые с пероксидазой хрена в разведении 1:500 по 50 мкл на лунку с использованием казеина. Инкубация проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой.

7 этап. Инкубация в термостате при +37 °C.

8 этап. Отмывка не связавшихся вторичных антител производилась так же, как на 2-м и 5-м этапах.

9 этап. Внесение субстрата.

10 этап. Инкубация при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

11 этап. Остановка реакции, внесение стоп-реагента по 50 мкл на лунку.

12 этап. Определение результатов на микропланшетном анализаторе.

Для определения рабочей концентрации МКА 6B11 были построены графики с помощью программы Microsoft Excel.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Рекомбинатный белок NS4

• Мышиные моноклональные антитела

• Конъюгат (козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена)

• Казеин для разведения

• PBS×1 (однократный соляной буфер)

• PBSTw20 (соляной буфер с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %)

• Микропланшетный спектрофотометр (ИФА-ридер)

Результаты

1. Результаты по МКА 6В11 в разведении 8 мкг/мл являются более достоверными, поэтому для дальнейшей работы будет использована концентрация 7,51 мкг/мл моноклонального антитела.

2. В разведении 8 мкг/мл наиболее эффективная концентрация 6В11 меньше, чем в разведении 10 мкг/мл, поэтому использовать концентрацию 7,51 мкг/мл более целесообразно.

3. Доказана эффективность практического применения моноклональных антител на примере МКА 6В11, что обеспечивает возможность его дальнейшего использования в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Перспективы использования результатов работы

Исследование механизма функционирования rNS4, помеченного моноклональными антителами, в культуре клеток гепатокарциномы человека.
Возможность дальнейшего использования моноклонального антитела МКА 6В11 в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина.

Особое мнение

Вирус гепатита С (ВГС) является одной из наиболее актуальных проблем современности. Это заболевание имеет широкую распространенность: по данным ВОЗ хронической инфекцией гепатита С страдают около 70 миллионов человек во всем мире и примерно 399 000 человек ежегодно умирают от этого заболевания. Именно поэтому, изучение белков ВГС имеет огромное значение для диагностики и лечения данного заболевания.

Одним из методов исследования является иммуноферментный анализ (ИФА), ключевыми реагентами которого являются моноклональные антитела (МКА). Моноклональные антитела — это класс антител, которые обладают высокой селективностью в отношении молекулярной мишени (конкретному эпитопу антигена), являющейся, как правило, одним из ключевых компонентов патологического процесса. В основу реакции положено классическое взаимодействие антигена с антителом.

Цель

Изучение свойств МКА 3F11 и 6B11 к рекомбинантному неструктурному белку rNS4 ВГС.

Задачи

Определить эффективность работы моноклонального антитела 3F11 (по сравнению с 6B11) методом ИФА.
Определить возможность его использования в исследованиях, направленных на изучение рекомбинантного неструктурного белка rNS4 ВГС.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

Рекомбинатный белок NS4
Мышиные моноклональные антитела
Конъюгат (козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена)
Субстрат
Стоп-реагент
Казеин для разведения
PBS×1 (однократный соляной буфер)
PBSTw20 (соляной буфер с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %)
Микропланшет
Многоканальный семплер
Термостат
Микропланшетный спектрофотометр (ИФА-ридер)

Описание

Рекомбинантный белок rNS4 засорбировала в разведении 1:500 и 1:2000 для 3F11 и 1:500 6B11 по 50 мкл/лунку 96-луночного микропланшета с использованием PBSх1 (однократного фосфатно-соляного буфера).
Инкубация проводилась при комнатной температуре в течение ночи.

Отмывка необходима для удаления несвязавшихся компонентов и проводилась путем внесения PBSTw20 (фосфатно-соляного буфера с содержанием твина-20 в концентрации 0,1%) в объеме 250 мкл/лунку. Панель отмывала вручную в течение 3 мин, затем содержимое лунок сбрасывала. Процедуру повторяла 4 раза.

Титрование и внесение моноклональных антител 6B11 и 3F11
Инкубация

Проводилась при температуре +37°C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой для предотвращения испарения и кантаминирования.

Необходима для удаления первичных антител, не связавшихся с антигенами.

В качестве конъюгата я использовала вторичные козьи антитела, соединённые с пероксидазой хрена в разведении 1:500 по 50 мкл/лунку с использованием казеина.

Проводилась при температуре +37°C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой.

Проводилась при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

Внесение стоп-реагента по 50 мкл/лунку.
Учет результатов на микропланшетном анализаторе.

Для определения рабочей концентрации МКА 6B11 и 3F11 были построены графики с помощью программы Microsoft Excel.

Результаты работы/выводы

Результаты по МКА 6В11 в разведении 10 мкг/мл являются более достоверными, чем результаты по МКА 3F11 в том же разведении, поэтому эффективней использовать МКА 6B11.
Это дает основание говорить о том, что в лабораторной и клинической практике для обнаружения белка NS4 ВГС в дальнейшем будет применяться моноклональное антитело 6B11.

Перспективы использования результатов работы

Возможность дальнейшего использования моноклонального антитела МКА 6В11 в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина.

Награды/достижения (в каких конкурсах и с какими результатами выставлялась ранее эта работа)

XXIX Всероссийская конференция одаренных школьников "Авангард" – диплом 3 степени.

Мнение автора

Вирус гепатита С (ВГС) является одной из наиболее актуальных проблем современности. Это заболевание имеет широкую распространённость: по данным ВОЗ хронической инфекцией гепатита С страдают около 70 миллионов человек во всём мире и примерно 399 000 человек ежегодно умирают от этого заболевания. В связи с этим в 2016 году Всемирной ассамблеей здравоохранения была разработана стратегия, перспективой которой является ликвидация вирусного гепатита на 90 % и сокращение случаев смерти из-за вирусного гепатита на 65 % к 2030 году.

Большую роль в развитии болезни играет вирусный белок NS4, который создаёт комплекс репликации РНК вируса. Именно поэтому, изучение белков ВГС имеет огромное значение для диагностики и лечения гепатита С.

Одним из методов исследования является иммуноферментный анализ (ИФА), ключевыми реагентами которого являются моноклональные антитела (МКА). Моноклональные антитела – это класс антител, которые обладают высокой селективностью в отношении молекулярной мишени (конкретному эпитопу антигена), являющейся, как правило, одним из ключевых компонентов патологического процесса. В основу реакции положено классическое взаимодействие антигена с антителом.

Цель

Изучение свойств МКА 3F11 и 6B11 к рекомбинантному неструктурному белку rNS4 ВГС.

Задачи

1. Определить эффективность работы моноклонального антитела 3F11 (по сравнению с 6B11) методом ИФА.

2. Определить возможность его использования в исследованиях, направленных на изучение рекомбинантного неструктурного белка rNS4 ВГС.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Рекомбинатный белок NS4

• Мышиные моноклональные антитела

• Конъюгат (козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена)

• Казеин для разведения

• PBS×1 (однократный соляной буфер)

• PBSTw20 (соляной буфер с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %)

• Микропланшетный спектрофотометр (ИФА-ридер)

Описание

В данном исследовании был использован метод непрямого твёрдофазного ИФА.

Этапы исследования

1. Сорбция рекомбинантного белка

Рекомбинантный белок rNS4 засорбировали в разведении 1:500 и 1:2000 для 3F11 и 1:500 6B11 по 50 мкл в лунку 96-луночного микропланшета с использованием PBS×1 (однократного фосфатно-соляного буфера). Инкубация проводилась при комнатной температуре в течение ночи.

2. Отмывка после сорбции

Отмывка необходима для удаления несвязавшихся компонентов и проводилась путём внесения PBSTw20 (фосфатно-соляного буфера с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %) в объёме 250 мкл в лунку. Панель отмывали вручную в течение 3 мин, затем содержимое лунок сбрасывали. Процедуру повторяли 4 раза.

3. Титрование и внесение моноклональных антител 6B11 и 3F11

Исходная концентрация МКА 3F11 составляла 0,2 мг/мл, МКА 6В11 – 0,3 мг/мл.

Титрование МКА начинали с концентрации 10 мкг/мл и производили шагом 5.

Объём раствора для титрования рассчитывали по формуле С + x = nx, где C – объём в одной лунке, n – фактор разведения, х – искомый объём для титрования.

Таким образом, в первую лунку поместили 50 мкл + 12,5 мкл = 62,5 мкл заранее приготовленного раствора МКА, в остальные лунки добавляли по 50 мкл казеина.

Титрование производили следующим образом: из 1-й лунки с начальной концентрацией МКА отбирали 12,5 мкл раствора, переносили в следующую лунку и перемешивали. Затем, вновь забирали 12,5 мкл и переносили в следующую лунку и так далее. 12,5 мкл, отобранные из последней лунки, сбрасывали.

Процесс проводили при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывали крышкой для предотвращения испарения и кантаминирования.

5. Повторная отмывка

Необходима для удаления первичных антител.

6. Внесение конъюгата

В качестве конъюгата использовали вторичные козьи антитела, соединённые с пероксидазой хрена в разведении 1:500 по 50 мкл в лунку с использованием казеина.

Проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой.

8. Отмывка не связавшихся вторичных антител.

9. Внесение субстрата

В каждую лунку вносили по 50 мкл субстрата, который способен связываться с пероксидазой хрена, вследствие чего наблюдалось голубое окрашивание, интенсивность которого зависит от концентрации связавшихся с антигеном первичных антител.

10. Инкубация при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

11. Внесение стоп-реагента по 50 мкл в лунку.

12. Учёт результатов на микропланшетном анализаторе

После обработки результатов прибор выводил значения оптической плотности раствора в каждой лунке.

Результаты

Для определения рабочей концентрации МКА 6B11 и 3F11 были построены графики с помощью программы Microsoft Excel.

МКА 6В11 в концентрации 10 мкг/мл

МКА 3F11 в концентрации 10 мкг/мл

По оси абсцисс указана концентрация МКА 6В11 и МКА 3F11, которая соответствует фактору разведения 5. По оси ординат – значения ОП.

Линию тренда строили для определения логарифмической функции и величины достоверности аппроксимации.

Выводы

1. Результаты по МКА 6В11 в разведении 10 мкг/мл являются более значимыми, чем результаты по МКА 3F11 в том же разведении, т. к. значение 0,97 ошибки аппроксимации ближе к 1, чем значение 0,82. Поэтому эффективней использовать МКА 6B11.

2. Это даёт основание говорить о том, что в лабораторной и клинической практике для обнаружения белка NS4 ВГС в дальнейшем будет применяться моноклональное антитело 6B11.

Перспективы использования результатов работы

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина

Награды/достижения

Мнение автора

Высокоспецифичное исследование, использующееся для верификации положительных результатов скрининговых тестов на наличие антител к вирусу гепатита С.

Метод позволяет выполнять раздельную оценку наличия специфических IgG антител к различным антигенам вируса гепатита С (структурным нуклеокапсидным: Cor-1 и Cor-2 и неструктурным: хеликаза, NS3, NS4, NS5). Используется в качестве подтверждающего исследования для уточнения неясных результатов скрининговых ИФА тестов, направленных на суммарную оценку наличия антител к вирусу гепатита С.

Первый шаг в лабораторной диагностике гепатита С – скрининговое исследование на наличие специфических антител к вирусу методом иммуноферментного анализа (ИФА) (см. тест № 79 ). Положительный результат теста на антитела, полученный при первичном тестировании, подлежит обязательной перепроверке в дополнительных более специфичных исследованиях, чтобы исключить ненужные медицинские исследования и лишние психологические травмы. Этот тест, как и другие ИФА-тесты, может иногда давать ложноположительный результат вследствие перекрёстных реакций и неспецифического связывания, определяющихся индивидуальными особенностями сыворотки пациента. Технологии скрининговых и подтверждающих тестов в разных лабораториях часто различаются, в некоторых случаях результаты, полученные в разных лабораториях, расходятся. При выявлении у обследуемого человека антител к вирусу, которые могут присутствовать в крови как при текущей инфекции, так и после выздоровления, далее наиболее важно, в клиническом плане, подтвердить или исключить текущую инфекцию. Для этого служат ПЦР-тесты, выявляющие РНК вируса в крови (см. тесты № 321 и № 323 ).

Положительный результат ПЦР-тестирования означает присутствие вируса гепатита С в крови, дополнительное определение генотипа вируса (см. тест № 324 ) помогает определить тактику лечения пациента. Отрицательный результат ПЦР-теста говорит об отсутствии вируса в крови в момент взятия пробы, что может быть как в случае, если инфицирования данным вирусом не было, так и в случае избавления от вируса после инфекции в прошлом (спонтанно или в результате лечения) или временного подавления репликации вируса.

Поэтому в случаях, когда результат теста на антитела положителен, а результат ПЦР-теста на РНК вируса отрицателен, человек рассматривается как потенциально инфицированный, и в этих ситуациях особенно важно, в том числе и психологически, убедиться в достоверности результатов определения антител.

Верифицировать результаты определения антител скрининговых ИФА-тестов помогает высокоспецифичное развёрнутое исследование антител методом иммуноблота, которое позволяет не только выявить, но также и идентифицировать антитела, направленные против определённых структурных и неструктурных компонентов вируса гепатита С, имеющих разную значимость.

Как и ИФА-тесты, этот метод информативен, в среднем, начиная с 3 - 4 недели инфекции – период появления в крови специфических антител.

Подтверждение инфекции вирусом гепатита С в этих ситуациях возможно лишь положительным результатом при повторных исследованиях вирусной РНК методом ПЦР.

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи. С общими рекомендациями для подготовки к исследованиям можно ознакомиться здесь >>.

Подтверждение положительных или сомнительных результатов, полученных при скрининговом исследовании антител к вирусу гепатита С.

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Способ представления результата: на бланке результата отражен результат выявления антител к используемым антигенам, раздельно для Cor-1 и Cor-2, хеликаза, NS3, NS4, NS5 (отрицательный/сомнительный/положительный). Выдаётся общее заключение, сделанное на основании комплексной оценки результатов. Отрицательный результат иммуноблота: человек не был инфицирован вирусом гепатита С (результат скрининговых ИФА тестов – ложноположительный).

В этих случаях подтверждение инфекции вирусом гепатита С возможно только с помощью повторных ПЦР-исследований.

Положительный результат иммуноблота: была инфекция вирусом гепатита С. Сомнительный результат: возможно, была инфекция вирусом гепатита С.

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Напоминаем вам, что самостоятельная интерпретация результатов недопустима, приведенная ниже информация носит исключительно справочный характер.

Антитела к вирусу гепатита C класса IgM и IgG (anti-HCV total): показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Гепатит С – вирусное заболевание, которое может протекать в бессимптомной и легкой форме в течение нескольких недель, но иногда может перейти в хроническую форму.

По статистике ВОЗ, самой частой причиной развития рака печени является предшествующее поражение органа вирусом гепатита С. У некоторых пациентов после контакта с вирусом развивается острая форма гепатита, а у ряда зараженных происходит спонтанная элиминация вируса (самостоятельное излечение) без проведения специфического лечения в течение нескольких лет после инфицирования.

Заражение вирусом гепатита С происходит при контакте с кровью, вагинальным секретом или спермой больного, при использовании загрязненных медицинских инструментов, в том числе в маникюрных и тату-салонах, при стоматологических и эстетических процедурах (инъекции ботокса, перманентный макияж), при введении наркотических веществ общими иглами и шприцами, при незащищенном половом контакте. Возможна передача вируса гепатита С от зараженной матери ребенку в процессе родов. Однако в настоящее время при выявлении этого заболевания у женщины практикуют отказ от естественных родов для снижения риска инфицирования ребенка. С учетом того, что вирус гепатита С не передается с грудным молоком, слюной, пищевыми продуктами, при поцелуях и объятьях, риск заражения бытовым путем минимален.

Диагностика гепатита С определяется особенностями строения вируса.

Вирус состоит из нуклеокапсида, содержащего РНК и окруженного липидной (жировой) мембраной, на поверхности которой расположены гликопротеины Е1 и Е2.

Синонимы: Суммарные антитела к вирусу гепатита С; анти-HCV. Anti-HCV IgG/IgM; Antibodies to Hepatitis C Virus, IgM + IgG; HCVAb, Total. Характеристика показателя Anti-HCV-total (антитела к антигенам вируса гепатита C суммарные) Внимание! При положительных и сомнительных реакциях срок выдачи ре.

Читайте также: