Среда для роста вируса

Обновлено: 01.05.2024

Рис. 2. Заражение куриного эмбриона на ХАО через естественную воздушную камеру
(по Николау)
Рис. 3. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (по Николау)

Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следовательно, ведет к образованию большего количества вируса. Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 4, а). В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО (рис. 4, б).

Рис. 4. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)
Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.
Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.
Заражение в желточный мешок. Большей частью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов болезни Марека, ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения (рис. 6).

Рис. 5. Заражение куриного эмбриона в амниотическую полость (по Николау и др.)
Рис. 6. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)

Первый вариант. Иногда путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе, при этом зародыш находится внизу, а желток - над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.
Второй вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша.
Заражение в амниотическую полость. Для этой цели используют эмбрионы 6-10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа заражжения (рис. 5).
Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.
Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5-2,5 см. Через него пинцетом под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зародышу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал (рис. 7). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.
Заражение в тело зародыша. Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Известно два варианта метода.
Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.
Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.

Рис. 7. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)

Рис. 8. Отсасывание аллантоисной жидкости (по Николау)
Рис. 9. Отсасывание амниотической жидкости (по Николау и др.)

Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого в физиологическом растворе. Тело зародыша извлекают, удерживая его за шею (рис. 10).
При вскрытии куриных эмбрионов ставят бактериологический контроль вируссодержащего материала посевом на МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро. Вируссодержащий материал хранят при минус 25 °С и ниже.
Культивирование с производственными целями на куриных эмбрионах применяется для размножения ряда вирусов (осповакцины, клещевого энцефалита, гриппа, москитной лихорадки и др.). Так, для изготовления гриппозной и оспенной вакцин используют вирусы, размноженные на хорионаллантоисной оболочке, вакцины против москитной лихорадки - в аллантоисной полости, а вирус клещевого энцефалита культивируют в желточном мешке.
Метод размножения вирусов на культурах тканей
Для изготовления живых и инактированных вакцин вирусы размножаются на первичных культурах тканей, а диагностических препаратов также и на перевиваемых культурах.
Для размножения вирусов предложен ряд методов с использованием культур тканей. Такие методы, как Карреля-Берреуза (1910), культивирование кусочков ткани, фиксированных в сгустке плазмы, Меттлендов (1928) - культивирование в переживающих тканях - в настоящее время не используются не только в производстве, но и в исследовательской работе. Эти методы вытеснены культивированием в однослойной культуре клеток.
Работа по культивированию клеток производится в специальных лабораториях при соблюдении высоких требований к стерильности воздуха, посуды, растворов, питательных сред. Используемая посуда должна быть нейтральной, хорошо вымытой и обезжиренной, применяемые реактивы - химически чистыми.

Среды для выращивания вирусов. Клеточные субстраты в вирусологии.

В течение многих лет разрабатывались методы выращивания небольших количеств клеток животных в лабораторных условиях. Однако наладить массовое культивирование таких клеток оказалось не простой задачей. Способ выращивания, характер используемой среды, методы управления и контроля в значительной степени зависят от типа выращиваемых клеток. Все культивируемые клетки первоначально получают от животных путем механической или ферментативной дезагрегации нормальных или малигинизированных тканей либо с помощью перфузии in vivo.

Первичные культуры обычно получают трипсинизацией тканей куриных эмбрионов или тканей (чаще всего почек), взятых от других видов здоровых животных. Возраст используемых эмбрионов может значительно различаться и влиять на выход и жизнеспособность клеток. Для более полного контроля доноров ткани их следует брать из SPF-хозяйств.

Первичные культуры клеток почек зеленых мартышек обычно используют для приготовления полиовирусной вакцины. Поскольку обезьяны являются очень дорогим объектом для увеличения выхода клеток почки дезагрегируют методом перфузионной трипсинизации in vivo, а затем первичную культуру выращивают на микроносителях. Для изготовления других медицинских вакцин широко применяют первичную культуру клеток почки кроликов, телят и других животных. Для изготовления вакцин, используемых в ветеринарной медицине, чаще всего применяют первичные культуры клеток куриных эмбрионов и почек естественного хозяина или восприимчивых животных.

Первичные культуры в зависимости от типа ткани и условий выращивания значительно различаются. Некоторые из них погибают через несколько дней после посева, тогда как другие могут длительно сохраняться в культуре без заметных морфологических и биохимических изменений. С момента приготовления первичной культуры до остановки роста клеток и гибели культуры после серийных пересевов проходит от нескольких недель до нескольких месяцев. Клетки эмбрионального происхождения при культивировании обычно сохраняют жизнеспособность более продолжительное время.

Линия клеток - первичная культура, со времени получения субкультуры клеточные линии могут иметь ограниченный срок жизни in vitro (например, диплоидные фибробласты человека и животных), а могут размножаться in vitro неограниченно долго. В последнем случае их называют постоянными, стабильными или непрерывными клеточными линиями.

В связи с трудностями получения соответствующих количеств первичных культур клеток почки зеленой мартышки (по причине стоимости) и преимуществами использования предварительно изученных клеточных культур для производства вакцины против полиомиелита и других вакцин были лицензированы диплоидные линии клеток WI-38 и MRC-5. Существуют сомнения в том, что ростовые свойства и продуктивность диплоидных клеток варьируют. Даже хорошо охарактеризованные диплоидные линии клеток ведут себя неодинаково при работе с ними различных исследователей.

Штамм клеток — популяция однородных клеток (по одному или нескольким маркерам), сохраняющая специфические свойства в течение ограниченного периода культивирования. Штамм клеток может происходить из первичной культуры либо от линии клеток, получающих специфические свойства путем селекции или клонирования.

Линия гетероплоидных клеток. Этот термин означает, что клеточная линия имеет менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом. Этот термин не означает, что клетки являются злокачественными или способны расти до бесконечности.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

Развитие специфической профилактики инфекционных заболеваний человека и животных создало необходимость разработки методов массового получения вирусного сырья.

В течение многих лет заражение животных оставалось единственным методом культивирования вирусов, что служило серьезным препятствием для получения высококачественных вирусных вакцин и в достаточном количестве. До сих пор не удалось культивировать in vitro некоторые вирусы (папилломы человека и др.).

Использование куриных эмбрионов — важный шаг на пути разработки вирусных вакцин. В силу высокой производительности и отличного накопления некоторых вирусов этот метод не потерял своей актуальности. Его и сейчас с успехом применяют для изготовления вакцин против ряда заболеваний человека и животных.

Большое накопление некоторых вирусов в организме составляет серьезную конкуренцию методам их размножения в клеточных культурах. Это, прежде всего, относится к вирусу гепатита В, который накапливается в плазме крови человека в высоком титре (1012—1013 частиц/мл) и является прекрасным источником вирусного антигена для приготовления инактивированной вакцины.

Другим примером может служить вирус миелобластоза птиц, который при экспериментальном заражении цыплят накапливается в плазме крови в титре 5х10 12 вирусных частиц/мл и является хорошим источником препаративного получения ре-вертазы.

Значительные успехи в области выращивания вирусов животных вне организма прежде всего связаны с открытием возможности выращивания полиовируса в экстраневральных тканях (Эндерс и сотр., 1949) и усовершенствованием метода тканевых культур (Дульбекко и др., 1952). Этому в огромной степени способствовало также открытие антибиотиков и создание синтетических и полусинтетических питательных сред. Указанные достижения обеспечили возможность обновить методы получения ранее существовавших препаратов и создать новые эффективные вакцины против ряда вирусных болезней.

В производстве вирусных препаратов широкое применение нашли первичные культуры и линии клеток. Для приготовления живых и инактивированных вакцин человека, а также животных, часто используют вирус, выращенный в первичных культурах клеток животных. В последнее время инактивированные вакцины, предназначенные для вакцинации людей, все чаще готовят с использованием клеточных линий. Для некоторых вакцин, применяемых в животноводческой практике, вирус выращивают в культурах постоянных клеточных линий. Перспектива использования постоянных линий клеток особенно заманчива в плане крупномасштабного суспензионного культивирования.

Выбор метода получения вирусного сырья в каждом конкретном случае определяется специфическими требованиями, предъявляемыми к готовому препарату.

Получение большого количества вирусного сырья с выраженной антигенной активностью особенно необходимо для инактивированных вакцин. Изготовление некоторых из них, применяемых в животноводческой практике, достигло огромных масштабов. С точки зрения технологии крупномасштабного производства вирусных препаратов, метод культивирования вируса должен основываться на потреблении доступных, недорогих, максимально стандартизированных клеточных субстратов и питательных сред, обеспечивать достаточное накопление вируса или вирусного антигена и иметь высокую производительность.

В настоящее время разработаны и широко применяются методы производственного выращивания ряда вирусов человека и животных с целью изготовления вирусных препаратов. Однако, учитывая исключительную практическую важность исследований и разработок в этой области, они постоянно направлены на поиски новых принципов и технологических решений.