Наборы к вирусу лейкоза
Обновлено: 06.05.2024
3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
3.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
УТВЕРЖДЕНЫ 23 июля 2000 г., N 13-7-2/2130
1. Общие положения
1.1. Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Клинически болезнь проявляется чаще у животных в возрасте старше 4 лет.
Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и (или) образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.
После установления опухолевой природы лейкоза болезнь как у животных, так и у человека получила название гемобластозы (опухолевые заболевания крови). По характеру и месту локализации опухолевых разрастаний, а также по морфологии и принадлежности пролиферирующих клеток к определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две группы:
- лейкозы - системные поражения органов кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированную формы;
- гематосаркомы - сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфосаркома, ретикулосаркома, лимфогранулематоз и миеломная болезнь.
Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae.
Источник возбудителя инфекции - животное, зараженное ВЛКРС.
Факторами передачи являются кровь, молоко и другие секреты и экскреты, содержащие лимфоидные клетки, инфицированные ВЛКРС.
Заражение может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных.
1.2. Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическим, молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, методом биопробы.
1.3. Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования - реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД).
Из числа положительно реагирующих в РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью гематологического метода выявляют больных лейкозом.
2. Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота
2.1. Реакция иммунодиффузии (РИД)
2.1.1. Сущность метода
Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2. 8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно.
2.1.2. Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 мес. и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 сут после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 сут до отела или через 30 сут после него.
2.1.3. Получение сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2. 3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.
Кровь (для получения сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1. 2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживают в течение 20. 24 ч при 4. 10°С. Полученные пробы сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2. 3 мл) и маркируют.
При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.
2.1.4. Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87*), в состав которого входят сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из гликопротеидного gp-51 и полипептидного р-24 антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС.
* ТУ не приводятся. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.
Оборудование и реактивы:
- чашки Петри диаметром 100 мм;
- стандартный штамп-пробойник для высечения лунок в агаре;
- пипетки пастеровские или автоматические со сменными наконечниками;
- хлорид натрия (х.ч.);
2.1.5. Постановка РИД
Подготовку компонентов реакции к работе осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота". Антиген растворяют в 5 см разбавителя. Растворенный антиген хранят при температуре 4°С не более 2 недель.
Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см, затем колбу помещают на водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50. 70°С, разливают слоем 2. 3 мм (12. 15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по 4 фигуры, каждая из которых состоит из 7 лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным насосом.
Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или автоматическими пипетками со сменными наконечниками.
Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки (1, 2, 3, 4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и инкубируют во влажной камере при температуре 22. 27°С.
2.1.6. Учет и оценка результатов реакции
2.1.6.1. Реакцию учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30. 45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.
Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой.
Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.
2.1.6.2. Оценка результатов
В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную.
Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, т.е. идентична ей (рис.16*, поз.1):
* Нумерация рисунков сквозная по всему тексту Сборника. - Примечание изготовителя базы данных.
- если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном (рис.16, поз.2) - слабоположительная сыворотка;
- если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном (рис.16, поз.2), - резко положительная сыворотка.
3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
3.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
УТВЕРЖДЕНЫ 23 июля 2000 г., N 13-7-2/2130
1. Общие положения
1.1. Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Клинически болезнь проявляется чаще у животных в возрасте старше 4 лет.
Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и (или) образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.
После установления опухолевой природы лейкоза болезнь как у животных, так и у человека получила название гемобластозы (опухолевые заболевания крови). По характеру и месту локализации опухолевых разрастаний, а также по морфологии и принадлежности пролиферирующих клеток к определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две группы:
- лейкозы - системные поражения органов кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированную формы;
- гематосаркомы - сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфосаркома, ретикулосаркома, лимфогранулематоз и миеломная болезнь.
Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae.
Источник возбудителя инфекции - животное, зараженное ВЛКРС.
Факторами передачи являются кровь, молоко и другие секреты и экскреты, содержащие лимфоидные клетки, инфицированные ВЛКРС.
Заражение может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных.
1.2. Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическим, молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, методом биопробы.
1.3. Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования - реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД).
Из числа положительно реагирующих в РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью гематологического метода выявляют больных лейкозом.
2. Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота
2.1. Реакция иммунодиффузии (РИД)
2.1.1. Сущность метода
Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2. 8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно.
2.1.2. Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 мес. и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 сут после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 сут до отела или через 30 сут после него.
2.1.3. Получение сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2. 3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.
Кровь (для получения сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1. 2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживают в течение 20. 24 ч при 4. 10°С. Полученные пробы сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2. 3 мл) и маркируют.
При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.
2.1.4. Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87*), в состав которого входят сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из гликопротеидного gp-51 и полипептидного р-24 антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС.
* ТУ не приводятся. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.
Оборудование и реактивы:
- чашки Петри диаметром 100 мм;
- стандартный штамп-пробойник для высечения лунок в агаре;
- пипетки пастеровские или автоматические со сменными наконечниками;
- хлорид натрия (х.ч.);
2.1.5. Постановка РИД
Подготовку компонентов реакции к работе осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота". Антиген растворяют в 5 см разбавителя. Растворенный антиген хранят при температуре 4°С не более 2 недель.
Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см, затем колбу помещают на водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50. 70°С, разливают слоем 2. 3 мм (12. 15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по 4 фигуры, каждая из которых состоит из 7 лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным насосом.
Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или автоматическими пипетками со сменными наконечниками.
Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки (1, 2, 3, 4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и инкубируют во влажной камере при температуре 22. 27°С.
2.1.6. Учет и оценка результатов реакции
2.1.6.1. Реакцию учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30. 45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.
Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой.
Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.
2.1.6.2. Оценка результатов
В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную.
Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, т.е. идентична ей (рис.16*, поз.1):
* Нумерация рисунков сквозная по всему тексту Сборника. - Примечание изготовителя базы данных.
- если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном (рис.16, поз.2) - слабоположительная сыворотка;
- если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном (рис.16, поз.2), - резко положительная сыворотка.
3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
3.4. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ "ЛЕЙКОЗ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (КРС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
УТВЕРЖДЕНА 19 мая 2009 г.
Тест-система "ЛЕЙКОЗ" для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в двух вариантах.
Вариант EPh - для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.
Вариант FRT - для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1. Тест-система выпускается в двух вариантах.
Вариант EPh
В состав тест-системы "ЛЕЙКОЗ", рассчитанной на проведение 50 анализов, включая контроли, входят:
- "ДНК-сорб-В" вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;
- "ПЦР-комплект" вариант 50R - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота;
- "ЭФ" вариант 200 - комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Вариант FRT
В состав тест-системы "ЛЕЙКОЗ", рассчитанной на проведение 50 анализов, включая контроли, входят:
- "ДНК-сорб-В" вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;
- "ПЦР-комплект" вариант FRT - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
1.1. Комплект реагентов "ДНК-сорб-В" вариант 50 состоит из следующих компонентов:
1 флакон, 15,0 см (мл)
Раствор для отмывки 1
1 флакон, 15,0 см (мл)
Раствор для отмывки 2
1 флакон, 50,0 см (мл)
1 пробирка, 1,25 см (мл)
ТЕ-буфер для элюции ДНК
1 пробирка, 5,0 см (мл)
Комплект реагентов рассчитан на выделение ДНК из 50 проб, включая контроли.
1.2. Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант 50R состоит из следующих компонентов:
ПЦР-смесь-1-R BLV-пpoвирус, раскапана под воск в пробирки объемом 0,5 или 0,2 мл
55 пробирок по 0,005 см (мл)
1 пробирка, 0,6 см (мл)
Минеральное масло для ПЦР
1 пробирка, 2,0 см (мл)
ПКО ДНК BLV
1 пробирка, 0,1 см (мл)
ДНК а-актина КРС
1 пробирка, 0,1 см (мл)
1 пробирка, 0,5 см (мл)
Комплект реагентов рассчитан на постановку 55 реакций амплификации, включая контроли.
Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:
1 пробирка, 1,2 см (мл)
1.3. Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант FRT состоит из следующих компонентов:
BLV-провирус
2 пробирки по 0,3 см (мл)
1 пробирка, 0,42 см (мл)
2 пробирки, 0,02 см (мл)
ПКО ДНК BLV
1 пробирка, 0,1 см (мл)
1 пробирка, 0,5 см (мл)
Комплект реагентов рассчитан на постановку 55 реакций амплификации, включая контроли.
Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:
1 пробирка, 1,2 см (мл)
1 пробирка, 1,0 см (мл)
Комплект реагентов "ЭФ" вариант 200 состоит из следующих компонентов:
Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с бромидом этидия
1 флакон, 50,0 см (мл)
Агароза для электрофореза ДНК
2 флакона по 1,7 г
Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета 100 мл геля - 5 рядов по 24 лунки).
2. Упаковка и маркировка
На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.
Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение СТО и надпись "Для животных". В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.
3. Транспортирование и хранение
Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8°С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения. Комплект реагентов "ДНК-сорб-В" хранить при температуре от 2 до 25°С.
Вариант EPh.
Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант 50R хранить при температуре от 2 до 8°С. Комплект реагентов "ЭФ" хранить при температуре от 18 до 25°С в защищенном от света месте.
Вариант FRT.
Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант FRT (кроме ПЦР-смеси-1-FRT BLV-провирус и полимеразы (TaqF)) хранить при температуре от 2 до 8°С. ПЦР-смесь-1-FRT BLV-провирус и полимеразу (TaqF) хранить при температуре не выше -16°С. Следует избегать длительного нахождения ПЦР-смеси-1-FRT BLV-провирус на свету.
4. Срок годности тест-системы - 12 мес. с даты изготовления.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА
5. Вариант EPh. В основе метода лежит амплификация специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (последовательности, интегрированной в ДНК лейкоцитов КРС) за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы. Для контроля качества проведения анализа вместе с последовательностью ДНК провируса (в одной пробирке) проводится амплификация эндогенного внутреннего контроля гена а-актина КРС.
Вариант FRT. В основе метода лежит амплификация специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (последовательности, интегрированной в ДНК лейкоцитов КРС) за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и зондов, меченных флуоресцентными красителями, и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы.
III. ОТБОР И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
6. Тест-система "ЛЕЙКОЗ" предназначена для выявления ДНК провируса лейкоза КРС в цельной крови КРС у животных старше 14-дневного возраста методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Вариант EPh. Продукты амплификации определяют путем электрофоретической детекции в агарозном геле.
Вариант FRT. Продукты амплификации определяют путем гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.
6.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.
6.2. Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.
6.3. Для исследования используют цельную кровь.
7. Отбор материала для исследования
7.1. Кровь для исследования отбирают из хвостовой вены в стерильные пробирки с 3%-ным раствором ЭДТА из расчета 10:1 (или с цитратом натрия в стандартной концентрации). Желательно использовать одноразовые системы взятия крови "Моноветт". Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. Пробы цельной крови используют для выделения ДНК без предварительной подготовки.
7.2. Материал доставляют в лабораторию не позднее чем через 3 дня от момента забора материала. Хранить материал следует при температуре от 2 до 8°С.
IV. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР
Вариант EPh. ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).
Вариант FRT. ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).
Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
8.1.* ЗОНА 1 - для выделения ДНК из исследуемого материала:
* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
- ламинарный бокс (например, "БАВп-01-"Ламинар-С"-1,2", "Ламинарные системы", Россия, класс биологической безопасности II, тип А);
- твердотельный термостат для пробирок типа "Эппендорф" от 25 до 100°С (например, "ТЕРМО 24-15", "Биоком", Россия);
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Руководитель Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В.Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130
1. Общие положения
1.1. Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Клинически болезнь проявляется чаще у животных в возрасте старше 4 лет.
Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и (или) образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.
После установления опухолевой природы лейкоза болезнь как у животных, так и у человека получила название гемобластозы, то есть опухолевые заболевания крови. По характеру и месту локализации опухолевых разрастаний, а также по морфологии и принадлежности пролиферирующих клеток к определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две группы:
лейкозы - системные поражения органов кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированную формы;
гематосаркомы - сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфосаркома, ретикулосаркома, лимфогрануломатоз и миеломная болезнь.
Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae.
Источник возбудителя инфекции - животное, зараженное ВЛКРС.
Факторами передачи являются кровь, молоко и другие секреты и экскреты, содержащие лимфоидные клетки, инфицированные ВЛКРС.
Заражение может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных.
1.2. Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическими, молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, методом биопробы.
1.3. Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования - реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД).
Из числа положительно реагирующих в РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью гематологического метода выявляют больных лейкозом.
2. Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота
2.1. Реакция иммунодиффузии (РИД).
2.1.1. Сущность метода.
Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2-8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно.
2.1.2. Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 месяцев и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 суток до отела или через 30 суток после него.
2.1.3. Получение сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.
Кровь (для получения сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1-2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживают в течение 20-24 ч при 4-10°С. Полученные пробы сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2-3 мл) и маркируют.
При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.
2.1.4. Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87), в состав которого входят: сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из гликопротеидного gр-51 и полипептидного р-24 антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС.
Оборудование и реактивы:
- чашки Петри диаметром 100 мм;
- стандартный штамп-пробойник для просечения лунок в агаре;
- пипетки пастеровские или автоматические со сменными наконечниками;
- хлорид натрия (х.ч.);
2.1.5. Постановка РИД.
Подготовку компонентов реакции к работе осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота". Антиген растворяют в 5 см разбавителя. Растворенный антиген хранят при температуре 4°С не более двух недель.
Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см, затем колбу помещают в водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50-70°С, разливают слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по четыре фигуры, каждая из которых состоит из семи лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенных с вакуумным насосом.
Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или автоматическими пипетками со сменными наконечниками.
Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки (1, 2, 3, 4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и инкубируют во влажной камере при температуре 22-27°С.
2.1.6. Учет и оценка результатов реакции.
2.1.6.1. Реакцию учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.
Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой.
Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.
2.1.6.2. Оценка результатов.
В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную.
Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то есть идентична ей (рис.1 - не приводится, поз.1):
- если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном (рис.1, поз.2), - слабоположительная сыворотка;
- если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном (рис.1, поз.2), - резко положительная сыворотка.
Положительно реагирующая сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой. Эта линия указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против второго антигена (р-24) ВЛКРС (рис.1, поз.3).
При образовании толстой, короткой, без загибов контрольной линии преципитации, не доходящей до лунки с испытуемой сывороткой, необходимо провести раститровку этой испытуемой сыворотки физраствором до получения результата, который можно будет оценить как отрицательный, положительный или неспецифический. Для этого необходимо физиологический раствор в объеме 100-500 мкл разлить в пробирки или в лунки стандартных пластиковых плат для постановки серологических реакций (количество пробирок или лунок соответствует числу необходимых разведений). В первую пробирку или лунку с физраствором внести такой же объем сыворотки, тщательно перемешать и перенести той же пипеткой в том же объеме в следующую пробирку или лунку, затем после перемешивания - в следующую и т.д. В результате в первой пробирке или лунке испытуемая сыворотка разведена в 2 раза, во второй - в 4 раза, в третьей - в 8 раз и т.д.
Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без загиба (рис.1, поз.4).
В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.
Сдвиг контрольной линии преципитации в сторону лунки с антигеном или с контрольной сывороткой указывает на нарушение соотношения антигена и антител в тест-системе. В этом случае необходимо использовать другую серию диагностического набора.
2.1.7. Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза, и их необходимо исследовать гематологическим методом.
2.2. Метод иммуноферментного анализа (ИФА).
2.2.1. Сущность метода. Иммуноферментный анализ основан на иммунохимической реакции взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или антигенов.
Существует две модификации иммуноферментного анализа: непрямой и конкурентный.
Метод непрямого иммуноферментного анализа основан на связывании специфических к вирусу лейкоза антител с антигеном ВЛКРС, адсорбированным на стенках лунок планшета для микротитрования. Связавшиеся антитела выявляют с помощью видоспецифических антител, меченых ферментом (пероксидазой), с последующим ферментативным превращением бесцветного субстрата пероксидазой в окрашенный продукт. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию антител к ВЛКРС в сыворотке крови.
В основе конкурентного иммуноферментного анализа лежит способность антител к ВЛКРС, содержащихся в испытуемой сыворотке, блокировать связывание антигена ВЛКРС с антителами к ВЛКРС, иммобилизованными (адсорбированными) на стенках лунок планшетов для микротитрования (МТП). Антиген ВЛКРС, связавшийся с иммобилизованными антителами, выявляют с помощью антител к ВЛКРС, меченных пероксидазой (конъюгатом антител с пероксидазой) и последующего ферментативного превращения бесцветного субстрата пероксидазы в окрашенный продукт. В том случае, если испытуемый материал не содержал антител к ВЛКРС, интенсивность окрашивания максимальна. Антитела к ВЛКРС в испытуемом материале снижают интенсивность окрашивания прямо пропорционально их содержанию.
2.2.2. Материалы и оборудование.
2.2.2.1. Материалом для исследования методом иммуноферментного анализа может служить сыворотка крови, секрет вымени сухостойных коров, молозиво и молоко.
При исследовании сывороток крови их получают, как изложено в п.2.1.3. Сыворотки пригодны для использования в течение 10 дней при температуре хранения +4°С. Срок годности сыворотки, хранящейся при температуре -20°С и ниже, не ограничен.
Бактериально загрязненные, разложившиеся или сильно гемолизированные сыворотки непригодны для исследования.
2.2.2.2. При постановке реакции используют стандартные коммерческие диагностические наборы согласно прилагаемому к ним наставлению по применению.
Для проведения исследования применяют:
- микропипетки одноканальные автоматические;
- фотометр одно- или многоканальный с автоматической регистрацией результатов. Рекомендуется использовать анализатор иммуноферментный фотоэлектрический АИФ-Ц-01С;
- микротитровальные пластмассовые (полистироловые) планшеты с 96 лунками;
- автоматическое или полуавтоматическое оборудование для промывания пластин;
- термостат, обеспечивающий температуру 37+/-0,5°С;
- пипетки градуированные вместимостью 1 и 10 см.
2.2.3. Непрямой иммуноферментный анализ для выявления антител к вирусу лейкоза.
2.2.3.1. В состав диагностического набора входят:
- антиген вируса лейкоза лиофилизированный и разбавитель антигена;
- конъюгат антител против иммуноглобулинов крупного рогатого скота с пероксидазой или другим ферментом, жидкий или лиофилизированный, и разбавитель конъюгата;
- сыворотки контрольные - отрицательная и положительная (слабоположительная), лиофилизированные или жидкие;
- разбавитель для сывороток и промывающий раствор, содержащий детергент и инертный белок;
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Руководитель Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В.Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130
1. Общие положения
1.1. Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Клинически болезнь проявляется чаще у животных в возрасте старше 4 лет.
Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и (или) образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.
После установления опухолевой природы лейкоза болезнь как у животных, так и у человека получила название гемобластозы, то есть опухолевые заболевания крови. По характеру и месту локализации опухолевых разрастаний, а также по морфологии и принадлежности пролиферирующих клеток к определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две группы:
лейкозы - системные поражения органов кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированную формы;
гематосаркомы - сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфосаркома, ретикулосаркома, лимфогрануломатоз и миеломная болезнь.
Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae.
Источник возбудителя инфекции - животное, зараженное ВЛКРС.
Факторами передачи являются кровь, молоко и другие секреты и экскреты, содержащие лимфоидные клетки, инфицированные ВЛКРС.
Заражение может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных.
1.2. Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическими, молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, методом биопробы.
1.3. Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования - реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД).
Из числа положительно реагирующих в РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью гематологического метода выявляют больных лейкозом.
2. Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота
2.1. Реакция иммунодиффузии (РИД).
2.1.1. Сущность метода.
Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2-8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно.
2.1.2. Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 месяцев и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 суток до отела или через 30 суток после него.
2.1.3. Получение сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.
Кровь (для получения сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1-2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживают в течение 20-24 ч при 4-10°С. Полученные пробы сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2-3 мл) и маркируют.
При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.
2.1.4. Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87), в состав которого входят: сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из гликопротеидного gр-51 и полипептидного р-24 антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС.
Оборудование и реактивы:
- чашки Петри диаметром 100 мм;
- стандартный штамп-пробойник для просечения лунок в агаре;
- пипетки пастеровские или автоматические со сменными наконечниками;
- хлорид натрия (х.ч.);
2.1.5. Постановка РИД.
Подготовку компонентов реакции к работе осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота". Антиген растворяют в 5 см разбавителя. Растворенный антиген хранят при температуре 4°С не более двух недель.
Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см, затем колбу помещают в водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50-70°С, разливают слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по четыре фигуры, каждая из которых состоит из семи лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенных с вакуумным насосом.
Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или автоматическими пипетками со сменными наконечниками.
Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки (1, 2, 3, 4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и инкубируют во влажной камере при температуре 22-27°С.
2.1.6. Учет и оценка результатов реакции.
2.1.6.1. Реакцию учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.
Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой.
Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.
2.1.6.2. Оценка результатов.
В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную.
Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то есть идентична ей (рис.1 - не приводится, поз.1):
- если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном (рис.1, поз.2), - слабоположительная сыворотка;
- если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном (рис.1, поз.2), - резко положительная сыворотка.
Положительно реагирующая сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой. Эта линия указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против второго антигена (р-24) ВЛКРС (рис.1, поз.3).
При образовании толстой, короткой, без загибов контрольной линии преципитации, не доходящей до лунки с испытуемой сывороткой, необходимо провести раститровку этой испытуемой сыворотки физраствором до получения результата, который можно будет оценить как отрицательный, положительный или неспецифический. Для этого необходимо физиологический раствор в объеме 100-500 мкл разлить в пробирки или в лунки стандартных пластиковых плат для постановки серологических реакций (количество пробирок или лунок соответствует числу необходимых разведений). В первую пробирку или лунку с физраствором внести такой же объем сыворотки, тщательно перемешать и перенести той же пипеткой в том же объеме в следующую пробирку или лунку, затем после перемешивания - в следующую и т.д. В результате в первой пробирке или лунке испытуемая сыворотка разведена в 2 раза, во второй - в 4 раза, в третьей - в 8 раз и т.д.
Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без загиба (рис.1, поз.4).
В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.
Сдвиг контрольной линии преципитации в сторону лунки с антигеном или с контрольной сывороткой указывает на нарушение соотношения антигена и антител в тест-системе. В этом случае необходимо использовать другую серию диагностического набора.
2.1.7. Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза, и их необходимо исследовать гематологическим методом.
2.2. Метод иммуноферментного анализа (ИФА).
2.2.1. Сущность метода. Иммуноферментный анализ основан на иммунохимической реакции взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или антигенов.
Существует две модификации иммуноферментного анализа: непрямой и конкурентный.
Метод непрямого иммуноферментного анализа основан на связывании специфических к вирусу лейкоза антител с антигеном ВЛКРС, адсорбированным на стенках лунок планшета для микротитрования. Связавшиеся антитела выявляют с помощью видоспецифических антител, меченых ферментом (пероксидазой), с последующим ферментативным превращением бесцветного субстрата пероксидазой в окрашенный продукт. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию антител к ВЛКРС в сыворотке крови.
В основе конкурентного иммуноферментного анализа лежит способность антител к ВЛКРС, содержащихся в испытуемой сыворотке, блокировать связывание антигена ВЛКРС с антителами к ВЛКРС, иммобилизованными (адсорбированными) на стенках лунок планшетов для микротитрования (МТП). Антиген ВЛКРС, связавшийся с иммобилизованными антителами, выявляют с помощью антител к ВЛКРС, меченных пероксидазой (конъюгатом антител с пероксидазой) и последующего ферментативного превращения бесцветного субстрата пероксидазы в окрашенный продукт. В том случае, если испытуемый материал не содержал антител к ВЛКРС, интенсивность окрашивания максимальна. Антитела к ВЛКРС в испытуемом материале снижают интенсивность окрашивания прямо пропорционально их содержанию.
2.2.2. Материалы и оборудование.
2.2.2.1. Материалом для исследования методом иммуноферментного анализа может служить сыворотка крови, секрет вымени сухостойных коров, молозиво и молоко.
При исследовании сывороток крови их получают, как изложено в п.2.1.3. Сыворотки пригодны для использования в течение 10 дней при температуре хранения +4°С. Срок годности сыворотки, хранящейся при температуре -20°С и ниже, не ограничен.
Бактериально загрязненные, разложившиеся или сильно гемолизированные сыворотки непригодны для исследования.
2.2.2.2. При постановке реакции используют стандартные коммерческие диагностические наборы согласно прилагаемому к ним наставлению по применению.
Для проведения исследования применяют:
- микропипетки одноканальные автоматические;
- фотометр одно- или многоканальный с автоматической регистрацией результатов. Рекомендуется использовать анализатор иммуноферментный фотоэлектрический АИФ-Ц-01С;
- микротитровальные пластмассовые (полистироловые) планшеты с 96 лунками;
- автоматическое или полуавтоматическое оборудование для промывания пластин;
- термостат, обеспечивающий температуру 37+/-0,5°С;
- пипетки градуированные вместимостью 1 и 10 см.
2.2.3. Непрямой иммуноферментный анализ для выявления антител к вирусу лейкоза.
2.2.3.1. В состав диагностического набора входят:
- антиген вируса лейкоза лиофилизированный и разбавитель антигена;
- конъюгат антител против иммуноглобулинов крупного рогатого скота с пероксидазой или другим ферментом, жидкий или лиофилизированный, и разбавитель конъюгата;
- сыворотки контрольные - отрицательная и положительная (слабоположительная), лиофилизированные или жидкие;
- разбавитель для сывороток и промывающий раствор, содержащий детергент и инертный белок;
Читайте также: