Что такое пцр диагностика инфекций у животных

Обновлено: 25.04.2024

Стадии ПЦР

Следует отметить, что для получения достоверного результата ПЦР-анализа необходимым условием является соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки клинического материала. Несмотря на то, что ПЦР является очень чувствительным методом, желательно наличие определенного количества возбудителя в пробе.

Взятие материала для ПЦР-исследования следует проводить в одноразовых неталькованных перчатках (так как тальк угнетает ПЦР). При взятии соскобов и смывов следует пользоваться одноразовыми стерильными зондами с повышенной адсорбцией (имеющими на конце щеточку), так как они отбирают оптимальное количество материала.

Соскобы и смывы со слизистых оболочек носа, ротовой полости, влагалища, конъюнктивы отбирают в одноразовые пластиковые микропробирки - эппендорфы - объемом 1,5 мл, в которые разлито по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Желательно не использовать зонды с ватными наконечниками. Следует также избегать отламывания кончика зонда в пробирку с физиологическим раствором, так как это затрудняет дальнейшую обработку и повышает риск перекрестной контаминации проб. Для получения необходимого количества материала достаточно вращать зонд в пробирке в течение 1-2 минут, избегая разбрызгивания жидкости. Проба должна быть мутной на вид, а при отстаивании в ней должен образовываться небольшой осадок.

Сперму отбирают в стерильные одноразовые пробирки или флаконы.

Моча. Отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не менее 20-40 мл в стерильный сухой флакон или пробирку.

Фекалии. Отбирают пробы массой 1-3 грамма из предварительно продезинфицированного и вымытого лотка, одноразовыми лопаточками переносят в стерильный флакон.

Кусочки пораженных органов от павших животных отбирают в стерильные одноразовые контейнеры или в чистые стеклянные или пластиковые емкости.

Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при Т минус 20°С.

Наиболее часто встречающимися заболеваниями у кошек и собак являются конъюнктивит, ринотрахеит, а также энтерит. Для того чтобы выяснить этиологию заболевания, требуется провести качественную лабораторную диагностику.

Причиной коньюнктивитов или инфекций верхнего респираторного тракта у кошек может быть инфицирование следующими микроорганизмами: герпесвирус типа 1 (FHV1), калицивирус кошек, Chlamediapcittaci. Mycoplasma felis, Bordetella bronchiseptica, Feline reovirus, Staphylococ-cuc aureus, Brohaemolytic streptococcic и Salmonella tephimurium.

Наиболее частой причиной, по данным различных авторов и методов исследования, являются герпес-вирус типа FHY1 (от 10% до 34%) и калицивирус кошек (от 20% до 53%). Chlamydia pcittaci (от 10% до 35%).

Герпесвирусная инфекция, ассоциирована абортами, высокой смертностью новорожденных (инфицирование почти 60% случаев) с признаками интерстициальной пневмонии.
Калицивирус - тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.

Панлейкопения - контагиозное вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 % заболевших котят).

Настоящим бичом для питомников является инфекционный перитонит кошек - тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус. Вирус реплицируется в миндалинах и энтероцитах тонкого кишечника, рассеиваясь по организму через макрофаги и моноциты. Коронавирусы с низкой вирулентностью вызывают энтериты средней тяжести, чаще всего у котят после отъема от матери. Высоковирулентный коронавирус может привести к развитию сухого или выпотного перитонита. Перитонит часто сопровождается почечной недостаточностью, печеночными и неврологическими симптомами.

При инфицировании аденовирусами обоих типов и вирусом чумы плотоядных у собак проявляется общий комплекс симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.

При чуме плотоядных клинические признаки могут включать серозно-слизистые назальные и конъюнктивальные выделения, кашель, одышку, пневмонию, рвоту и понос, а также лихорадку и гиперкератоз.

Аденовирус плотоядных. Возбудитель - ДНК-содержащий аденовирус плотоядных первого типа (вызывает инфекционный гепатит плотоядных) и второго типа (вызывает аденовироз собак). Наблюдаются лихорадка, апатия, анорексия, жажда, рвота и понос, болезненность брюшной стенки при пальпации. Иногда развиваются конъюнктивит, кератит, светобоязнь. Могут быть точечные кровоизлияния на слизистой оболочке и коже. Редко наблюдаются неврологические нарушения.

Все перечисленные заболевания имеют высокий индекс контагиозности и ассоциированы с высокой смертностью среди щенков, от парвовирусного энтерита погибает 10-50% заболевших щенков, при инфицировании не вакцинированных щенков вирусом чумы плотоядных смертность доходит до 100%.

Токсоплазмоз. Возбудитель - простейшее Toxoplasma gondii. Размножение возбудителя происходит у кошек на стенках кишечника. С калом они выделяют во внешнюю среду ооцисты.

Тканевые цисты могут вызывать анорексию, угнетение, кератиты, желтуху, рвоту, понос и неврологические симптомы в зависимости от пораженных органов. У собак клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, атаксия, паралич) или токсоплазмозный миозит (нарушение походки, атрофия мышц, ригидность), а также миокардит и гепатит.

Хламидиоз и орнитоз. Возбудители у кошек - Chlamydophila felts, у собак - Chlamydophila abortus, Ch. pecorum, у тех и у других заболевание может вызывать Ch. psittaci. У птиц - Ch. psittaci.
У кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается неонатальныи хламидиозный конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в патогенезе атеросклероза у собак.

Микоплазмоз. Возбудители - микроорганизмы рода Mycoplasma. Протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.

Вирусный иммунодефицит кошек. Иммунодефицит кошек - тяжелое заболевание, вызываемое вирусом из семейства Retrovoridae, рода Lentivirus. Вирус поражает иммунную и нервную системы. Обладает тропизмом к Т-лимфоцитам. В результате иммунодепрессии организм становится беззащитным против бактерий, грибов, вирусов и погибает от вторичной инфекции.
Клинические признаки развиваются медленно, и заболевание чаще регистрируется среди кошек 6-10 лет.

Встречаются у домашних животных и такие заболевания как: лептоспироз собак, листериоз кошек и собак, иерсиниоз щенков, бруцеллез, ротовирусный энтерит, бешенство.

Правильность постановки ПЦР-анализа и качественное выделение инфекции зависит, в первую очередь, от правильности взятия материала, во-вторых, от соблюдения температурного режима хранения и транспортирования проб. Поступившая в лабораторию проба регистрируется, проходит все стадии ПЦР, подвергается электрофоретической детекции с последующей выдачей конечного результата.

Таким образом, высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволяет гарантированно обнаруживать единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, что позволяет поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

И.М. Донник, член-корреспондент РАСХН, д.б.н., профессор, Н.А. Пелевина, м.н.с, О.Г. Бодрова, м.н.с,
ГНУ Уральский государственный научно-исследовательский ветеринарный нститут РАСХН

Метод ПЦР был разработан сравнительно недавно, но к настоящему времени успел занять передовые позиции как в медицинской, так и в ветеринарной лабораторной диагностике инфекционных и инвазионных заболеваний. Основные принципы ПЦР открыл в 1983 году американский химик Кэри Б. Мюллис, за что и был удостоен Нобелевской премии.

Рис. 1. Стадии ПЦР

Сперму отбирают в стерильные одноразовые пробирки или флаконы.

Давайте поговорим об одном из важнейших вопросов в диагностике инфекционных заболеваний у животных. На данную тему многое сказано и написано, но у владельцев и заводчиков до сих пор возникают вопросы и сложности. В настоящее время ИФА (иммуноферментный анализ) и ПЦР (полимеразная цепная реакция) являются наиболее достоверными методами диагностики инфекционных заболеваний у животных и человека. Основанные на последних достижениях молекулярной биологии, данные способы исследования быстро вошли в ветеринарную практику и, тем самым, значительно подняли общий уровень диагностики в целом. Каждый из этих методов позволяет оценить ситуацию с определенной стороны, в зависимости от цели, которая ставится при исследовании.

ИФА – это лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антител к различным возбудителям инфекций, а именно – антигенам. Также антигенами могут выступать собственные клетки организма, образующиеся в результате аутоиммунных или онкологических заболеваний. Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время составляет более 90% и позволяет обнаружить реакцию организма животного на инфекционный процесс.

Достоинства ИФА — возможность диагностики через 1-3 недели после контакта с возбудителем инфекции и возможность прослеживать динамику развития заболевания.

ИФА, относясь к непрямым методам диагностики, основан на выявлении не самой инфекции, а продуктов ее жизнедеятельности в организме животного — белков–маркеров – иммуноглобулинов, которые вырабатывает иммунная система в ответ на инфекцию. Для каждого возбудителя заболевания продуцируются сугубо индивидуальные антитела, которые впоследствии и будут идентифицированы системой ИФА. Время обнаружения антител зависит как от самой инфекции, так и от особенностей иммунной системы конкретного животного.

Наличие иммуноглобулинов не гарантирует присутствия в организме искомого инфекционного агента.

Отсутствие антител не говорит о том, что инфекции нет.

Если результат анализа методом ИФА положительный, то это значит, что нужно искать инфекцию более специфическими методами – ПЦР, бактериологические посевы.

Определить, какой лучше сдать анализ для диагностики, в каждой конкретной ситуации может только врач, назначающий обследование. Для комплексной оценки инфекции, в некоторых случаях, может потребоваться как выявление самого возбудителя (ПЦР), так и определение антител к нему в организме животного (ИФА), с последующим контролем после проведенного лечения.

Случается, что результаты ПЦР и ИФА-диагностики могут не совпадать и в этом случае необходимо грамотно интерпретировать полученные результаты, основываясь на патогенезе предполагаемого инфекционного заболевания.

Амплификатор BIO RAD T-100

Единственным ограничением продукции антител в организме при наличии инфекции может быть иммунодефицитное состояние у животного, например, при лейкозе или иммунодефиците у кошек.

Следует помнить, что антитела в организме могут образовываться в ответ на недавнюю вакцинацию и высокий их уровень, очевидно, может быть связан с искусственным введением антигена в организм животного.

Немаловажно то, что материал, взятый сразу после лечения инфекции, может содержать мертвые частицы микроорганизмов, которые метод ПЦР идентифицирует за счет своей высокой чувствительности. В таком случае, результат будет ложноположительный.

Другой пример: у кошек встречается несколько видов микроорганизмов рода Mycoplasma, чаще всего М. felis и М. gatae. Это частые обитатели слизистых оболочек, М. felis и М. gatae обнаруживаются у 70-80% здоровых кошек. Предполагается, что М. felis может быть патогенной, а М. gatae – естественный коммерсал конъюнктивы и верхних дыхательных путей кошек (то есть безвредная микрофлора). При проведении ПЦР–анализа результат может быть положительным, а ИФА – отрицательным, вследствие отсутствия специфической реакции организма на присутствующую условно-патогенную микрофлору, следовательно, возможное заболевание, например, конъюнктивы глаз было вызвано не данным микроорганизмом.

Ветеринарному врачу необходимо понимать патогенез того или иного заболевания, так коронавирусная инфекция кошек, вызываемая семейством Coronaviridae, а именно штаммами FIPV, подавляет иммунитет, и антитела к возбудителю могут и не обнаруживаться. Положительный результат ИФА говорит о наличии в организме коронавируса, но не дает информации о том, где этот вирус находится – в кишечнике или в тканях.

В связи с этим важным является непосредственное выявление возбудителя заболевания – ПЦР. Однако использование метода ПЦР не может позволить провести дифференциацию условно-патогенных и патогенных штаммов в организме и отличить состояние носительства от заболевания, вызывающего тяжелый перитонит, как правило, с летальным исходом. Положительный ответ ПЦР при выделении вируса с фекалиями говорит о том, что животное в данный момент представляет опасность для окружающих кошек. Согласно ряду исследований, некоторые кошки, в организме которых еще находится вирус, перестают распространять его в течение нескольких недель. Но есть вероятность длительного вирусоносительства, с повторяющимися периодами выделения вируса во внешнюю среду со слюной и фекальными массами.

Подводя итоги, можно сказать, что и ИФА, и ПЦР–анализы сами по себе не являются панацеей в диагностике инфекций. Нельзя одной ПЦР или ИФА–диагностикой заменить все существующие методы исследования, ими можно лишь дополнить их, позволив всем методам достигнуть реальных, точных, достоверных результатов.

Бактериальные и вирусные заболевания — одни из наиболее часто встречающихся заболеваний домашних животных. Это, например, пироплазмоз, лептоспироз, гепатит, чумка, герпесвирус, калицивироз, хламидиоз и др.

До настоящего времени диагностика таких заболеваний вызывала затруднения, поскольку существующие виды анализов из-за их малой доступности не нашли широкого применения в ветеринарии. Зачастую работа по диагностике и лечению вирусных и бактериальных инфекций строится на основании одних лишь симптомов заболевания и личного опыта врача. При этом нужно учитывать, что часто различные вирусы и бактерии могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. Разумеется, рассчитывать на высокую эффективность лечения при таких условиях невозможно. Но с появлением нового диагностического инструмента — анализа ПЦР — ситуация существенно изменилась! Теперь на основании данного анализа ветврач может точно определить заболевание и назначить эффективное лечение или скорректировать уже проводимое.

С октября 2016 г. ПЦР-диагностика вирусных и бактериальных заболеваний доступна в клиниках “Доктор Вет”!

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многих инфекций, который основывается на исследовании генетического материала животных (ДНК и РНК). Это один из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

ДОСТОИНСТВА МЕТОДА

Универсальность. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы.

Специфичность. При поиске определяется вид конкретного возбудителя. Кроме того в одном биологическом материале, возможен поиск нескольких возбудителей без ущерба для качества полученных данных.

Чувствительность. Результат будет получен даже при минимальном содержании возбудителя в материале, например, на начальной стадии заболевания или если заболевание не вылечено окончательно. А лечение болезни на раннем этапе значительно повышает эффективность и скорость выздоровления пациента, предотвращает риски осложнений.

Оперативность. Результат анализа готов уже через сутки.

Так как все инфекции собак и кошек можно разделить на несколько групп: системные, кровопаразитарные, офтальмологические, респираторные, дерматофитозные, половые, желудочно-кишечные, то и забор материала должен проводиться с соответствующих мест. Материалом для исследования может служить: кровь, слюна, мокрота, фекалии, соскобы и суспензии клещей.

Несмотря на вышеуказанные трудности ПЦР остается наиболее доступным и совершенным на сегодняшний день приемом диагностики.

КАКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОПРЕДЕЛЯЮТСЯ МЕТОДОМ ПЦР?

Герпесвирусная инфекция — приводит к абортам, высокой смертности новорожденных (инфицирование почти в 60% случаев).
Калицивирус — тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являются источником заражения, передавая вирус через слюну.
Панлейкопения — вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 %) заболевших котят.
4. Короновирусная инфекция — тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус.
Иммунодефицит кошек и лейкемия кошек — вирус поражает иммунную и нервную системы.
Аденовирус и чума плотоядных у собак проявляется комплексом симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта, поражение нервной системы.
Токсоплазмоз — промежуточными хозяевами могут быть кошка, собака, человек. Клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, паралич) или нарушения походки, атрофия мышц, а также миокардит и гепатит.
Хламидиоз — у кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в развитии атеросклероза у собак.
Микоплазмоз — протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов.
Пироплазмоз, анаплазмоз, боррелиоз — заболевания, переносимые клещами.

Все перечисленные заболевания очень коварны, так как легко и быстро передаются от больных животных здоровым (а также людям) и имеют высокий показатель смертности при отсутствии должного лечения.

ПЦР-метод позволяет гарантированно обнаруживать даже единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, благодаря чему врач может поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия.

Инфекционная патология в ветеринарии охватывает широкий круг болезней, различных как по характеру течения (острые, хронические, латентные), степени распространения (от спорадических случаев до эпизоотии), так и по сложности их диагностики. Важное, а при некоторых болезнях решающее значение имеют серологические исследования, направленные на выявление антител, вырабатываемых организмом животного в ответ на внедрение инфекционного агента или вакцины. Несмотря на ряд достоинств, методы, основанные на этом принципе, обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью. Существенный прорыв был сделан в последние годы, когда для диагностических целей привлекли методы генной инженерии и биотехнологии. Одним из наиболее применяемых способов для диагностики инфекционных заболеваний стала полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод прямой и позволяет достичь предельно возможной чувствительности: от одного до нескольких возбудителей в пробе. Количество исследуемого материала, как правило, составляет несколько десятков микролитов. Высокая чувствительность метода позволяет контролировать эффективность проводимого лечения. ПЦР успешно используется при диагностике труднокультивируемых и некультивируемых возбудителей, а также хронических, латентных и персистентных форм инфекции. Длительность анализа не превышает 5-6 часов.

Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач.

Но наряду с достоинствами имеется определённый недостаток, который можно охарактеризовать как технологический. Подразумеваются повышенные требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории.

Ветеринарными специалистами уже разработаны тест-системы для диагностики методом ПЦР таких заболеваний, как туберкулёз, сибирская язва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных, классическая чума свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней, сальмонеллёз, стафилококкоз, микоплазмоз, болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, инфекционный бронхит птиц, ньюкаслская болезнь; чума плотоядных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят и др.

Читайте также: