Обнаружение вирусов у животных

Обновлено: 05.05.2024

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ (позднелат. identificare отождествлять; вирусы) — определение родовой и видовой принадлежности вирусов, установление их тождественности или отличия при сопоставлении с уже известными вирусами.

И. в. является заключительным этапом при лабораторной диагностике вирусных заболеваний; широко проводится также при эпидемиол, исследованиях и при работе в области теоретической вирусологии.

И. в. осуществляется путем изучения их морфологии, физ.-хим. свойств, биол, особенностей и антигенной структуры; ее проводят на основе существующей классификации вирусов. При И. в. сначала определяют их принадлежность к определенной классификационной группе. Если группа представляет собой семейство, дополнительно определяют род вируса (напр., принадлежность изучаемого пикорнавируса к энтеро- или риновирусам). Далее устанавливают вид вируса, а для видов, подразделяющихся на типы (напр., вирусы полиомиелита, гриппа), также их тип.

Групповая принадлежность вируса обусловливается видом входящей в его состав нуклеиновой к-ты и ее мол. весом, местом формирования (сборки) капсида в клетке, числом капсомеров, видом симметрии нуклеокапсида, наличием или отсутствием оболочки, липидов, размерами вириона. Практически для И. в. обычно достаточно определения лишь нескольких, наиболее важных из перечисленных показателей.

После установления рода определяют вид вируса (а для определенных вирусов также тип) путем изучения его антигенной структуры с помощью иммунных сывороток к типичным представителям различных видов (и типов) вирусов данного рода. Реже с той же целью используют другие методы.

Наиболее сложной является И. в., которые по своим характеристикам не могут быть отнесены ни к одной из существующих классификационных групп. Очень ответственным является заключение, что изучаемый вирус отличен от всех известных; оно может быть сделано лишь после изучения всего комплекса его свойств.

И. в., как правило, проводится после их размножения в лаборатории, поэтому для исследования берутся органы зараженных животных, ткани и жидкости эмбрионов птиц, питательная среда или клетки инфицированных клеточных и тканевых культур. Если вирус не удается культивировать в лабораторных условиях, то для И. в. используют материал, взятый непосредственно от больного или погибшего организма.

Размеры вируса наиболее точно определяют при помощи электронной микроскопии (см.), к-рая одновременно дает возможность получить сведения о структуре вириона. Для электронномикроскопического исследования необходимо иметь высокоочищенный и конц. материал. Для этой цели предпочтительно использовать скоростное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (см. Ультрацентрифугирование), что позволяет не только очистить вирус от балластных веществ, но при наличии в материале нескольких вирусов и разделить их, если они отличаются по величине.

При некоторых вирусных инфекциях с целью быстрой диагностики электронноскопически исследуют материал, взятый без предварительной обработки непосредственно от больного (напр., содержимое пустул для дифференциации оспы и ветрянки). Метод этот находит все более широкое применение при диагностике вирусных инфекций.

Определение размеров вирусов с помощью фильтрации через целлюлозные мембранные фильтры (см. Ультрафильтрация, в вирусологии) является менее точным. Необходимо иметь набор фильтров с различным диаметром пор. Далее для каждого фильтра должен быть определен поправочный коэффициент адсорбции, показывающий соотношение между диаметром пор и максимальным размером вирионов, которые могут через них проходить. С этой целью фильтр калибруют, используя частицы известной величины. Исследуемый материал должен быть освобожден от грубых частиц путем пропускания через стерилизующий фильтр или центрифугирования в течение 10—15 мин. при скорости 2000— 3000 об/мин. Для уменьшения адсорбции вируса предварительно фильтруют какое-либо капиллярноактивное вещество (бульон, р-р пептона и т. п.) или его прибавляют к вирусной взвеси. Фильтрацию материала выполняют последовательно, начиная с наиболее крупнопористого фильтра. Размер вируса получают путем умножения величины пор мембраны, частично его задерживающей, на коэффициент адсорбции для фильтра данной пористости.

Для определения типа входящей в состав вируса нуклеиновой к-ты ее выделяют путем обработки вирусной взвеси водонасыщенным фенолом, анионными детергентами, напр, додецилсульфатом натрия и другими, с последующим хим. анализом. Если вирус размножается в культурах клеток, тип нуклеиновой к-ты часто определяют косвенным методом, который основан на способности галоидопроизводных дезоксиуридина, в частности 5-бром-2-дезоксиуридина, избирательно подавлять размножение ДНК-содержащих вирусов и не влиять на репродукцию большинства РНК-содержащих. Препарат вносят в питательную среду в дозе от 40 до 100 мкг/мл при заражении клеточной культуры вирусом.

Ориентировочные данные о типе нуклеиновой к-ты вирусов можно получить по окраске инфицированных клеток флюорохромами, напр, акридином оранжевым (его используют в разведении 1:10000 — 1:20000 в изотоническом р-ре хлорида натрия с фосфатным буфером pH 7,2—7,4). При соединении с РНК акридин оранжевый флюоресцирует красным, а после реакции с ДНК — зеленым. Этот метод позволяет определить тип нуклеиновой к-ты вирусных компонентов в местах их скоплений внутри клеток. На нем основан метод дифференциальной диагностики ряда респираторных инфекций: делают мазок-отпечаток с нижней носовой раковины больного; после окраски акридином оранжевым внутриклеточные включения вирусов гриппа и парагриппа начинают светиться красным, а при аденовирусной инфекции и герпесе — зеленым.

Наличие или отсутствие в оболочке вирусов липидов устанавливают по чувствительности к действию растворителей липидов, напр, эфира. Вирусную взвесь соединяют с равным объемом эфира, встряхивают в течение 20 мин. при комнатной температуре, затем выдерживают 18—20 час. при t° 4° в плотно закрытой посуде. Далее пробу наливают в чашку Петри и выдерживают для испарения эфира 30 мин. при t° 36—37°, после чего ее титруют параллельно с необработанным материалом для определения количества вируса. При наличии в оболочке вируса липидов он при воздействии эфира инактивируется.

Проведение этих исследований обычно позволяет отнести изучаемый штамм к определенной классификационной группе или к числу неклассифицированных вирусов. Дальнейшую И. в. проводят внутри группы путем их сопоставления с типичными представителями отдельных видов. В ряде случаев исследования внутри группы могут быть ограничены. Так, вирусы семейства пикорна испытывают на устойчивость в кислой среде. Риновирусы при pH 3,0—5,3 в течение 1 — 3 час. инактивируются, в то время как энтеровирусы сохраняют свою инфекционность.

И. в. с помощью серол, реакций проводят путем их испытания с сыворотками к известным вирусам или, наоборот, приготовленные к изучаемым штаммам иммунные сыворотки испытывают с известными вирусами.

Серол, идентификацию нередко осуществляют в два этапа. Сначала вирус изучают в реакции связывания комплемента (см.), или, если он обладает гемагглютинирующей активностью, в реакции торможения гемагглютинации (см.), а затем с помощью реакции нейтрализации. РСК в отношении многих вирусов не является строго специфичной. Так, аденовирусы человека и большинства животных имеют общий комплементсвязывающий антиген. Общий антиген имеют все известные реовирусы. В отношении других вирусов, напр, вирусов гриппа, РСК более специфична и позволяет определить их типовую принадлежность. То же самое относится к РТГА: она позволяет определить тип реовируса и очень специфична в отношении вирусов гриппа, но в то же время дает групповые реакции при идентификации тогавирусов.

Наиболее специфичной является реакция нейтрализации: в большинстве случаев она позволяет установить как видовую, так и типовую принадлежность вируса (для видов, подразделяющихся на типы). Ее осуществляют различными способами. Чаще всего готовят смесь вируса с сывороткой, к-рую затем испытывают тем или иным способом на наличие ненейтрализованного вируса.

Значительно реже И. в. проводят путем перекрестного испытания иммунитета: животных иммунизируют неизвестным вирусом, а затем заражают известным или наоборот.

Весьма широко для И. в. используют иммунофлюоресценцию (см.). Чаще всего инфицированные неизвестным вирусом клеточные культуры исследуют с флюоресцирующим иммуноглобулином к известному вирусу. Реже исследуют т. о. материал от больных (мазки из глотки при гриппе, мозг больных подострым склерозирующим панэнцефалитом на коревой антиген, мозг погибших от бешенства).

Преципитацию в агаре используют для И. в. довольно редко. В материале из кожных поражений больных оспой этим методом можно обнаружить вирусный антиген.

Некоторые виды вирусов пе удается достаточно четко дифференцировать путем изучения их антигенной структуры. В таких случаях прибегают к дополнительным тестам — определяют патогенность для животных, размножение в различных клеточных культурах и др. Т. о., напр., идентифицируют вирусы оспенной группы. Возбудитель натуральной оспы не вызывает поражений на скарифицированной коже кролика и не размножается в культурах клеток при t° выше 38,5°. В то же время вирусы осповакцины и оспы коров вызывают изменения на коже кролика и размножаются при t° до 40°. Отличаются вирусы также по морфологии поражений на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона.

Библиография: Гайдамович С. Я. Классификация и идентификация арбовирусов, Вестн. АМН СССР, № б, с. 25, 1972; Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974; Лурия С. и Дарнелл Дж. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970; Соколов М. И., С и н и ц к и й А. А. и P е-м e з о в П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972.

Животные модели для обнаружения вирусов. Идентификация вирусов. Качественное определение вирусов. Цитопатические эффекты вирусов. Бляшкообразование вируса. Тельца включений вирусов.

При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили клеточные культуры. Тем не менее животные модели активно используют для изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях. j

Идентификация вирусов

Цитопатические эффекты вирусов оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.

Бляшкообразование вирусов

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.

Забор материала для выявления вирусов

При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.

Выделение и культивирование вирусов

Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.

Культуры клеток для выявления вирусов

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3~4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления Аг некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкубирования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК — высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизиро-ваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Методы диагностики микозов ( грибковых заболеваний )

Микроскопия — один из основных методов выявления возбудителей микозов. Позволяет проводить экспресс-диагностику микозов и получать результат в течение 1—2 ч, тогда как для выделении культуры возбудителя необходимы недели. Для экспресс-диагностики препараты часто необходимо окрашивать специальными красителями, так как простая окраска гематоксилином и эозином часто не позволяет выявить клетки грибов.

Неокрашенные препараты грибов

Микроскопия методом висячей или раздавленной капли. Метод позволяет выявить структуры грибов в клинических образцах без предварительного окрашивания.

Обработка 10% едким калием (КОН). Метод используют в первую очередь для визуализации структур возбудителей в фрагментах кожи и её придатках (ногти, волосы), отделяемом очагов поражения и влагалища. В указанных образцах содержится большое количество клеток, в которых КОН разрушает кератин, оставляя неизменёнными клетки грибов.

Окрашенные препараты грибов. Окраска мазка грибов.

• Окраска мазка грибов по Граму. В мазках из клинического материала грибы представлены грамположительными клетками. Клетки Cryptococcus neoformans плохо воспринимают красители, что можно использовать как дифференциально-диагностический признак при микроскопии окрашенных мазков СМЖ.

• Окраска мазка грибов нигрозином или тушью по Бурри мазков СМЖ позволяет выявить капсулированные клетки Cryptococcus neoformans. Для идентификации этого микроорганизма можно использовать муцикармин или конго красный.

• Окраска мазка грибов по Романовскому-Гимзе или Райту мазков крови и костного мозга позволяет выявить дрожжевую форму Histoplasma capsulatum в цитоплазме фагоцитов.

• Окраска мазка грибов метенаминовым серебряным по Гомори. Метод включает предварительную обработку гистологических препаратов хромовой кислотой с последующим нанесением красителя (клетки грибов тёмно-серые или чёрные).

• Окраска мазка грибов по Гридли. Метод включает предварительную обработку препаратов хроматом лейко-фуксина с последующим нанесением фуксинового альдегида и метанилового жёлтого (клетки грибов розово-пурпурные на жёлтом фоне).

• Окрашивание перйодной кислотой и реактивом Шиффа (по Мак-Манусу). 1,2-Гликольные группировки полисахаридов клеточных стенок грибов сначала окисляются перйодной кислотой до альдегидов, реагирующих с сульфитом лейкофуксина реактива Шйффа; клетки окрашиваются в насыщенно розовый или красный цвет.

Иммунофлюоресцентная микроскопия грибов

Наибольшее распространение нашла РИФ. Применяют AT, меченные флюоресцеинами; для выявления грибковых Аг реагент наносят на гистологический препарат, инкубируют и проводят люминесцентную микроскопию.

Животные модели для обнаружения вирусов. Идентификация вирусов. Качественное определение вирусов. Цитопатические эффекты вирусов. Бляшкообразование вируса. Тельца включений вирусов.

Идентификация вирусов

Бляшкообразование вирусов

Читайте также: